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Regulation of Progression through Unperturbed Mitosis and in the Presence of Environmental Stress (2007)

Rahul Pandey

During mitosis, the replicated genome is distributed onto two daughter cells. Perfect regulation of progression through mitosis is essential for an error-free segregation and propagation of the genome. Surveillance pathways like the mitotic spindle checkpoint have evolved to prevent mitotic defects effectively. The molecular basis of these regulatory mechanisms is particularly well understood in budding yeast. It is not entirely clear to what extent these findings are valid for other eukaryotes as well. Therefore, in a first part, I have addressed the function of Drosophila Separase, a protease which has been implicated in several regulatory processes in budding yeast. Although an essential role of this protease for sister chromatid separation has been demonstrated in a wide range of eukaryotes, its involvement in additional processes still remains controversial. In budding yeast, separase promotes rapid exit from mitosis in a dedicated regulatory network known as FEAR. In Drosophila, a FEAR-like role could not be confirmed. Similarly, an essential involvement in the duplication of centrosomes, which form the poles of mitotic spindles in metazoan cells and are highly divergent from the functionally equivalent fungal spindle pole bodies, could not be demonstrated. In a second part I have analyzed the importance of surveillance mechanisms (in particular the mitotic spindle checkpoint) for progression through mitosis in the presence of environmental stress like anoxia and hypothermia. So far, the interaction of environmental stress with mitotic regulation has been largely neglected. However, oxygen deprivation leads to a rapid and reversible mitotic arrest. Here, anoxia is shown to have rapid effects on spindle and kinetochore function which are proposed to cause the observed efficient activation of the mitotic spindle checkpoint. Moreover, the consequences of anoxia were found to be very similar to those caused by inhibitors of oxidative phosphorylation. This suggests that the reduction in ATP levels is responsible for metaphase arrest in anoxia. Interestingly, the mitotic spindle checkpoint was also found to be important for survival in hypothermia, and the early syncytial stages which are characterized by an extremely rapid progression through mitotic cycles, were found to be the most cold-sensitive stages of Drosophila embryogenesis.

Esterase 2-oligodeoxynucleotide conjugates as enzyme reporter for electrochemical detection of DNA and identification of bacterial species (2007)

Yiran Wang

Electrical Chip (E-Chip) system offers a fast, sensitive and cost-effective way to detect analyte. To improve its application of nucleic acids detection, a suitable enzyme reporter is expected. Esterase 2 (EST2) from Alicyclobacillus acidocaldarius was introduced and mutated to have an accessible cysteine residue at 118th codon. This esterase was purified by a single-step affinity chromatography with trifluoromethyl ketone as a ligand and covalently conjugated to a 5’-amino modified oligodeoxynucleotide. The purified conjugate served as a reporter enzyme for electrochemical detection of nucleic acids. Being an optimal substrate, p-aminophenylbutyrate exerts maximal signal response to EST2 in E-Chip, as determined by comparison of p-aminophenyl esters with acyl chain length from two to eight carbons. An assay of 15 pM of soluble esterase 2 in 1 ml was obtained exploiting p-aminophenylbutyrate. E-Chip detection of nucleic acids requires three essential steps: immobilization of thiol-modified capture oligodeoxynucleotides onto electrode, recruiting EST2 to electrode vicinity by means of nucleic acids hybridization, and amperometric determination of p-aminophenol produced by EST2 catalytic hydrolysis of p-aminophenylbutyrate. Generally, EST2 reporter allows a detection of approximately one million molecules/0.6 mm2 electrode. EST2 covalently attached by an oligodeoxynucleotide significantly increased the ability of mismatch discrimination as compared to the streptavidin conjugated EST2. Moreover, single nucleotide mismatch in analyte could be reliably discriminated in the set-up, as demonstrated by single nucleotide mismatch in a 49-mer oligodeoxynucleotide as well as in a 510-nucleotide ssDNA. Application of E-Chip to bacterial species identification through 16S rRNA was demonstrated. Escherichia coli and Listeria innocua were easily identified as judged by signals given by rRNA hybridization with species-specific capture ODNs. This system allows a detection of 1,000 Escherichia coli cells. As a further optimization, a stem-loop structured molecular beacon with 5’-thiol and 3’-biotin modifications was synthesized and tested on the chip using EST2-streptavidin as reporter. The presence of target oligodeoxynucleotides complementary to the whole stem-loop sequence enhanced signal for a moderate 2-fold. The future work should focus on combination of continuous flow PCR with EST2-oligodeoxynucleotide conjugate reporter to do faster and more automatic disease related DNA analysis, as well as construction of EST2 based biosensor for toxic agents detection.

