Doctoral Thesis
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Synthese von Oligosacchariden der Zellmembran mit neuartigem Verzweigungsmuster und von lipidhaltigen Signalstoffen pflanzlicher Symbionten
(2002)
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Ingo Prahl
- Zucker spielen eine entscheidende Rolle in vielen Bereichen des Lebens. Zur Untersuchung ihrer mannigfaltigen biologischen Eigenschaften sind definierte Verbindungen notwendig. Diese Arbeit sollte durch chemo-enzymatische Synthese des von P. Stanley isolierten Lec14-N-Glycans 58, das eine ß-1,2-Verknüpfung von N-Acetyl-glucos-amin mit dem ß-Mannosid des Core-Trisaccharids aufweist, den Strukturvorschlag verifizieren und Neoglycoproteine mit dieser Oligosaccharidstruktur für biologische Studien bereitstellen. Zum Aufbau des dazu notwendigen Core-Trisaccharids 39 konnte die Synthese des p-Methoxyphenylbausteins 16 wie auch die reduktive Acetalöffnung von Verbindung 17 deutlich verbessert werden. Die im Rahmen der Core-Trisaccharidsynthese mit den Donoren 24 und 26 durchgeführten Versuche zur direkten ß-selektiven Mannosylierung mit Cyclohexanol als Akzeptor verliefen ß-selektiv und mit sehr hohen Ausbeuten. Mit Chitobiosylazid 30 als Akzeptor wurden Trisaccharide erhalten, allerdings mit geringen Ausbeuten und schlecht abtrennbaren Verunreinigungen. Das Core-Trisaccharid 39 wurde daher durch Inversion aus der Glucoverbindung 38 hergestellt. An Pentasaccharid 41 erfolgte die GlcNAc-ß-1,2-Anbindung an die Mannose des Core-Trisaccharids unter Verwendung des Donors 42. Verschiedene Testreihen führten zum Auffinden eines schmalen Temperaturfensters und zu optimierten Reaktionsbedingungen für die Darstellung des Hexasaccharids 44. Durch Glycosylierung mit dem Disaccharid 40, Donor 51 und anschließender Entschützung wurde das Lec14-Nonasaccharid 54 erhalten. Dieses wurde nach der Kupplung mit Z-Aminohexansäure 55 durch Hydrieren in Verbindung 57 überführt. Verbindung 57 stützte durch Vergleich mit den NMR-Daten von Verbindung 58 den Strukturvorschlag von P. Stanley und stellte das Substrat für enzymatische Synthesen dar. Bei der enzymatischen Galactosylierung wurde jeweils nur ein Äquivalent UDP-Galactose eingesetzt. Dadurch konnten nacheinander die einfach, zweifach und dreifach galactosylierten Verbindungen 61, 62 und 63 erhalten werden. Durch NMR-spektroskopische Untersuchungen wurde eine Selektivität der Galactosyltransferase für den a-1,3-Arm, dann den a-1,6-Arm und schließlich den ß-1,2-Arm gefunden. Auch die Sialylierung aller drei Arme konnte massenspektroskopisch mit Verbindung 64 belegt werden. Da bei Verbindung 57 die Galactosylierung und die anschließende Sialylierung unerwarteterweise an sämtlichen Verzweigungen möglich ist, liegt die Vermutung nahe, dass dieses Strukturmotiv auch bei N-Glycanen der betreffenden CHO-Zellen gefunden werden kann. Durch Anbindung der dreifach galactosylierten Verbindung 63 an Rinderserumalbumin (BSA) steht erstmals mit Neoglycoprotein 66 ein Lec14-Oligosaccharid für biologische Untersuchungen bereit. Im Pflanzenreich sind für eine erfolgreiche Symbiose zwischen Leguminosen und Rhizobien die von den Bakterien sekretierten NOD-Faktoren essentiell. Da Dazzo und Hollingsworth N-Palmitoylglucosamin als Minimalstruktur für NOD-Faktoren ansehen, wurden N-Palmitoylglucosamin 70 und andere Mono-saccharid-derivate für biologische Untersuchungen bereitgestellt. Bei Untersuchungen an Medicago sativa (Luzerne) wurde in Zusammenarbeit mit Herrn K. Niehaus in Bielefeld jedoch nur eine geringe Aktivität der getesteten Verbindungen gefunden, so dass diese nicht als Minimalstrukturen angesehen werden sollten. Der Einfluss der Mono-saccharid-derivate auf die Keimfähigkeit und das Wachstum von Weizen und Mais wurde von Dr. G. Kretzschmar in Frankfurt untersucht. Die z.T. sehr guten Ergebnisse müssen aber aufgrund der hohen Schwankungen bei den biologischen Untersuchungen durch weitere Messreihen abgesichert werden. Für weitere Untersuchungen wurde eine Synthese von natürlichen NOD-Faktoren und Analoga etabliert. Dabei wurde auf die funktionalisierten Monosaccharidbausteine 76 und 78 zurückgegriffen, die in großen Mengen einfach zugänglich sind. Die Aminogruppe des Tetrasaccharids 84 ist für die Kupplung mit Acylresten funktionalisiert. Nach der Kupplung von Acylresten an Verbindung 84 und den anschließenden Entschützungsschritten wurden jedoch Nebenprodukte gefunden, und die Reinigung gestaltete sich aufgrund der sehr geringen Löslichkeit der Verbindungen 94 und 95 sehr schwierig. Ausgehend von Verbindung 84 wurde die freie Aminoverbindung 99 hergestellt. Nach der Kupplung der Acylreste über N-Hydroxysuccinimidester wurden die Zielverbindungen 94 und 95 erhalten. Der Baustein 83 eignete sich für die einfache Darstellung von Analoga. Die Azidofunktion ermöglichte nach der Reduktion zu einem Amin die Anknüpfung von Carbonsäuren am reduzierenden Ende. Die folgende Hydrierung lieferte die Analoga 105 bzw. 106. Die vorgestellte Methode bietet einen leichten Zugang zu NOD-Faktoren und Analoga, deren Einsatz in biologischen Studien weitere Einblicke auf dem Gebiet der NOD-Faktoren und der beteiligten Signalwege bringen soll.
