Doctoral Thesis
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Charakterisierung des Replikationsenzyms ORF904 aus Sulfolobus islandicus
(2010)
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Martin Sanchez
- ORF904 ist ein multifunktionelles Enzym, welches durch das kryptische Plasmid pRN1 codiert wird. Das Protein besitzt eine C-terminale Primase/Polymerasedomäne und eine N-terminale ATPase/Helikasedomäne. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die molekulare Funktion der N-terminalen Domäne genauer untersucht. Sequenzanalysen der Helikasedomäne ermöglichten ORF904 als eine Superfamilie-3-Helikase zu klassifizieren und für die ATPase- und Translokationsaktivität relevante Sequenzmotive zu identifizieren. Darüber hinaus konnte zusätzlich eine Winged-Helix-DNA-Bindedomäne am C-Terminus der Helikasedomäne identifiziert werden. An Hand von CD-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Deletionsmutanten von ORF904 strukturiert vorlagen. Die thermische Denaturierung der Mutanten unterstreicht den thermophilen Charakter des Proteins (TM= 85-100°C). Der endgültige Nachweis der Hexamerisierung des Proteins in Gegenwart von dsDNA und AMP-PnP wurde mit der Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie erbracht. Es war bereits bekannt, dass die ATPase-Aktivität von ORF904 durch RNA gar nicht und durch ssDNA nur schwach stimuliert wird. Eine spezifische Zunahme der ATPase-Aktivität in Gegenwart von pRN1 konnte nicht beobachtet werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass dsDNA die ATPase-Aktivität um den Faktor 7 erhöht. Eine Bevorzugung der längeren Plasmid-DNA unter limitierenden Bedingungen konnte nicht beobachtet werden, weswegen von einer geringen Prozessivität der Helikase auszugehen ist. Die Wechselzahl und der KM für ATP konnten zu 0,7/s und 0,4 mM bestimmt werden. Die ATPase-Aktivität der Deletionsmutanten von ORF904 gaben Hinweise auf die Wichtigkeit der Region direkt N-terminal vor dem Helikasekernbereich. Es wird angenommen, dass diese Region für die Hexamerisierung des Proteins von Bedeutung ist. Die Analyse der Punktmutanten von ORF904 in den konservierten Bereichen erlaubten es R690 als den Argininfinger zu identifiziert. Der potentielle Lysinfinger K574 konnte nicht als solcher identifiziert werden. Wie zu erwarten war, zeigten die Mutanten des beta-Hairpins eine vernachlässigbare Abnahme in Gegenwart von dsDNA. Translokationsexperimente mit einem Biotin-Streptavidin-Verdrängungsversuch ermöglichten es, für die Helikase eine durch ATP induzierbare Translokation mit 3-5-Polarität auf ssDNA nachzuweisen. Dabei konnte K657 als das Lysin im beta-Hairpin identifiziert werden, welches vermutlich den direkten Kontakt zur DNA herstellt. Die Translokationsrate von ORF904 wurde zu etwa 6,2x10^-4 b/s bestimmt. Zusammen mit den Ergebnissen der Prozessivität ist anzunehmen, dass es sich bei OF904 nicht um eine prozessive Helikase handelt. Vielmehr scheint ORF904 am Aufschmelzen des Replikationsursprungs beteiligt zu sein. In der Vergangenheit konnte keine Entwindung von komplett doppelsträngigen Helikasesubstraten oder Substraten mit 5- oder 3-Überhang auf der Basis von M13-DNA oder Oligodesoxynukleotiden gezeigt werden. Es konnte jedoch eine ATP-abhängige Entwindung für ein kurzes DNA-Substrat mit 3- und 5-Überhang, ein Doppelstrangsubstrat mit internem 5-Überhang, eine Holliday-Struktur sowie eine Triple-Helix gezeigt werden. Mittels der letzten drei Substrate wurde auch die Translokation auf dsDNA nachgewiesen. Die Entwindungsraten für die Helikase liegen abhängig vom Substrat zwischen 1,0 und 7,2x10^-4 bp/s. Die Ergebnisse der Entwindungsexperimente untermauern nochmals die Ergebnisse der Translokationsexperimente. DNA-Bindungsexperimente auf der Basis von Fluoreszenzanisotropiemessungen bestätigten die DNA-Bindung der carboxyterminalen DNA-Bindedomäne und der Helikasedomäne, die in Gegenwart von ATP zunahm. Darüber hinaus scheint es, dass die