Phosphate nutrition in the Ricinus communis L. seedling (2007)

Dang Khoa Tran

Phosphate (Pi) is one of the essential macronutrients required for growth and development of plants. Pi plays an important role in various metabolic processes, such as photosynthesis, respiration, energy conservation, carbohydrate metabolism and signal transduction. Although various Pi starvation induced genes have been isolated from different plant species grown under conditions of Pi starvation, information about their functions during germination and growth of seedlings is still lacking. During germination Pi stored in the endosperm is mobilized and transported to growing organs of seedlings, thus a phosphate transporters and acid phosphatases are expected to be involved in these processes. The aim of this study was to clarify the translocation of Pi within the seedlings and to identify the involvement of phosphate transporters and acid phosphatases in the growth of seedlings. Uptake into the phloem was analyzed by incubating the cotyledons in Pi. The movement of 32P-labeled applied as an inorganic phosphate (Pi) was detected from the cotyledons to the hypocotyl, in particular to its apical hook near the cotyledons, suggesting that Pi moves from the Ricinus communis L. cotyledons through the hypocotyl via phloem and partially re-circulates in the xylem or leaks out through the roots. Therefore reducing the efflux could be as important for the plant as increasing the efficiency of the uptake mechanism. Following the Pi uptake into the roots, the translocation of 32P-labeled Pi to the cotyledons through the hypocotyl via the xylem showed that a high amount of radiotracer accumulated in the cotyledons. The accumulated Pi in the cotyledons can be retranslocated to the roots via phloem. This work describes the cloning of the phosphate transporter RcPT1 and the acid phosphatase RcPS1 genes by RT-PCR from Ricinus seedlings grown under Pi starvation conditions. Phosphate transporter RcPT1 contains an open reading frame encoding a 530 amino acid polypeptide with a calculated molecular mass of 59 kD. The expression of RcPT1 in the yeast high-affinity phosphate transporter mutant strain complemented the mutant and enhanced the cell growth significantly. Southern blot analysis showed that the RcPT1 gene is present as a single or low-copy gene in the Ricinus genome. The transcripts of RcPT1 were expressed in the endosperm, cotyledons, hypocotyl and roots during germination. In detail in situ hybridization studies revealed RcPT1 expression in the adjacent area of endosperm to cotyledon, in the phloem and in the lower epidermis of cotyledons; Immunolocalization analysis showed RcPT1 accumulation at the same sites as its mRNA. In addition, RcPT1 transcripts were also found in the phloem of hypocotyl, and the epidermis and the steles of roots. These results implicated that RcPT1 is involved in the movement of Pi from endosperms to cotyledons and the redistribution of Pi within seedlings via phloem during germination. Acid phosphatase RcPS1 shows a 747 bp open reading frame encoding a 248 amino acids polypeptide with a calculated molecular mass of 27,5 kD. The amino acid sequence of RcPS1 shares significant similarity with the acid phosphatase LePS2 from tomato and highly conserved motifs, which are typical for a member of haloacid dehalogenase and DDDD superfamilies of enzymes catalyzing a diverse number of hydrolytic and phosphotransferase reactions. The functional analysis after expression of RcPS1 in E.coli showed significant acid phosphatase activity. The high transcript level of RcPS1 in endosperms, cotyledons and roots at the first few days of germination suggested that this acid phosphatase gene might be expressed during mobilization of storage products. RcPT1 and RcPS1 mRNA are detectable in the seedlings grown under Pi starvation and Pi sufficient conditions, indicating that both genes were expressed independently from exogenous Pi supply during germination. Moreover, RcPT1 and RcPS1 were expressed in leaves, stems and roots of plants grown under Pi starvation; furthermore, in situ hybridization studies localized RcPT1 and RcPS1 mRNA in the epidermis and the stele of roots of Pi-starved plants, suggesting that these genes also play a role in response to Pi starvation. Thus, it is concluded that there are different signals regulating RcPT1 and RcPS1 expression in response to Pi starvation and during germination.

Coherent Transport of Matter Waves in Disordered Optical Potentials (2007)

Robert Kuhn

The development of modern techniques for the cooling and the manipulation of atoms in recent years, and the possibility to create Bose-Einstein condensates and degenerate Fermi gases and to load them into regular optical lattices or disordered optical potentials, has evoked new interest for the disorder-induced localization of ultra-cold atoms. This work studies the transport properties of matter waves in disordered optical potentials, which are also known as speckle potentials. The effect of correlated disorder on localization is first studied numerically in the framework of the Anderson model. The relevant transport parameters in the configuration average over many different realizations of the speckle potential are then determined analytically, using self-consistent diagrammatic perturbation techniques. This allows to make predictions for a possible experimental observation of coherent transport phenomena for cold atoms in speckle potentials. Of particular importance are the spatial correlations of the speckle fluctuations, which are responsible for the anisotropic character of the single scattering processes in the effective medium. Coherent multiple scattering leads to quantum interference effects, which entail a renormalization of the diffusion constant as compared to the classical description. This so-called weak localization of matter waves is studied as the underlying mechanism for the disorder-driven transition to the Anderson-localization regime, explicitly taking into account the correlations of the speckle fluctuations.