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Self-Assembly of Block Copolymers in External Fields
(2002)
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Alexander Böker
- The influence of external fields on the microdomain structure of block copolymers has been studied. Both surface fields and electric fields have been considered. External electric fields are used to create macroscopically oriented bulk samples. In order to circumvent limitations associated with the application of external fields to melts of high molecular weight block copolymers and multiblock copolymers of complex architecture, a new solvent-based procedure is introduced, i.e. the block copolymer microdomains are aligned by application of an electric field (E ~ 1 - 2 kV/mm) during solvent casting of bulk samples. In order to elucidate the dominating parameters and governing mechanisms, the microdomain orientation kinetics of concentrated block copolymer solutions exposed to a DC electric field is investigated by time-resolved synchrotron small-angle X-ray scattering (SAXS) at the ID02 beamline at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, France. As a first model system, a lamellar polystyrene-b-polyisoprene block copolymer dissolved in toluene is used. The orientation kinetics follows a single exponential behavior with characteristic time constants varying from a few seconds to some minutes depending on polymer concentration, temperature, electric field strength, and system size. Furthermore, two mechanisms governing the electric field alignment of a lamellar block copolymer from concentrated solutions are identified. It is shown that depending on the segregation power (c µ fP, c µ 1/T) a single mechanism dominates the orientation process, i.e. in a weakly segregated system (low concentration or high temperature) the migration of boundaries prevails, whereas a stronger phase separated system (high concentration or low temperature) predominantly exhibits rotation of grains. In addition, the orientation kinetics slows down with increasing polymer concentration, which can be correlated to the respective solution viscosity and the mechanism of orientation. Moreover, the influence of the electric field strength on the orientation kinetics is determined, including a threshold value below which no electric field induced orientation could be achieved on the time scale of the experiment. The time constants of the fastest processes were in the range of 0.5 sec, reaching a final orientation described by order parameters of up to P2 = -0.35. Finally, the variation of temperature yields control of the governing mechanisms at a fixed polymer concentration. In additional studies, the dielectric contrast of the block copolymer components was varied systematically (PS-b-PI, PS-b-PMMA, PS-b-PtBMA, PS-b-PHEMA-b-PMMA, PS-b-P2VP). It is found that a high dielectric contrast leads to faster alignment kinetics (e.g. the time constants of the fastest processes for a PS-b-P2VP diblock system in THF are in the range of 0.3 sec) and reduces the threshold field strength (around 200 V/mm for PS-b-P2VP). Furthermore, it could be shown that the interplay between degree of phase-separation, solution viscosity and dielectric contrast is crucial to decide if a given polymer/solvent system can be used for electric field-induced microdomain alignment. For example, it was found that PS-b-PtBMA shows electric field-induced orientation of the microdomains while PS-b-PMMA does not. This can be explained by the larger interaction parameter cST compared to cSM leading to a phase-separated solution at lower viscosities. In a similar way, the introduction of a high dielectric constant middle block (PHEMA) into a PS-b-PMMA, which additionally enhances phase separation, is shown to be the key to creating a well-performing methacrylate-based block copolymer system for electric field induced alignment from solution. Finally, we could show that the even more complex lamellar and core-shell cylindrical PS-b-P2VP-b-PtBMA high molecular weight triblock copolymer systems could be oriented by virtue of an electric field from solution. In summary, it was demonstrated that electric field alignment of block copolymer domains from solution is a powerful tool to generate highly anisotropic bulk block copolymer samples. The large variety of parameters which we can control allows us to further improve the preparation of macroscopically aligned melt samples via solvent casting in the presence of an electric field.