Prim/Pol-Domäne in der Lage ist, die Helikasedomäne in Gegenwart von ATP und Abwesenheit des GTG-Bindemotivs zu maskieren, um so unter Umständen eine unspezifische DNA-Bindung zu erschweren. In Gegenwart des GTG-Bindemotivs bindet die Prim/Pol-Domäne ssDNA sowie dsDNA stärker. Dieser Effekt wird für ssDNA durch ATP weiter verstärkt. Möglicherweise unterstützt die Prim/Pol-Domäne die DNA-Bindung der Helikase bei Vorliegen des GTG-Bindemotivs im Bereich des Replikationsursprungs. Um den Replikationsursprung zu bestimmen, wurden mit einem für die Replikation essentiellen Sequenzabschnitt stromabwärts von orf904 Footprint-Analysen durchgeführt. Diese erlaubten es, Nukleotide in einer Region 60 bis 90 Nukleotide stromabwärts von orf904 zu identifizieren, die durch die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne scheinbar geschützt werden. Interessanterweise befindet sich in diesem Bereich auch ein GTG-Motiv, das als Erkennungssequenz für die Prim/Pol-Domäne dienen könnte, um die Bindung des Proteins an den vermeintlichen Replikationsursprung zu verstärken. Im Ganzen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne zusammen mit der Helikasedomäne den Replikationsursprung während der Replikationsinitiation erkennt.
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Regulated intramembrane proteolysis in the control of the Bacillus subtilis anti-sigma factor RsiW.
(2010)
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Janine Heinrich
- The activity of the extracytoplasmic function (ECF)-sigma factor SigW of the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis is modulated by a specific membrane-bound anti-sigma factor (RsiW). Initiated most likely by cell wall stress, RsiW is degraded by the mechanism of regulated intramembrane proteolysis (RIP). This process involves two site-specific proteolytic cleavage events in the extracytoplasmic part (site-1) and in the transmembrane domain (site-2) of RsiW. In consequence, SigW is released to interact with the RNApolymerase, and the transcription of SigW-controlled genes is initiated. In general, regulation of differential gene expression by RIP seems to play a major role in prokaryotic stress responses, pathogenesis and antibiosis. However, in most cases the molecular basis is not understood. The main objective of this work was to use B. subtilis SigW/ RsiW as a model to investigate the mechanism of RIP in detail. In particular, there are significant differences to the inducing stress-signal and the site-1 protease that are described for the well investigated Escherichia coli ECF sigma factor SigE-system. The basis of this work were different mutants with a defect in RIP of RsiW that were isolated in a transposon screen. First, PrsW (formerly YpdC) was identified as the site-1 protease. It belongs to a superfamily of potential membrane embedded metalloproteases (MEM) with so far unknown function in bacteria. Further characterization of PrsW in a reconstituted E. coli system showed that PrsW cleaves RsiW in a site-specific manner to form a protein truncated for 40 C-terminal extracytoplasmic amino acid residues. The tail specific protease Tsp was shown to further degrade the extracytoplasmic part of this RsiW site-1 cleavage product, which is crucial for subsequent RasP catalyzed site-2 clipping. Several other peptidases seem to be involved in trimming of RsiW downstream of PrsW and upstream of RasP in B. subtilis. Second, the transposon screen revealed that a defect of the ABC-transporter EcsAB impairs RsiW site-2 cleavage by RasP for unknown reasons. It is conceivable that an EcsAB substrate competitively inhibits RasP activity. In summary, a new model of two proteolytic modules involved in intramembrane proteolysis of RsiW could be established. Each module consists of a site-specific processing peptidase (site-1: PrsW, site-2: RasP) that subjects cleaved RsiW to degradation by unspecific proteases (site-1: Tsp-like, site-2: Clp-proteases).