Monochloracetat in der Umwelt (2007)

Franziska Herrmann

Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Herkunft des ubiquitär vorkommenden, phytotoxischen Monochloracetats (MCA) unter Verwendung einer Massenbilanz und eines Fugazitätsmodells zu erklären. Die grobe Bilanz offenbarte, dass atmosphärische Luft und Niederschlag am stärksten belastet sind. Somit ist Bildung in der Troposphäre mit anschließender Auswaschung, nicht aber industrielle Emission, die Hauptquelle des MCA. Außerdem wurde deutlich, dass MCA beinahe vollständig in Oberflächengewässern und im Boden abgebaut wird. Die Simulation dieses Bildungsweges mit dem Standard Multispecies Model, das auf Fugazitäten basiert, lieferte noch mehr Details. So wurden MCA-Konzentrationen prognostiziert, die mit den üblicherweise gefundenen sehr gut übereinstimmen (einige ng/m3). Ähnlich gute Übereinstimmungen ergaben sich bei der Berechnung über die anteiligen Ausbeuten aus verschiedenen Kohlenwasserstoffen. Am bedeutsamsten ist dabei Ethen, und das wichtigste Zwischenprodukt ist der mutagene Chloracetaldehyd (CAA). Das Schicksal des CAA wurde mit UV-Spektroskopie und in verschiedenen Smogkammer-Experimenten untersucht. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse ist zu schlussfolgern, dass CAA zu rund 40 % durch Photolyse und zu 60 % durch Reaktion mit Hydroxyl-Radikalen abgebaut wird. Während der CAA durch UV-Licht hauptsächlich in C1-Bruchstücke gespalten wird, konnte bei der OH-Reaktion MCA als Abbauprodukt mit Ausbeuten zwischen 3 und 13 % identifiziert werden. Bei den Smogkammer-Experimenten zur Reaktion von CAA mit Ozon und Wasserstoffperoxid entstand zwar auch MCA; diese Reaktionen erwiesen sich aber als heterogen und sollten daher zur besseren Quantifizierung noch weiter untersucht werden. Große Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit hatte die Entwicklung einer Analysen-Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von CAA in der atmosphärischen Luft, weil dazu bisher keine Methode etabliert ist. Direkte Bestimmung und Bestimmung als Dinitrophenylhydrazon waren nicht erfolgreich, aber Derivatisierung zum Pentafluorbenzyloxim auf Tenax und anschließende gas-chromatographische Analyse lieferten überzeugende Ergebnisse. Mit der entwickelten Methode konnte erstmals CAA in der Atmosphäre quantifiziert werden: die gefundenen Tagesmittelwerte lagen – je nach Wetter – zwischen 0,2 und 1,1 µg/m3. Diese stimmen sehr gut mit den Konzentrationen überein, die mithilfe der Modelle auf Grundlage der Fugazitäten bzw. der anteiligen Ausbeuten prognostiziert worden sind. Als weiterer Beweis für die atmosphärische Bildung sind die Tagesverläufe der MCA-Konzentrationen anzusehen. Mit einer bereits etablierten Methode konnten Gehalte zwischen 2 und 20 ng/m3 gefunden werden. Dabei zeigte sich ein Anstieg am Vormittag, denn hier wird MCA gebildet. Nach Durchlaufen eines Maximums am Mittag sanken die Konzentrationen, weil dann Deposition und Advektion zunehmend in Erscheinung treten.

Spatio-Temporal Patterns of Biodiversity and their Drivers - Method Development and Application (2007)