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Populationsökologische Untersuchungen zur Spargelfliege (Platyparea poeciloptera) und Zwiebelfliege (Delia antiqua) unter besonderer Berücksichtigung des Einsatzes von Simulationsmodellen im Integrierten Pflanzenschutz
(2002)
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Mathias Otto
- Spargelfliege (Plioreocepta poeciloptera, Syn.: Platyparea poeciloptera; Diptera: Tephritidae) und Zwiebelfliege (Delia antiqua; Diptera: Anthomyidae) sind durch den Fraß ihrer Larven Schädlinge in Spargel- (Asparagus officinalis) bzw. Zwiebelkulturen (Allium spp.). In der vor-liegenden Arbeit wurde die Populationsökologie beider Schadfliegen untersucht und die Er-gebnisse in ein Konzept für den Integrierten Pflanzenschutz (IPM) umgesetzt. Als Teil des IPM-Ansatzes wurde ein Simulationsmodell zur Populationsdynamik erstellt. Entwicklungsgeschwindigkeit, Lebensdauer, Fekundität und Ressourcennutzung beider Arten wurden unter Labor- und Freilandbedingungen untersucht. Die zur Befallskontrolle entwickelten Methoden basieren auf dem Nachweis der Pupalstadien und sind in der Praxis anwendbar. Spargelfliege P. poeciloptera Die hohe Bindung aller Entwicklungsstadien von P. poeciloptera an die Wirtspflanze, der univoltine Lebenszyklus und die relativ kurze adulte Lebensdauer (ca. 20 Tage) entsprechen der von Zwölfer (1983) aufgestellten IIIb-Strategie zur ökologischen Klassifizierung von Bohrfliegen. Spargelfliegen erwiesen sich in Versuchen als sehr ortsfest. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigen, daß der Flug von Spargelfliegen - im Ge-gensatz zu den meisten anderen Schadfliegen - nicht mittels Klebetafeln oder Wasserfallen erfaßt werden kann. Lediglich Stabfallen erwiesen sich als attraktiv für P. poeciloptera. In weiteren Versuchen wurde das Fallendesign der Stableimfallen optimiert (Farbe, Dicke, Länge und Aufstellwinkel). Grüne Stableimfallen (grasgrün; Höhe 400 mm; Durchmesser 25 mm) stel-len eine sehr effektive Fangmethode für P. poeciloptera dar. Die Anzahl gefangener Fliegen mit diesen Fallen war stark mit dem Prozentsatz befallener Pflanzen korreliert. Die vorliegende Arbeit liefert erstmals detaillierte Daten zum Flugverlauf von P. poeciloptera. Adulte P. poeciloptera wurden von Mitte April bis Anfang August (Flugspitzen: Mai, Juni und Juli) nachgewiesen. Die Dauer der Flugperiode kann dabei sehr ausgedehnt sein, und betrug im Einzelfall bis zu 132 Tage. Der Flugverlauf variierte stark innerhalb der Regionen und korre-lierte mit dem Anlagenalter. Im Vergleich zu Altanlagen (> 4. Pflanzjahr) konnte in Junganlagen (2. und 3. Pflanzjahr) ein deutlich verfrühter Flugverlauf beobachtet werden. Schlupfversuche unter Labor- und Freilandbedingungen mit überwinterten Puppen belegen, daß der im Feld beobachtete Flugverlauf durch einen stark gestreuten Schlupf der Spargel-fliegen zustande kommt. Befallszeitpunkt (Eiablage) und Schlupf im Folgejahr sind positiv mitei-nander korreliert. Dieser Befund erklärt den beobachteten früheren Schlupf von P. poeciloptera aus Junganlagen, da diese nicht oder lediglich kurz beerntet werden und damit eher von P. poeciloptera befallen werden können als Altanlagen. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit wurde ein alternatives Bekämpfungskonzept ge-gen P. poeciloptera entwickelt, das auf Routinespritzungen verzichtet und Insektizidapplika-tionen vom Befallsgrad des Vorjahrs und dem aktuellen Flugaufkommen abhängig macht. Zwiebelfliege D. antiqua Anhand von Laborversuchen wurde die temperaturabhängige Entwicklungsdauer aller Stadien von D. antiqua ermittelt, und in ein Simulationsmodell zur Populationsdynamik überführt. Die Struktur des Modells entspricht einem erweiterten Leslie-Modell (Söndgerath 1987; Söndgerath & Richter 1990) und baut auf zwei existierenden Simulationsmodellen für D. radicum und Psila rosae auf, die bereits als Expertensysteme im Pflanzenschutz eingesetzt werden. Erwartungsgemäß werden in den kommenden Jahren weitere Tests und eine Feinanpassung des Modells für D. antiqua erforderlich sein. Aus diesem Grund wurde das Modell Anfang des Jahres 2000 in PASO (Prognose Agrarischer Schadorganismen) integriert, das über die Zen-trale der Pflanzenschutzdienste für computergestützte Entscheidungshilfen (ZEPP, Mainz) ver-fügbar ist. Das Zwiebelfliegenmodell steht somit den Pflanzenschutzdienststellen zur Evaluierung und Nutzung zur Verfügung. Der Flugverlauf von D. antiqua wurde in kommerziellen Schnittlauchfeldern untersucht. Zwie-belfliegen bilden in Deutschland i.d.R. drei Generationen aus. Sowohl Wasserschalen als auch Klebetafeln eignen sich zum Fang von D. antiqua. Von den drei im Feld getesteten Fallenfarben erwiesen sich Weiß und Blau attraktiver für D. antiqua als Gelb. Untersuchungen an Zuchten im Freilandinsektarium weisen darauf hin, daß die Entwicklung der zweiten und dritten Generation bei hohen Temperaturen durch eine Sommerruhe (Aestivation) unterbrochen werden kann. Die Versuche weisen auf eine mögliche Kopplung von Sommer- und Winterdormanz hin.