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Surfaces Isogenous to a Product: Their Automorphisms and Degenerations
(2010)
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Wenfei Liu
- In this thesis, I consider the automorphisms and stable degenerations of surfaces isogenous to a product. First I consider the action of the automorphisms on cohomology in the case where the group G is abelian. It is shown that, if the irregularity of the surface is larger than 1, the action of G on the second cohomology is mostly faithful. For surfaces with irregularity 0 or 1, examples are given. Then I consider the stable degenerations of surfaces isogenous to a product and classify the possible singularities on them. As a result, I show that the Q-Gorenstein deformations of the degenerations with certain singuarities are unobstructed and get some connected components of the moduli space of stable surfaces.
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Molekulare und physiologische Charakterisierung des Energiestoffwechsels von Nitrosomonas europaea
(2010)
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Stefan Gilch
- Die lösliche Ammoniak-Monooxygenase (AMO) aus Nitrosomonas europaea ist in ungefähr der gleichen Menge wie die membrangebundene AMO vorhanden. Beide Formen sind in vivo aktiv und besitzen eine ähnliche spezifische Aktivität. Die lösliche AMO ist ein Cu-, Fe- und möglicherweise auch Zn-haltiges Enzym und besteht aus den Untereinheiten AmoA (27 kDa), AmoB (42 kDa) und Cytochrom c1 (24 kDa). Das Enzym weist dabei eine heterotrimere Alpha3-Beta3-Gamma3-Untereinheitenstrukur mit einer molekularen Masse von etwa 316 kDa auf. Die AmoB-Untereinheit der löslichen AMO besitzt dabei eine Signalsequenz von 25 Aminosäuren. Die An- beziehungsweise Abwesenheit des Signalpeptides könnte die Konformation der AMO so weitreichend beeinflussen, dass daraus sowohl ein löslicher als auch ein membrangebundener AMO-Komplex resultiert. Das gereinigte Enzym koordiniert in vitro 9,5 Cu-, 3,9 Fe- und 0,45 bis 2,6 Zn-Atome. Nach Reduktion der löslichen AMO werden im Absorptionsspektrum die für Cytochrome des c-Typs charakteristischen Absorptionsbanden ersichtlich. Elektronspinresonanz-Spektren von luftoxidierter löslicher AMO bei einer Temperatur von 50 K weisen auf die Existenz von ein oder mehreren Typ-2-Cu(II)-Zentren hin. Bei einer Temperatur von 10 K wird sowohl ein für Häm-gebundenes Eisen als auch ein für nicht Häm-gebundenes Eisen charakteristisches Signal ersichtlich. Durch Vergleich der Cu(II)-Konzentration mit dem Gesamtgehalt an Cu konnte ermittelt werden, dass die lösliche AMO etwa sechs paramagnetische Cu(II)-Atome und drei diamagnetische Cu(I)-Atome koordiniert. Der substratanaloge kompetitive Hemmstoff Acetylen wird von der löslichen AMO zu einem Keten oxidiert. Dieses reaktive Intermediat bindet in der Folge kovalent an His 191 (AmoA). Die Bindung von Keten setzt dabei ein Cu(I)-Atom pro AmoA-Untereinheit frei und führt somit zu einer irreversiblen Hemmung der AMO. His 191 aus AmoA ist dementsprechend an der Koordination eines Cu(I)-Zentrums beteiligt welches die Oxidation von Ammoniak katalysiert. Die lösliche AMO katalysiert die Disproportionierung von Hydroxylamin zu Ammoniak, Nitrit und Nitrat nach folgender Reaktionsgleichung: 3,2 NH2OH + 2 NH3 + 0,8 NO3– --> 0,4 NO2– + 3,6 H+ + 2,4 e– Die Reaktion besitzt das Temperaturoptimum zwischen 45 und 50 °C, das pH-Optimum bei einem pH-Wert von 8,5 und wird weder von Licht noch von Sauerstoff beeinflusst. Die maximale spezifische Aktivität der Disproportionierung liegt bei etwa 1.000 nmol NH2OH (mg AMO)-1 min-1 und der Km-Wert für Hydroxylamin beläuft sich auf ungefähr 140 µM. Acetylen besitzt keinen Einfluss auf die Aktivität der Disproportionierung, jedoch wirkt Hydrazin als kompetitiver Hemmstoff für die Umsetzung von Hydroxylamin durch die lösliche AMO. Eine Disproportionierung von Hydroxylamin konnte auch bei intakten Nitrosomonas-Zellen