Gerald Jurasinski

Landnutzungsveränderungen und Klimawandel führen weltweit zu einer rapiden Veränderung von Landschaften und Ökosystemen. Es werden dringend standardisierte und vergleichbare Daten benötigt, um den damit einhergehenden Verlust von Biodiversität zu erfassen. Daher ist es überaus wichtig, Methoden für eine umfassende Erfassung und Bewertung von Biodiversität zur Verfügung zu stellen. Aufgrund der Geschwindigkeit des Biodiversitätsverlustes sollten diese ebenso repräsentativ wie pragmatisch sein. Wenn Biodiversität auf Landschaftsebene verloren geht, müssen Aufnahmen häufig wiederholt werden, um diese Veränderungen erfassen und analysieren zu können. Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Evaluierung räumlich expliziter, übertragbarer Methoden zur Erfassung und Analyse pflanzlicher Vielfalt. Dies schließt Artenreichtum ebenso ein wie die räumliche und zeitliche Heterogenität der Artenzusammensetzung. Die konzeptionelle Erarbeitung einer Methodik sowie ihre Anwendung zur Untersuchung ökologischer Fragestellungen bilden die zwei Schwerpunkte dieser Arbeit. Eine Bewertung der bestehenden Terminologie zur biologischen Vielfalt - insbesondere bezüglich des Begriffes beta-Diversität - macht deutlich, dass eine Vielzahl konkurrierender Konzepte existiert. Diese Fülle an Definitionen verhindert die Anwendung sowie den wissenschaftlichen Fortschritt. Daher wird eine neue Terminologie vorgeschlagen, welche - im Gegensatz zu Whittakers Konzept der Vielfalt (mit den Begriffen alpha-, gamma- und beta-Diversität) - klarere Begriffe zur Verfügung stellt (Erfassungs-, Unterscheidungs- und Verhältnis-Diversität). Sie ermöglicht eine direktere Erfassung der zugrunde liegenden ökologischen Phänomene und Fragestellungen was wiederum eine effiziente Strukturierung zukünftiger Forschung und Diskussionen ermöglicht. Räumliche Muster der Vielfalt können am ehesten mit systematischem Sampling erfasst werden. Allerdings sind rektanguläre Raster - wie sie bisher angewendet worden - nicht unproblematisch. Einerseits wird dabei die Veränderung der Ähnlichkeit von Erfassungsflächen mit der Entfernung zwischen ihnen nicht berücksichtigt. Andererseits ergeben sich uneindeutige Ähnlichkeitswerte. Daher wird das systematische Sampling in hierarchisch geschachtelten, equidistanten Rasterflächen vorgeschlagen. Es scheint eine geeignete Methode zur Untersuchung räumlicher Muster in der Vegetation zu sein. Zur Analyse von Vielfaltsmustern wird ein neuer Koeffizient der Multi-Plot-Diversität vorgestellt. Zum ersten Mal ist damit die simultane Berechnung der Ähnlichkeit zwischen einer und mehreren Erfassungsflächen unter Berücksichtigung der Identitäten der Arten auf allen betrachteten Flächen möglich. Er erlaubt eine bessere Darstellung von Gradienten der Artenzusammensetzung und Hotspots der Artenvielfalt als andere getestete Indizes. Damit stellt dieser Koeffizient ein viel versprechendes Werkzeug für die ökologische Forschung als auch für Naturschutzplanung und -monitoring bereit. Das entwickelte equidistante Erfassungsraster wurde in einer Fallstudie in Nordost-Marokko angewendet, um räumliche Muster der Biodiversität und die sie bestimmenden Faktoren zu untersuchen. Das geschachtelte Raster mit hexagonalen Aufnahmeflächen ermöglicht eine detaillierte Bewertung verschiedenster Apekte der biotischen Vielfalt auf Landschaftsebene. Störungen stellen einen wichtigen Einflussfaktor in Bezug auf räumliche Muster der Artenverteilung dar. Allerdings ist das langfristige Störungsregime von noch stärkerer Bedeutung. Es manifestiert sich in der Vegetationsstruktur der Baum- und Strauchschicht. Am bedeutsamsten ist jedoch die Feststellung, dass die Beziehungen zwischen räumlichen Mustern der Biodiversität und den sie bestimmenden Einflussfaktoren erheblich mit der Maßstabsebene auf der sie erfasst werden schwanken. Sie zeigen keine Stationarität im statistischen Sinne. Für die ökologische Forschung ist dies eine bedeutende Feststellung. Wenn die Beziehungen zwischen Mustern und den sie bestimmenden Prozessen untersucht werden, muss die Erfassungsmethode dem Rechnung tragen und die Untersuchung von maßstabsabhängigen Varationen der Beziehungen zwischen Umweltvariablen ermöglichen. Teile der für die Analyse von multiplen Untersuchungsflächen entwickelten Methodik wurden auf einen Vegetationsdatensatz von Alpengipfeln im Bernina-Gebiet (Schweiz) angewendet. Dabei wurde untersucht, ob das klimabedingte Aufwärtswandern von Arten zu einer Homogenisierung der Artenzusammensetzung auf diesen Gipfeln führt. Die Analyse zeigt, dass dies tatsächlich der Fall ist: Die Zunahme der Artenvielfalt auf den Bergspitzen geht mit einer Abnahme der Unterschiedlichkeit zwischen ihnen einher. Im Kontext der vorliegenden Arbeit ist festzustellen, dass das Heterogenitätskonzept eine interessante Möglichkeit für die Bewertung aktueller ökologischer Fragestellungen sowie für die Naturschutzplanung darstellt.