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Fortschritte - Land-Stadt-Wanderung von Frauen in Tansania
(2002)
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Verena Knippel
- EXPLOSIONSARTIGE STADTENTWICKLUNG UND UNSICHTBARE MIGRANTINNEN Die Stadtentwicklung Tansanias ist in dreifacher Weise interessant: Die Anti-Urbanisierungspolitik Nyereres wurde weltbekannt und konnte doch weder eine der höchsten Stadtwachstumsraten weltweit verhindern, noch dass Daressalaam sich zu einer Primatstadt mit den typischen Problemen entwickelte. Seit den siebziger Jahren stellen Frauen die Mehrheit der Migranten, doch in Literatur und Diskussion sind sie 'unsichtbar' geblieben. Diese Studie will Gründe und Auswirkungen der Land-Stadt-Wanderung von Frauen erklären. Für ein Verständnis des Migrationsprozesses werden sowohl Trends auf nationaler Ebene als auch individuelle Strategien analysiert. Die Arbeit gliedert sich in drei Teile: Theorie und Methodik für Frauen-, Entwicklungs- und Migrations-forschung, Literaturstudie zu Frauenalltag und -migration in Tansania und Feldstudie mit Migrantinnen in Daresalaam. Letztere stützt sich auf eine Befragung von 302 Frauen an ausgewählten Wohnorten und Arbeitsplätzen zwischen 1993 und 1995, sowie 50 biographische Interviews und eine Reihe von Expertengesprächen. WIRTSCHAFTLICHE ODER SOZIALE WANDERUNGSGRÜNDE? Im Zuge verbesserter Schulbildung gewinnen wirtschaftliche Motive auch für Frauen rasch an Bedeutung. Darüber hinaus gibt es frauenspezifische Wanderungsmotive, etwa Heirat oder Mitarbeit im Haushalt von Verwandten in der Stadt. Die Situation auf dem Land ist von Diskriminierung beim Zugang zu Land und anderen Ressourcen, traditionellen Rollenzuweisungen und hoher Arbeitsbelastung sowie der Abwanderung der Männer geprägt, was zur Suche nach Alternativen führt. Frauen wachsen traditionell als zukünftige Migrantinnen auf: die Familienfelder werden den Brüdern vererbt, da sie nach der Heirat ins Dorf des Ehemannes ziehen. Der Besuch der Sekundarschule setzt ebenso einen Umzug voraus, wie die übliche Mithilfe im Haushalt von Verwandten in der Stadt. Nach einem Stadtaufenthalt ziehen die meisten Frauen aus dem Dorf weg. Die Migrationsgründe liegen weder in der Stadt noch auf dem Land, sondern im Lebenslauf. UNABHÄNGIGE MIGRATION ODER 'FAMILIENUNTERNEHMEN'? Migrantinnen sind heute besser informiert und entscheiden selbst, während ältere Frauen gerne berichten, sie seien 'wie Gepäck' mitgebracht worden. Eine wachsende Anzahl alleinstehender Frauen zieht selbständig und unabhängig in die Stadt. Die Unterstützung der Familie spielt doch weiterhin eine wichtige Rolle bei der Bezahlung der Fahrt und der ersten Unterkunft in der Stadt bei Verwandten, und ermutigt Kettenmigration. Der Umzug in die Stadt ist häufig als Besuch angelegt, wird meist ohne Gepäck unternommen. Die Wanderungsentscheidung wird weniger vor der Abreise getroffen sondern wiederholt in der Stadt - gegen eine Rückkehr ins Dorf. WERDEN MIGRANTINNEN ZU STÄDTERINNEN? Die meisten Frauen bewerten die Migration positiv und bewältigen den städtischen Alltag mithilfe von informellen Einkommen und Nachbarschaftshilfe. Doch sie unterhalten enge Beziehungen mit der Familie im Heimatdorf. Die Wanderung ist nicht der Versuch, familiären Verpflichtungen zu entkommen, sondern sie besser erfüllen zu können. Der Unterschied zwischen Stadt- und Landleben wird mit der Dominanz der Geldwirtschaft (und den damit verbundenen Chancen und Risiken) einerseits und der Subsistenzlandwirtschaft und Grossfamilie andererseits beschrieben. Viele betonen, dass es auf dem Land 'keinen Fortschritt' gebe: 'wenn du es zu etwas bringen willst, musst du in die Stadt'. Maendeleo (Swahili: Entwicklung, Fortschritt) ist