beobachtet werden, welche so einer Akkumulation von Hydroxylamin entgegenwirken. Es ist denkbar, dass die Disproportionierung von Hydroxylamin einen Mechanismus darstellt, mittels dessen sich N. europaea vor toxischen Hydroxylaminkonzentrationen schützt und dabei gleichzeitig ihr Substrat Ammoniak zurückgewinnt. Weiterhin gelang es im Zuge dieser Arbeit die Existenz eines funktionellen Ammoniaktransporters vom Rhesus-Typ (Rh1) in N. europaea zu beweisen. Der passive Rh1-Transporter ermöglicht sowohl die Aufnahme von Ammoniak als auch von Methylammonium (MA) in das Cytoplasma von N. europaea. Die Menge an transportiertem MA korreliert dabei mit der Expression von Rh1. Der Km-Wert für MA beträgt dabei 1,8 mM bei einem pH-Wert von 7,25. Die Aufnahme von MA konnte vollständig durch Ammonium gehemmt werden [Ki(NH4+) = 0,3 mM]. Ein niedriger periplasmatischer pH-Wert (pH 5 - 6) während der Ammoniakoxidation scheint eine Akkumulation von Ammonium im Periplasma zu bewirken („Säurefalle“) und Rh1 ermöglicht in der Folge einen raschen Konzentrationsausgleich von NH3 mit dem Cytoplasma. In aerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen korrelieren die spezifische Aktivitäten der Ammoniakoxidation, der Reduktion von Nitrit, als auch die Wachstumsrate mit den Transkriptionsintensitäten der zugehörigen Gene amoA/hao/rh1, nirK/norB und cbbL/ftsZ. Die Konzentration von amoA-, hao-, rh1-, coxA-, cbbL, ftsZ- und sodB-mRNA in anaerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen war im Bezug auf aerob Ammoniak-oxidierende Nitrosomonas-Zellen reduziert, die Konzentration an nirK- and norB-Transkript dagegen aber erhöht. Während anaerober Denitrifikation (Pyruvat dient als Substrat) stieg die Transkription der Gene nirK, norB, aceE, gltA, und odhA deutlich an. Die Konzentrationen von amoA-, hao-, rh1-, coxA-, cbbL-, ftsZ- und sodB-mRNA war im Vergleich zu aerob und anaerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen allerdings signifikant erniedrigt.
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Bogoliubov Excitations of Inhomogeneous Bose-Einstein Condensates
(2010)
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Christopher Gaul
- In this thesis, different aspects of interacting ultracold bosons in presence of inhomogeneous external potentials are studied. The first part deals with repulsively interacting Bose-Einstein condensates in speckle disorder potentials. In the Bogoliubov approach, the many-body problem is split into the Gross-Pitaevskii condensate (mean-field) and the Bogoliubov excitations, which are bosonic quasiparticles. The disorder potential causes an imprint in the condensate, which makes the Hamiltonian for the Bogoliubov excitations inhomogeneous. The inhomogeneous Bogoliubov Hamiltonian is the starting point for a diagrammatic perturbation theory that leads to the renormalized Bogoliubov dispersion relation. From this effective dispersion relation, physical quantities are derived, e.g. the mean free path and disorder corrections to the speed of sound and the density of states. The analytical results are supported by a numerical integration of the Gross-Pitaevskii equation and by an exact diagonalization of the disordered Bogoliubov problem. In the second part, Bloch oscillations of Bose-Einstein condensates in presence of time-dependent interactions are considered. In general, the interaction leads to dephasing and destroys the Bloch oscillation. Feshbach resonances allow the atom-atom interaction to be manipulated as function of time. In particular, modulations around zero are considered. Different modulations lead to very different behavior: either the wave packet evolves periodically with time or it decays rapidly. The former is explained by a periodic time-reversal argument. The decay in the other cases can be described by a dynamical instability with respect to small perturbations, which are similar to the Bogoliubov excitations in the first part.