Sekundäre Bergregenwälder in Südecuador:Der Einfluss der Art der Störung auf das Spektrum der Pflanzenarten und die Waldstruktur, eine vegetationskundliche Analyse (2007)

Juan Alfredo Martínez Jerves

In der Reserva Biológica San Francisco, in der extrem humiden Ostkordillere Südecuadors wurden 7 Sekundärwäldchen mit einer Grundfläche zwischen 1450 und 2000 m² ausgewählt, alle in ca. 2000 m Höhe gelegen, die nach Luftbildern und Aussagen der Bevölkerung zwischen 10 und (50 +x) Jahre alt sind und aus unterschiedlichen (Zer)Störungen des ursprünglichen Bergregenwalds hervorgingen. Das jüngste dieser Wäldchen (Plot D5, ca. 10 Jahre alt) steht auf Murengelände, resultiert also – als einziges – aus einer „natürlichen“ Störung, während die anderen 6 auf anthropogene Störungen, wie Waldbrand (die Plots F1 und F2, ca. 15 Jahre Regenerationszeit) und Abholzung (die Plots C1 bis C4, zwischen 30 und 50 +x Jahre alt) zurückgehen. Zur Erstellung von „Releves“ wurden die Wäldchen mit abgespannten Seilen in 5 x 5m Parzellen unterteilt (zwischen 60 und 91 Parzellen pro Wäldchen), deren Gefäßpflanzen-Vegetation dann nach Braun-Blanquet und Müller-Dombois quantitativ erhoben wurde. Die Arten wurden 4 verschiedenen pflanzlichen Lebensformen zugeschrieben, die im Idealfall Strata repräsentieren können: Bäume, Sträucher, krautige Pflanzen und Lianen. Insgesamt wurden 457 Parzellen analysiert. In den 7 Wäldchen wurden insgesamt 779 Gefäßpflanzenarten registriert, von denen allerdings nur ein Fünftel sicher bis zur Art identifiziert werden konnte. 50% konnten sicher bis zur Gattung, und 92% bis zur Familie bestimmt werden. Acht Prozent blieben unbestimmbar; vermutlich sind noch unbeschriebene Arten darunter. Nach der Lebensform weisen die Bäume mit einem Anteil von 30% die größte Diversität der Arten auf. Danach folgen die krautigen Pflanzen (28%), Sträucher (26%) und Lianen (14%). Die artenreichsten Familien der untersuchten Sekundärwäldchen sind die Asteraceen, Melastomataceen, Piperaceen, Araceen und Lauraceen. Die artenreichsten Gattungen sind Anthurium (Araceae), Mikania (Asteraceae), Piper und Peperomia (Piperaceae), und Miconia (Melastomataceae). Eine besondere Bedeutung für die Indikation der Sekundärwälder haben der Bambus (Chusquea spec.1), der Adlerfarn (Pteridium arachnoideum) und die Sträucher Baccharis latifolia und Ageratina dendroides (Asteraceae) als Brandzeiger, sowie unter den Bäumen die Pioniere Viburnum obtectum (Caprifoliaceae), Piptocoma discolor (Asteraceae), Myrica pubescens (Myricaceae) und Tapirira guianensis (Anacardiaceae). Die Vegetation der Plots wird zahlenmäßig bestimmt von Arten mit einem geringen Deckungsgrad und einer geringen Häufigkeit. Entsprechend ist die Zahl der häufigen und dominanten Arten klein. Der Fortschritt der Sukzession lässt sich deshalb auch nicht an bestimmten Arten festmachen. Eher möglich ist dies im Hinblick auf den ursprünglichen Störungsfaktor, wo sich Feuer, mechanische Rodung und Bergrutsche an Indikatorarten erkennen lassen. Die größte Herausforderung bei der Auswertung der Daten stellte die Heterogenität der Vegetation (niedrige Sœrensen-Index) in den einzelnen Wäldchen („Plots“) im Zusammenhang mit der hohen a-Diversität der Gefäßpflanzen dar. Dazu wurden in dieser Arbeit die Jaccard Indices der Parzellen mit der nicht linearen „Isometric Feature Mapping“-Methode (ISOMAP) bearbeitet, mit deren Hilfe man ökologische Erkenntnisse aus der a- und der ß-Diversität der Parzellen und der gesamten Plots ableiten kann. Dabei ergaben sich 2 hauptsächliche Ordinationslinien: Die Regenerationszeit der Wäldchen und die Nährstoffverfügbarkeit des Bodens: Niedriges Nährstoffangebot auf Murenboden, hohes auf Brandflächen. Die Reihung der Wäldchen entlang der Ordinationsachse der Regenerationszeit deckt sich mit dem Ergebnis der Luftbildauswertung. Allerdings wurde kein Zusammenhang zwischen der Artenzahl der Wäldchen und ihrem Regenerationsalter festgestellt. Für die Ähnlichkeitsanalyse auf Parzellen- und Plotebene wurde der Sœrensen-Index verwendet. Dabei wurde zum einen die Ähnlichkeit der Artenzusammensetzung („ß-Diversität“) aller Parzellen eines Plots mit einer ausgewählten Referenzparzelle bestimmt, zum anderen die „ß-Diversität“ der Nachbarparzellen berechnet. Diese Art der Datenanalyse zeigte die große Heterogenität der Sekundärwaldvegetation, wie sie sich bereits in den Arten-Areal-Kurven andeutete, wo innerhalb der Grenzen dieser Wäldchen keine Sättigungswerte („Minimum-Areale“) erkennbar sind. Der jüngste Plot in der unechten Zeitreihe der mechanisch gerodeten Flächen hat mit einem Median von 0,4 noch die größte Ähnlichkeit der Einzelparzellen. Allerdings war dies auch der Plot mit einer negativen Korrelation zwischen der Artenzahl („a-Diversität“) der Parzellen und dem Sœrensen-Index, während sonst dieser Ähnlichkeits-Index mit der Artenzahl der Parzellen erwartungsgemäß zunahm. Weiterhin wurde geprüft, ob es eine (negative) Ähnlichkeits-Korrelation der „ß-Diversität“ der Parzellen mit zunehmender Entfernung der Parzellen gibt. Abnehmende Ähnlichkeit mit zunehmender Entfernung wurde aber nur in 2 Plots registriert.