das wichtigste politische Idiom seit der Unabhängigkeit und ein wichtiges Leitbild für Migrantinnen. Die Mehrheit bevorzugt Daressalaam als Wohnort für die nähere Zukunft, doch viele möchten im Alter ins Dorf zurückzukehren. Der Plan ist, Geld für den Hausbau zu verdienen, und dadurch im Kreis der Familie und gleichzeitig unabhängig leben zu können. Migration ist eine Strategie zur Verbesserung der Lebensbedingungen, Daressalaam ist der Ort 'zum Arbeiten aber nicht zum Leben'. SIND FRAUEN URBANER ALS MÄNNER? Die Situation ist paradox: die Land-Stadt-Wanderung von Frauen wird gleichzeitig besonders gefördert und verurteilt. Frauen haben mehr zu gewinnen, Einkommen und Unabhängigkeit, doch sie sehen das Stadtleben kritisch und kennen die Risiken. Selbst wenn es Verantwortung für die Versorgung der Familie ist, die Frauen aus dem Dorf treibt, werden sie in der Stadt nicht mit Respekt empfangen. Die massenweise Migration von Frauen wird unterschätzt, missverstanden und mit sozialen Problemen wie Prostitution gleichgesetzt. Dies erschwert auch die Rückwanderung. Für die Situation von Frauen in Tansania sowie die zukünftige Stadtentwicklung ist es wichtig, Migration als Streben nach Fortschritt und Teil einer städtischen Strategie zu verstehen
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Bilanzierung und Biomonitoring von Trifluoracetat und anderen Halogenacetaten
(2002)
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Eugen Christoph
- FCKW-Ersatzstoffe wie HFC 134a und die HCFC´s 123 und 124 sind teilhalogenierte Ethane. HFC 134a (1,1,1,2-Tetrafluorethan), zum Beispiel, hat eine atmosphärische Lebensdauer von etwa 15 Jahren. Es wird überwiegend in der Troposphäre bis zu 30% zu TFA abgebaut. TFA ist ökotoxikologisch von Bedeutung, selbst wenn seine Toxizität nur als relativ gering eingeschätzt wird, da es vollkommen persistent ist. Auch andere luftgetragene C2-Halogenkohlenwasserstoffe werden zu atmosphärischen halogenierten Essigsäuren abgebaut. Halogenacetatgehalte liegen in der globalen Atmosphäre im ppt-Bereich, im Regen im ppb-Bereich, und in höheren Pflanzen im unteren ppm-Bereich. Diese Konzentrationen liegen um ein Vielfaches höher als durch die bekannten Quellen erwartet werden könnte. Andere Quellen, seien sie anthropogenen, geologischen oder biologischen Ursprungs, müssen dafür in Betracht gezogen werden. Monofluor- (MFA), Monochlor- (MCA), Monobrom- (MBA) und Trichloracetat (TCA) sind für ihre relativ hohen Toxizitäten bekannt. Zur Bestimmung der Halogenacetat-Gehalte in verschiedenen Umwelt-kompartimenten, werden die Halogenacetate nach einer Flüssig/Flüssig-Extraktion zu Pentafluorphenylethylestern derivatisiert und mit GC-NCI-MS (Gaschromatographie gekoppelt an Massenspektrometrie mit Negativ-Ionen chemischer Ionisation) bestimmt. Zur sicheren Anwendung der vorhandenen Methode auf verschiedene Boden-Matrizes, wurde die Probenaufarbeitung und Spurenanalytik der Halogenacetate weiterentwickelt, indem nach Aufschluss und Auslaugen des Bodens eine Abfolge pH-abhängiger Flüssig/Flüssig-Verteilungen als Probenaufreinigungsschritte vorgeschaltet wurde. Zur Bilanzierung der Summe des gesamten TFA-Eintrages in Bayern, wurden von Oktober 1997 bis Juli 1999 Fichtennadel-Proben gesammelt und analysiert. Die Auswahl der Probenahmeorte erfolgte hinsichtlich ihrer klimatischen Eigenschaften und ihrer Entfernung zu vermuteten TFA-Quellen (Müllverbrennungsanlagen, Aluminiumhütten). Ergebnisse aus vorangegangenen Studien, dass TFA-Gehalte in Fichtennadeln in direkter Abhängigkeit zur örtlichen Besiedelungsdichte stehen, konnten bestätigt werden. Ein weiterer Anstieg der TFA-Gehalte in Fichtennadeln gegenüber früherern Studien war festzustellen. Die Gehalte der übrigen