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Foamy Virus Enzymes - Activity, Regulation and Resistance
(2010)
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Maximilian Hartl
- Foamy viruses or spumaretroviruses belong to the family of retroviridae but differ in several aspects from other retroviruses (orthoretroviruses). Viral particles contain DNA not RNA. The Pol protein, the precursor of the viral enzymes, is translated from a separate mRNA independently of the capsid and matrix proteins. The protease remains covalently bound to the reverse transcriptase, while in orthoretroviruses the protease is cleaved off autocatalytically. Thus, in mature spumaretroviruses a protease-reverse transcriptase protein (PR-RT) with three different catalytic activities is found: proteolysis, DNA polymerization and RNase H activity. In this work, the recombinant PR-RTs from the prototype foamy virus and a simian foamy virus isolate from macaques were purified and compared. The biophysical and enzymatic properties of the two enzymes were similar. However, their behavior towards the nucleoside inhibitor azidothymidine is different. This nucleoside analog inhibits the replication of foamy viruses by terminating polymerization. Prototype foamy virus was not able to develop resistance against azidothymidine, but we succeeded in the generation of an azidothymidine-resistant simian foamy virus. Up to four mutations within the reverse transcriptase were found to be necessary to confer high resistance against azidothymidine. To characterize the mechanism of resistance, the corresponding recombinant PR-RTs were investigated in vitro. The data reveal that the azidothymidine resistance is based on the excision of the incorporated inhibitor in the presence of ATP. Retroviral proteases are only active as homodimers. In this work, analysis of the PR-RT of prototype foamy virus and simian foamy virus isolated from macaques by analytical ultracentrifugation and size exclusion chromatography indicate, that foamy virus proteases are stable and inactive monomers in solution. The three-dimensional structure of the simian foamy virus protease domain was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy and revealed the typical folding of a monomer subunit of retroviral proteases. Furthermore, nuclear magnetic resonance analysis by paramagnetic relaxation enhancement suggested the formation of transient protease homodimers under native conditions. Finally, it is shown that polypurine rich sequences of the foamy virus RNA are able to activate protease activity. Chemical analysis of the secondary structure of these RNA sequences indicated a characteristic hairpin loop structure. Retardation and protein crosslinking experiments prove the formation of stable PR-RT dimers in the presence of the polypurine RNA sequences. Based on these in vitro data we propose a model for foamy virus assembly.