Construction and analysis of novel controllable expression vectors for Bacillus subtilis (2007)

Thi Phuong Trang Phan

Summary The gram-positive bacterium Bacillus subtilis is well-known for its contributions to agricultural, medical, and food biotechnology and for the production of recombinant proteins. At present, about 60% of the commercially available technical enzymes are produced by Bacillus species. Furthermore, a large body of information concerning transcription, translation, protein folding and secretion mechanisms, genetic manipulation, and large-scale fermentation has been acquired. But so far, efficient and inexpensive expression vectors for B. subtilis are still missing. To fill this gap, a glycine-inducible expression system and a lysine-autoinducible one were explored and IPTG-inducible expression plasmids that allow overexpression and purification of proteins were constructed and analyzed. Furthermore, a technique with a useful promoter-probe plasmid to analyze strong promoters in B. subtilis was established, which allowed to study promoter and mRNA stabilizing elements to enhance the transcript level and mRNA stability leading to higher production of recombinant protein. During the development of the glycine-inducible and lysine-autoinducible expression plasmids, the presence of a small transcript termed riboswitch corresponding to the 5´ UTR in the absence of L-glycine or presence of L-lysine and its conversion into the full-length transcript after addition of the L-glycine or removal of L-lysine was confirmed by Northern blot. Next, the promoter and downstream riboswitch was fused to the lacZ reporter gene to measure glycine or lysine-dependent induction. The production potential for the glycine system was analyzed in detail, and the promoter strength improved by using HtpG, Pbp4 and alpha-amylase as model proteins. In summary, the glycine riboswitch can be used successfully for regulatable production of both intra- and extracellular proteins, and the lysine riboswitch can be applied as an auto-inducible expression system allowing production of recombinant proteins when the L-lysine concentration within the growth medium falls below a threshold value. Six commercially available novel plasmid-based IPTG-inducible expression plasmids for B. subtilis were constructed, too. While the first vector allows intracellular production of recombinant proteins (pHT01), the second provides a strong secretion signal (pHT43). The third vector allows addition of the c-Myc epitope tag (pHT10), and the remaining three vectors provide the purification tags His (pHT08) and Strep (pHT09 and pHT24). The versatility of all six vectors was verified by insertion of appropriate reporter genes and by demonstrating high level production of their proteins. A total of 85 different synthetic and groE-modified sigmaA-dependent promoters were introduced into pHT06 and analyzed. Sequences around the transcriptional start site, the -10 region, the -15 region, the -35 region and the upstream region turned out to influence the promoter strength. BgaB activities and Northern blot analyses were used to measure the activity of the different promoters. The measurements of some new combinations of core promoters and UP elements on gene expression revealed that the beta-galactosidase activity expression levels could be increased up to 13-fold and the mRNA levels up to 43-fold as compared to the strong Pgrac promoter. If both elements were combined, an activity roughly 690 times higher than that obtained with the Pspac promoter were obtained, and synthesis of BgaB, under control of these promoters, could reach up to 30% of the total cellular protein. The mRNA stabilizing elements were also analyzed by using a similar experimental approach. First, seven-teen different 3´-mRNA terminal stem-loops have been investigated, which did not significantly influence neither the amount of protein produced nor the mRNA stability. Second, the 5´-mRNA stabilizing elements including a strong RBS, the lacO Controllable Stabilizing Element (CoSE) and the spacer between the RBS and CoSE were examined. The results demonstrated that CoSE together with an appropriate spacer and a strong RBS could increase gene expression 9-fold as compared to the Pgrac promoter, reaching up to 26% of total cellular protein and a half-life of the mRNA of more than 60 min. A combination of strong promoters and stabilizing elements showed that recombinant protein synthesis levels of up to 42% of the total cellular protein could be obtained.