Halogenacetate blieben auf einem im Vergleich zu den 80er Jahren niedrigerem Niveau. Außerdem wurden Wasserproben von bayerischen Flüssen, Seen und Niederschlägen untersucht. Der Niederschlag hatte im Mittel einen TFA-Gehalt von 80 ng/L. Der Main erwies sich mit im Mittel 220 ng/L bei Aschaffenburg als der am höchsten mit TFA belastete Fluss in Bayern. Die anderen bayerischen Flüsse hatten im Mittel einen TFA-Gehalt von 110 ng/L. Die TFA-Bilanz in Bayern ergab zu 46% Stoffeintrag über nasse Deposition und 10% durch den Import mit Flusswasser. Die restlichen 44% Stoffeintrag wurden der direkten Einleitung von mit TFA kontaminierten Abwässern zugeschrieben. TFA-Pufferzonen in Bayern, wie Grundwasser und Biomasse, ergaben einen Anteil von jeweils 14% (Eintrag und Austrag) in Relation zu der Gesamtaustragsmenge durch den Export mit Flusswasser. Zur Überprüfung, ob TFA-Quellen mit der industriellen Dichte bestimmter Standorte korrelieren, wurde ein spezielles Monitoring-Programm zur TFA-Bestimmung in Schnee im Bereich Nürnberg-Fürth-Erlangen durchgeführt. Bis zu fünffach höhere TFA-Konzentrationen als in Proben von industriefernen Standorten wurden in Proben in der Nähe von Industriestandorten festgestellt, die zum Bereich Maschinenbau zählen. 1999 wurde in der Schweiz ein Monitoring an Koniferennadeln durchgeführt. Sehr hohe TFA-Gehalte (bis über 1900 ng/g) wurden bei Koniferen aus dem industriereichen Rhonetal bei Visp und Lens gefunden. Die Emissionen der in der Nähe gelegenen chemischen Industrie können zu diesen Gehaltsspitzen geführt haben. Die Gehalte der chlorierten Acetate lagen im Bereich derer in bayerischen Fichtennadeln. In Finnland wurde 1999 ein Monitoring an Kiefernnadeln durchgeführt. Die Gehalte der chlorierten Halogenacetate lagen grundsätzlich höher als die in bayerischen oder schweizerischen Koniferennadeln. Zu dieser Beobachtung gelangte man auch schon in früheren Studien. Verantwortlich dafür könnte ein höherer Gehalt an atmosphärischen Vorläufersubstanzen der Chloracetate aufgrund der klimatischen Bedingungen in Finnland sein. Zur Klärung der Frage ob TFA rein anthropogenen Ursprungs ist, wurden 1998/99 Tiefenprofile bezüglich des Alters und der TFA-Gehalte im Wasser des Mittelatlantik und des Antarktischen Ozeans bestimmt. Die Untersuchungen ergaben ein mit der Tiefe ansteigendes Altersprofil (von wenigen Jahren an der Oberfläche bis zu >60 Jahren in einer Tiefe von über 4000 m) und demgegenüber eine annähernd homogene Verteilung von TFA mit etwa 200 ng/L, also auch in Meereswasser, welches nicht unter anthropogenen Einfluss stand. Eine Hochrechnung auf die Weltmeere ergab 268 Millionen Tonnen TFA. Emissionen aus geologischen oder biologischen TFA-Quellen müssen über einen großen Zeitraum dazu geführt haben. Meerwasser des Mittelmeeres bei Milos wurde in unmittelbarer Umgebung von hydrothermalen Quellen mit Fluorid-Emissionen auf seine TFA-Gehalte analysiert, da diese als geologische Quellen für TFA denkbar wären. Es konnte keine Erhöhung der TFA-Gehalte durch die hydrothermale Aktivität nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich für TFA schließen, dass die Quellen der gefundenen Konzentrationen in der globalen Umwelt in zwei Kategorien eingeteilt werden können: (a) im Niederschlag, in Oberflächenwasser und in Koniferennadeln scheint TFA weitgehend aus anthropogenen Quellen wie Fluorpolymer-Thermolyse und Emissionen chemischer Industrie zu stammen, woran die Freisetzung von HFCs wahrscheinlich nur einen geringen Anteil hat; (b) im Wasser der Ozeane stammt es hauptsächlich von bis jetzt unbekannten natürlichen Quellen. TFA akkumuliert in den Ozeanen, die die letzten Senken dieser stark hydrophilen, vollkommen persistenten Chemikalie darstellen.