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The Aptian evolution of the Galve sub-basin (Maestrat Basin; E Iberia)
(2010)
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Telm Bover-Arnal
- The epeiric mixed carbonate-siliciclastic sedimentary succession of Aptian stage (125-112 Ma) cropping out in the Galve sub-basin (western Maestrat Basin) in the eastern Iberian Chain (E Iberia) was analyzed by multiscale and multidisciplinary approaches. The integrated basin analysis presented in this thesis highlights the interplay between the solid Earth, oceans, atmosphere and life during this time interval, marked by higher CO2 atmospheric concentrations than nowadays and, consequently, by extreme climatic warmth and higher global sea levels. The most noteworthy aspect of this sedimentary succession is that its analysis enables all major ocean-climate changes which occurred during this stage to be tracked, and it therefore constitutes an excellent means of measuring this time slice. The Aptian strata studied can be divided into four large-scale transgressive-regressive sequences, which were calibrated by geomagnetic polarity analysis and ammonoid and rudist biostratigraphic data. These sequences are consistent with the major transgressions and sea level falls recorded in other coeval Tethyan localities, indicating a significant eustatic control of the sedimentary succession, although synrift subsidence was the most important mechanism in providing accommodation. The main oceanographic and climate-driven Tethyan events detected were: 1) An Early Aptian transgressive phase accompanied by the widespread development of Palorbitolina lenticularis beds. 2) The δ13C perturbations related to the OAE1a have been localized in the upper part of the Deshayesites forbesi biozone within a horizon of coral rubble deposits encrusted by Lithocodium aggregatum and Bacinella irregularis, coincident with the probable Early Aptian thermal maximum. These encrusted coral rubble levels with widespread presence of large-sized flattened Palorbitolina lenticularis are interpreted here as records of physical and chemical disturbances linked to the OAE1a. 3) A late Early Aptian long-term progressive cooling trend accompanied by a regressive context marked by the establishment of large carbonate platforms with typical Urgonian biotic associations dominated by rudist bivalves and corals. 4) The maximum of the aforementioned regressive phase, which exposed subaerially the carbonate platform formed during the late Early Aptian. As a result, a broad palaeokarst developed in its proximal setting, whilst forced regressive wedges were deposited basinwards. This late Early Aptian stratigraphic interval constitutes a text-book example of the application of the four-systems-tract sequence stratigraphic methodology to carbonate systems. 5) A late Early to Late Aptian long-term regressive context, which gave rise to the establishment of littoral conditions during the Late Aptian. The installation of more proximal conditions in this area was coupled with significant terrigenous supplies, which were probably linked to regional tectonics and to a progressively changing climate from a semi-arid regime during the Early Aptian, to semi-humid conditions in the Middle-Late Aptian. Consequently, this study represents a well-documented example of the evolution of the Aptian epicontinental seas, and hence constitutes a valuable tool for calibrating analyses of other Aptian epeiric sedimentary successions.
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Cosserat Operators of Higher Order and Applications
(2010)
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Thorsten Riedl
- We take a look at certain operators called Cosserat operators and get a compactness result for them leading to several interesting applications. For a more detailed abstract, see the actual abstract at the beginning of the work.
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Der Einfluss der Ketten- und der Persistenzlänge auf den Soret-Effekt in verdünnten Polymerlösungen
(2010)
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Dominik Stadelmaier