Untersuchungen zur Ausbildung hochgeordneter Strukturen in lamellaren Tensidphasen (2007)

Christian Wolf

Komplex aufgebaute äquidistante Lamellenflächen bilden in Systemen mit parabolischen Fokalkegeln hochsymmetrische Muster. Am Beispiel des Systems Natriumdodecylsulfat / Wasser / Hexanol / Dekan wurde dieses Verhalten im Bereich von L3- und lamellarer Phase gefunden und untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollten die Ursachen und Wege bei der Ausbildung solcher Strukturen genau aufgeklärt und qualitativ untersucht werden. Es ist bekannt, dass geordnete lamellare oder smektische Phasen bei erzwungener Dilatation parabolische Fokalkegel bilden können, die zu regelmäßiger Musterbildung neigen. Bei den hier untersuchten Tensidsystemen waren die Probengefäße jedoch starr und keinem mechanischen Stress unterworfen. Trotzdem wurden hier besonders gut ausgeprägte Muster von parabolischen Fokalkegeln nachgewiesen. Es stellte sich deshalb die Aufgabe, alle auftretenden dynamischen Prozesse von der Probenpräparation an bis zur Ausbildung des Musters und dessen Zerstörung zu dokumentieren und zu beschreiben. Im lamellaren Einphasengebiet wurde in keinem Fall die Ausbildung von geordneten Lamellen beobachtet. Alle Proben blieben ungeordnet und zeigten starke Doppelbrechung. Bei Entnahme der lamellaren Phase aus dem koexistierenden lamellar / L3-Gebiet entstand dagegen in allen Fällen in kurzer Zeit Pseudoisotropie. Von den verschlossenen Rändern des Microslides aus begann in den pseudoisotropen Proben eine nebelartige Fahne in das Kapillarinnere hinein zu wachsen. Bei starker Vergrößerung des Nebels konnte nachgewiesen werden, wie zunächst aus diffusen Strukturen Muster entwickelt wurden. Mustergröße, Kontrast und Ordnung nahmen dabei stark zu, bis schließlich große Bereiche mit nahezu perfekten Quadraten entstanden. Es ist mit der gewählten Methode reproduzierbar gelungen, solche hochgeordneten Bereiche in perfekter quadratischer Orientierung über das gesamte Gesichtsfeld des Mikroskops zu erzeugen. SDS-Konzentration, Hexanol- und Dekangehalt, Kotensid und Temperatur wurden variiert, um bestmögliche Bedingungen für solche optimalen Ordnungen zu finden. Die hohe Gleichmäßigkeit der Gitter ermöglichte die quantitative Untersuchung der Mustergeometrie. Es konnte gezeigt werden, dass die Muster immer exakt in der Mitte zwischen unterer und oberer Fläche des Probengefäßes positioniert waren. In der mittleren Fokalebene ist die Symmetrie außerordentlich hoch, weil die sowohl nach oben und nach unten verlaufenden Parabeln identisch abgebildet werden. Bei Verschiebung des Fokus fand man eine obere und untere ganz scharf abgebildete Fokalebene, in der nur jeweils die vier oberen oder unteren der zusammenfallenden Parabeln scharf abgebildet werden. Wenn man die Dicke der Microslides veränderte, entstanden die Muster zunächst in gleicher Größe. Sie wuchsen dann aber unter Kontrastverstärkung bis zu einem maximalen Wert an, der proportional mit der Dicke der Microslides zunimmt. Besonders war der Vergleich zwischen oberer und unterer Fokalebene mit der Größe der Elementarzelle. Die Messwerte für alle Proben und für alle Microslidedicken lagen auf einer Geraden durch den Nullpunkt. Hieraus ist zu schließen, dass die Mustergestalt der parabolischen Fokalkegel von einem einzigen Parameter, der Zellgröße, bestimmt wird, das heißt, alle Muster sind einander ähnlich. Um die Triebkraft für die Bildung der parabolischen Fokalkegel zu ermitteln wurden Proben angesetzt, abgedichtet und in bestimmten Zeitintervallen gewogen. Dabei wurde nachgewiesen, dass Wasser, Hexanol und vor allem Dekan durch den Kitverschluss diffundieren können. Das Phasendiagramm zeigt, dass bei Dekanverlust die lamellare Phase erhalten bleibt, dass aber dabei der interlamellare Abstand abnehmen muss. Für die geordnete Probe im Microslide wirkt dieser Vorgang aber wie eine erzwungene Dilatation, die zur Bildung der parabolischen Fokalkegel führt, um diesen Zwang auszuweichen. Hierdurch wird auch verständlich, dass sich die Proben nach Ausbildung des Musters nach einiger Zeit weiter verändern. Dabei treten Fließbewegungen des gesamten Musters auf. Dadurch werden Verzerrungen im Muster erzwungen. Es konnte dabei nachgewiesen werden, dass solche Verzerrungen nach Änderung des 90° Winkels vom Quadrat zu einem 60° Winkel wieder ein neues stabiles Rautengitter mit neuer Symmetrie ausbildeten. Dieses Gitter ist der Grenzfall der maximal möglichen Verzerrung eines regulären Musters parabolischer Fokalkegel zu einem Ellipsen-Hyperbel-Gitter. In Proben mit wenig lamellarer Phase entstanden in starker Dynamik aus hochgeordneten Bereichen der lamellaren Phase exakt hexagonal angeordneter Strukturen, die sich unter dem Polarisationsmikroskop wie Maltesertröpfchen verhielten. Die Eigenschaften von parabolischen Fokalkegeln sind hierbei völlig verschwunden. Es ist deshalb anzunehmen, dass bei diesem Gitter die Fokalkegel unter Ausbildung lamellar ähnlicher Tröpfchenstrukturen zunehmend zerstört werden.