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In vitro-Selektion am lentiviralen Transaktivator-Protein aus HIV-1
(2002)
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Gesa Jonas
- In der vorliegenden Arbeit konnte für das lentivirale Transaktivatorprotein HIV-1-Tat ein ternäres Phagen-Display-System etabliert werden. Die Bindung von phagenpräsentiertem HIV-Tat an HIV-TAR-RNA erfolgt im Phagen-Display nur mit geringer Affinität. Durch die Erweiterung des Tat-TAR-Phagen-Displays mit dem zellulären Kofaktor Cyclin T1 konnte die Affinität und Spezifität der Bindung von HIV-Tat an HIV-TAR-RNA gesteigert werden. Somit konnte zum ersten Mal der in vitro und in vivo dokumentierte Einfluss eines Kofaktors in einem Phagen-Display-System reproduziert werden. Bereits durch erste funktionelle Tests des ternären Phagen-Display-Systems konnte gezeigt werden, dass der Verlust der basischen Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne von HIV-Tat keine negative Auswirkung auf die Wechselwirkung zwischen Cyclin T1 und HIV-Tat hat. Für die weitere Untersuchung der Rolle der Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne wurden voneinander unabhängige Tat-random-Bibliotheken konstruiert, in denen die Aminosäurepositionen R49, K50, K51, R52 bzw. die Aminosäurepositionen R53, R55, R56, R57 vollständig randomisiert wurden. Zusätzlich wurde eine Tat-C31S-random-Bibliothek basierend auf der Mutante Tat-C31S konstruiert, in der die Randomisierung an den Positionen R53, R55, R56, R57 erfolgte. Die Bibliotheken erwiesen sich mit einer Anzahl an unabhängigen Klonen zwischen 1,1 x 106 und 1,5 x106 als ausreichend divers für eine Selektion. Das Selektionssystem ermöglicht die Anreicherung von Tat-Varianten, die tatsächlich unter den gegebenen Selektionsbedingungen d.h. in Anwesenheit oder Abwesenheit von Cyclin T1 an TAR-RNA binden. Tat-wt wurde in keiner der Selektionen angereichert. Ebenso wurde keine Präferenz für basische Aminosäuren erhalten. Sie scheinen für die Bindung von HIV-Tat an TAR-RNA nicht notwendig zu sein. Alle selektierten Tat-Varianten besitzen die Fähigkeit, einen ternären Tat-TAR-Cyclin T1-Komplex auszubilden. Alle charakterisierten Tat-Varianten besitzen in vivo Transaktivierungsaktivität, die mit der Lokalisation der Tat-Variante in der Zelle korreliert ist. Tat-Varianten, die ausschließlich im Kern lokalisieren, weisen die größte Aktivität auf, während Tat-Varianten, die nur in geringem Maß in die Zelle gelangen auch nur eine geringe Aktivität aufweisen. Die Anhäufung von Argininen und Lysinen innerhalb eines Peptides übt keinen entgegengesetzten Selektionsdruck aus. Dies konnte durch die Selektion einer Ph.D.12-Peptidbibliothek nachgewiesen werden. Unter verschiedenen Selktionsbedingungen konnten Peptide selektiert werden, die mit verschiedenen Affinitäten und Spezifitäten TAR-RNA binden. Unter unspezifischen Bedingungen konnte ein Peptid mit einer großen Anzahl an basischen Aminosäuren gefunden werden, welches hochaffin aber unspezifisch an TAR-RNA bindet. Im Gegensatz dazu wurden unter spezifischen Bedingungen Peptide gefunden, die mit hoher Affinität spezifisch an TAR-RNA binden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein ternäres Phagen-Display-System für die Untersuchung von Protein-RNA Wechselwirkungen genutzt. Damit gelang es, Aufschluss über die Bedeutung der basischen Sequenzdomäne von HIV-1-Tat für die Bindung an TAR RNA zu erhalten.
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Regulation der Transkription durch das Ubiquitin/Proteasom-System
(2002)
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Michael Rape
- Ein Großteil eukaryontischer Proteine wird nach regulierter Modifikation mit Ubiquitin durch das 26S-Proteasom abgebaut. In wenigen bisher bekannten Fällen wird ein ubiquitiniertes Protein durch diese Protease zwar erkannt, jedoch nur teilweise degradiert. Diese regulierte Ubiquitin/Proteasom-abhängige Prozessierung (RUP) wurde bei den Transkriptionsfaktoren NF-kB aus Säugerzellen sowie SPT23 und MGA2 aus der Bäckerhefe S. cerevisiae beobachtet. In dieser Arbeit wurde zunächst der Mechanismus der proteasomalen Prozes-sierung des Transkriptionsfaktors SPT23 analysiert. SPT23 wird als integrales Mem-branprotein des Endoplasmatischen Retikulums synthetisiert. Dort wird es durch die Ubiquitin-Ligase RSP5 ubiquitiniert und durch das 26S-Proteasom in eine verkürzte 90kDa-Form prozessiert. Die proteasomale Prozessierung von SPT23 setzt die Ausbildung von Homodimeren voraus und resultiert in einem stabilen Komplex aus Prozessierungssubstrat (SPT23 p90) und Dimerisierungspartner (SPT23 p120). In diesem Komplex liegt SPT23 p90 als monoubiquitiniertes Protein vor und wird so durch die konservierte CDC48UFD1/NPL4-Segregase, die in dieser Arbeit für S. cerevisiae beschrieben wurde, erkannt. CDC48UFD1/NPL4 entwindet in einer ATP-abhängigen Reaktion den membranständigen Komplex und ermöglicht den Transport von SPT23 p90 in den Zellkern. Interessanterweise erkennt CDC48UFD1/NPL4 präferentiell ubiquitinierte Proteine und ist daher ein ubiquitin-selektives Enzym. SPT23 p90 kontrolliert die Transkription der D9-Fettsäuredesaturase OLE1. Es konnte gezeigt werden, daß die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors im Zellkern mit Hilfe des E4-Enzyms UFD2 erfolgt. Dieser Ubiquitinierungsfaktor fördert die Multiubiquitinierung von SPT23 p90 und führt es dem proteasomalen Abbau zu. Mit SPT23 p90 konnte damit das erste natürliche Substrat des E4-Enzyms UFD2 in S. cerevisiae identifiziert werden. Interessanterweise wird UFD2 mit dem Substrat und der Segregase CDC48 in einen ternären Komplex rekrutiert. In diesem Komplex kann CDC48 die Aktivität des Multiubiquitinierungsfaktors UFD2 regulieren. Die beobachteten Reaktionen sind von physiologischer Relevanz. Ist die durch UFD2 vermittelte Inaktivierung von SPT23 p90 gestört, können Zellen die OLE1-Transkription in Gegenwart ungesättigter Fettsäuren nicht reprimieren. Diese Produkte der von OLE1 katalysierten Reaktion sind dadurch für UFD2-Deletions-mutanten toxisch. Die vorgestellten Daten veranschaulichen, wie ein Transkriptionsfaktor mit Hilfe des Ubiquitin/Proteasom-Systems reguliert werden kann. Das bereits synthetisierte Protein kann durch Prozessierung und Mobilisierung schnell aktiviert werden, wobei gleichzeitig die Lebensdauer der aktiven Form begrenzt wird. Dies gibt der Hefezelle die Möglichkeit, sich effizient variablen Umweltbedingungen anzupassen.