- In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Kettenlänge und -steifheit auf den Soret-Effekt in verdünnten Polymerlösungen untersucht. Dazu wurden die Transportkoeffizienten Soret-Koeffizient, Thermodiffusionskoeffizient und Diffusionskoeffizient D an Polymerlösungen im Grenzfall unendlicher Verdünnung bei einer Temperatur von 22 °C bestimmt. Bei den untersuchten Polymeren handelt es sich um Polystyrol (PS), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA) und Poly-t-butylmethacrylat (PtBMA). Zudem wurden die linearen Alkane Hexan, Oktan, Dekan, Dodekan, Pentadekan, Hexadekan und Eicosan gemessen, die alle als Oligomere des Polymers Polyethylen (PE) betrachtet werden können. Als Lösungsmittel wurden Chloroform, Cyclohexan, Cyclohexanon, Cyclooktan, Ethylacetat, Ethylbenzol, Methyl-Ethyl-Keton (MEK), Tetrahydrofuran (THF) und Toluol verwendet. Zur Untersuchung des Einflusses der Kettenlänge auf den Soret-Effekt wurden Experimente an PS-Oligomeren in einem Molmassenbereich von 10 kg/mol bis hin zum effektiven Monomer Ethylbenzol sowie an den genannten linearen Alkanen durchgeführt. Der Einfluss der Persistenzlänge wurde durch Messungen an hochpolymeren Lösungen der Polymere PDMS, PMMA und PtBMA untersucht, wobei zusätzlich die auf unendlich große Molmassen extrapolierten Werte der n-Alkane herangezogen wurden. Bei den Untersuchungen der PS-Oligomere wurde in dieser Arbeit festgestellt, dass bei großen Polymermassen die Lösungsmittelviskosität der dominierende und einzig signifikante Parameter des Lösungsmittels für Thermodiffusion wird und dass das Produkt eta D_T einen gemeinsamen Plateau-Wert erreicht. Bei kürzeren Ketten nehmen die Thermodiffusionskoeffizienten ab, zudem liegen die Datenpunkte für verschiedene Lösungsmittel nicht mehr auf einer gemeinsamen Kurve. In einigen Fällen wird sogar ein Vorzeichenwechsel des Soret-Koeffizienten beobachtet. Ein Vergleich der Ergebnisse zweier effektiver Monomere, die sich nur bezüglich ihrer Endgruppe unterscheiden, zeigt, dass die Abnahme des Thermodiffusionskoeffizienten bei Verkürzung der Kettenlänge nicht auf einen Endgruppeneffekt zurückzuführen ist. Auch die früher in der Literatur zu findende Annahme, dass die Molmassenunabhängigkeit bei großen Massen eine Monomereigenschaft des Polymers ist, wird durch diese Beobachtung nicht gestützt. Die für Thermodiffusion relevanten Einheiten sind stattdessen korrelierte Segmente mit einer dem Kuhnschen Segment vergleichbaren Größe. Der Soret-Koeffizient steigt bei kurzen Ketten mit zunehmender Masse monoton an. Ein Wechsel des Lösungsmittels führt zu einer nahezu konstanten Verschiebung, unabhängig von der Molmasse. Für lange Polymerketten wird der hydrodynamische Radius die dominierende Eigenschaft für den Soret-Koeffizienten. Die Messungen der linearen Alkane ergänzen die für PS entwickelte Beschreibung durch Hinzunahme eines Polymers mit signifikant kürzerem korrelierten Segment. Auch für das Polymer PE verhalten sich sehr kurze Oligomere wie kleine Moleküle, d.h. es existieren keine einfachen Regeln zur Vorhersage des thermophoretischen Verhaltens. Anders als bei PS besitzen alle gemessenen Alkanlösungen negative Thermodiffusionskoeffizienten. Der molmassenunabhängige Bereich ist messtechnisch nicht zugänglich, da längere PE-Ketten bei Raumtemperatur in praktisch allen Lösungsmitteln unlöslich sind. Eine Extrapolation der Messdaten auf unendlich große Molmassen ergibt, anders als bei PS, molmassenabhängige Plateaus für das Produkt eta D_T. Die Untersuchungen der hochpolymeren Polymerlösungen von PDMS, PMMA und PtBMA erweitern das empirische Modell um den Einfluss unterschiedlicher Persistenzlängen auf den Soret-Effekt. Bei hinreichend großen Einheiten, die der Thermodiffusion unterliegen, ergeben sich lösungsmittelunabhängige Plateau-Werte für eta D_T. Darüber hinaus wird der Thermodiffusionskoeffizient unabhängig von der chemischen Natur der Polymere. Voraussetzung dafür ist offenbar, dass die Masse der korrelierten Segmente um mindestens eine Größenordnung über der Masse des Lösungsmittels liegt. Für sehr flexible Polymere hingegen werden niedrigere Werte für eta D_T erreicht und die Plateau-Werte bleiben lösungsmittelabhängig. Auch negative Thermodiffusionskoeffizienten treten auf. Eine Extrapolation der konzentrationsabhängig gemessenen Thermodiffusionskoeffizienten von Literaturdaten zeigt, dass die meisten kleineren Moleküle den für Polymere typischen Plateau-Wert nicht erreichen. Eine mögliche Schlussfolgerung daraus ist, dass die hier formulierte empirische Beschreibung nicht nur für korrelierte Segmente innerhalb einer Polymerkette, sondern auch für Einzelmoleküle gültig ist. Allerdings existieren auch Systeme, bei denen Abweichungen von den genannten Gesetzmäßigkeiten auftreten.