Orbital Functionals in Time-Dependent Density-Functional Theory (2007)

Michael Mundt

The subject of this work are orbital functionals in density-functional theory (DFT). After a short introduction the basic ideas of static and time-dependent DFT are presented in Chap. 2. In this chapter the advantages and disadvantages of common approximations for the exchange-correlation (xc) functional are also discussed as well as the basic ideas behind orbital functionals. In the first part of Chap. 3 the ground-state formalism of the DFT for fractional particle numbers is recapitulated. In the second part the concept of fractional particle numbers is extended to time-dependent situations and physical consequences are discussed. In particular, it is shown that under certain conditions the time-dependent xc potential must change discontinuously whenever the particle number crosses an integer number. The subject of Chap. 4 is the static and time-dependent optimized effective potential equation. This integral equation must be solved to obtain the xc potential corresponding to an orbital-functional approximation for the xc functional. It is shown that the integral equation in the time-dependent case can be transformed into a set of coupled differential equations. Based on this set of differential equations an approximate solution for the xc potential is developed. In Chap. 5 the set of coupled differential equations obtained in Chap. 4 is studied from a numerical point of view. It turns out that instabilities spoil the exact numerical solution, however, the approximation developed in Chap. 4 is found to be stable and can be used to go beyond the commonly used Krieger-Li-Iafrate (KLI) approximation. Exact properties of the xc potential are studied in Chap. 6. In particular, it is shown that the widely used KLI approximation for the xc potential violates the Zero-Force theorem. As demonstrated in Chap. 6 this violation can render the whole approximate solution useless. In combination with the fact that the KLI approximation satisfies the Harmonic-Potential theorem this observation also shows that the xc potential obtained from the KLI approximation is not a functional derivative of some xc functional. In Chap. 7 and 8 the photoelectron spectra from small anionic sodium clusters are studied. In Chap. 7 the Kohn-Sham eigenvalues obtained from different approximations for the xc potential are compared to the experimental results. It is found that although the more weakly bound peaks are well reproduced in all approximations the more strongly bound peaks are not. In Chap. 8 the theoretical photoelectron spectra are extracted from the excitation energies of the clusters with one electron less. It is found that the general agreement between the experimental and theoretical spectra is considerably improved. Especially the more strongly bound parts of the spectra are reproduced much better. This result shows that even for sodium clusters effects beyond the independent-particle picture must be taken into account in the interpretation of photoelectron spectra.

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