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Control of the release of digestive enzymes in the cricket Gryllus bimaculatus and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda
(2010)
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Digali Lwalaba
- This thesis investigates control of the release of digestive enzymes in the cricket Gryllus bimaculatus and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. 1. Control of enzyme release in the cricket G. bimaculatus. Using flat-sheet preparations of the caecum, digestive enzyme release was investigated. More trypsin, aminopeptidase and amylase are secreted in the caecum of fed crickets than in unfed crickets, but basal levels of certain enzymes are released continuously even in unfed animals. A variable ratio of nutrients in ingested food leads to a different ratio of digestive enzyme release, but a high nutrient component in the food does not necessarily induce a high digestive enzyme release for that component. Maltose and glucose elevate amylase release from the tissues into the incubation medium, but starch does not. Bovine serum albumin (BSA), peptone and a mixture of amino acids have almost no effect on the release of aminopeptidase, and only low concentrations of peptone increase trypsin release. In crickets, the continuous release of proteases is sufficient to meet the needs for growth, and only moderate stimulation of trypsin results from feeding. Carbohydrates are used for energy, and the release of amylase is adjusted to the amount of food ingested. The neuropeptide allatostatin Grybi-AS 5 elevates the release of amylase in fed females, but not of trypsin or aminopeptidase, however, both amylase and trypsin release are stimulated by AS 5 in unfed crickets. Fed crickets have sufficient trypsin to obtain needed amino acids, but unfed do not, therefore the AS stimulation of trypsin release in unfed crickets makes sense. 2. Control of enzyme release in the larvae of S. frugiperda. A flat-sheet preparation of the ventriculus was used to test the release of amylase, trypsin and aminopeptidase in response to specific nutrients in the food and to specific neuropeptides. The epithelial secretion rate of amylase and trypsin was about 20% of the amount of enzyme present in the ventricular lumen, which, considering the efficient counter-current recycling of enzymes, suggests that the secretion rate is adequate to replace egested enzymes. Dietary carbohydrates are used for energy, and larvae adjust amylase activity to carbohydrate ingestion. Amylase activity is 5-times higher in fed compared to unfed larvae, and sugars in the incubation medium induces more than a 300 % increase in amylase release. Plants contain a low level of protein, but larvae need proteins for growth, thus the larvae can not afford to lose proteins by egestion. Therefore, trypsin activity remains high even in unfed larvae. As a result, proteins and amino acids have little or no effect on trypsin or aminopeptidase release in incubated tissues. The control of enzymes release in response to food is most likely mediated through neurohormones. Indeed, an allatostatin (Spofr-AS A5) inhibits amylase and trypsin release, and allatotropin (Manse- AT) stimulates amylase and trypsin release. Spofr-AS A5 also inhibits ileum myoactivity and Manse- AT stimulates myoactivity. 3. Inhibition of enzyme release in the larvae of S. frugiperda. Exogenous inhibitors are produced by plants, and are ingested by the insect. Endogenous inhibitors are produced by the gut epithelial cells themselves. A dose-dependent inhibition of endogenous enzymes occur in the lumen after feeding L6 larvae with the exogenous serine protease inhibitor from soybean (SBTI), the specific trypsin inhibitor TLCK, an aminopeptidase inhibitor (bestatin), and an amylase inhibitor from wheat. Inhibition in tissue extracts is seen only with higher doses of SBTI and TLCK. Inhibition of enzyme release into the incubation medium is apparent only with very high doses of SBTI. Inhibition in the tissues and inhibition of release indicate a direct cellular response to an inhibitor present in the lumen. The elevation of aminopeptidase activity in response to ingested trypsin inhibitors indicates a cellular synthesis in response to the product of a digestive enzyme. The enzymes investigated are irreversibly inactivated by 10 min at 90°C, but the corresponding inhibitors are not, therefore endogenous inhibitors could be identified. Endogenous inhibitors are present in the ventricular cells and in the lumen. We suggest that the endogenous protease inhibitors may protect the epithelium by inactivation of the trypsin in underfed larvae. This is the first explanation of how insects are able to secrete an active trypsin.