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Di(imino)pyridin-Vanadium(III)komplexe als Katalysatoren für die homogene und heterogene Ethylenoligomerisation und -polymerisation
(2002)
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Stefan Gottfried
- Es wurden neue Di(imino)pyridin-Vanadium(III)-Komplexe und deren Struktur-Wirkungs-Beziehung für den Einsatz als Katalysatorvorstufen in der homogenen und heterogenen Umsetzung mit Ethen untersucht. Weiterhin wurden durch Alkylsubstituenten derivatisierte Vertreter dieses Komplextyps mit entsprechenden Metallocenkomplexen hinsichtlich der veränderten Polymerisationseigenschaften verglichen. Zum Abschluss wurde mit der Untersuchung der Katalysatormischungen eine mögliche Anwendung für die synthetisierten Verbindungen aufgezeigt. Alle synthetisierten Komplexe wurden auf ihre katalytische Anwendung in der homogenen und zum Teil in der heterogenen Ethenpolymerisation getestet. Die Di(imino)pyridin-Liganden wurden durch Kondensationsreaktion aus Diacetyl-pyridin und einem entsprechend substituierten Anilin synthetisiert. Die Komplexe wurden aus den synthetisierten Liganden und dem THF-Addukt des Vanadiumtrichlorids. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Substituenten am Anilinring direkten Einfluss auf die katalytische Aktivität und die gebildeten Produkte bei der Umsetzung mit Ethen haben. Man beobachtet, je nach Substitution, sowohl die Bildung von Polymer, als auch die Bildung von niedermolekularen Oligomeren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Größe und Natur des Substituenten Einfluss auf die Polymerisationsaktivität haben. Es wurde versucht mit physikalischen (Druck, Temperatur) und chemischen (Zusätze) Methoden die Selektivität der Katalysatoren zu erhöhen. Die durch die vorgestellten Katalysatorsysteme erhaltenen Oligomermischungen ent-halten vorwiegend (>97 %) 1-Olefine welche nach der Trennung als Comonomere für die Herstellung von LLDPE eingesetzt werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das Verhalten von Vanadiumkomplexen unter-sucht werden, die am Zentrallmetall substituiert sind. Diese Komplexe sollten mit analog substituierten Metallocenkomplexen verglichen werden. Der Vergleich der Aktivitäten der Vanadiumkomplexe zeigt, dass eine Umsetzung dieser Komplexe mit Benzylmagnesiumchlorid und Ethylmagnesiumchlorid immer zu einem Aktivitäts-verlust führt. Ein Vergleich der Oligomer-produkte dieser Reihe zeigt, dass keine großen Unterschiede innerhalb der Oligo-merverteilung vorliegen. Die anderen Vanadiumkomplexe weisen ebenfalls einen steigenden Aktivitätsverlust bei zunehmender Alkylierung auf. Umgekehrt verhält es sich bei den Metallocenkomplexen mit Alkylliganden. Eine zu-nehmende Alkylierung mit Benzylmagnesiumchlorid, Allylmagnesiumchlorid und Ethylmagnesiumchlorid führt zu einem Anwachsen der Aktivitäten. Der Kristallinitätsgrad wies fast alle Polymere der Vanadiumkomplexe als HDPE aus, wobei die Werte teilweise in den Grenzbereich von HDPE verschoben waren. Die untersuchten Polymere der Metallocenkomplexe sind durch den deutlich niedrigeren Kristallinitätsgrad als LDPE gekennzeichnet. Im dritten Teil sollte die Einsatzmöglichkeit eines Vanadium-Oligomerisierungs-katalysators in Kombination mit einem Metallocenkatalysators getestet werden. Es wurden verschiedenen Mischungsverhältnisse hergestellt und zur Polymerisation von Ethen verwendet. Die Untersuchungen der erhaltenen Polymere erwiesen sich dabei als sehr vielversprechend. Es konnte gezeigt werden, dass sich Kenngrössen wie Schmelzpunkt und Schmelzenthalpie im Vergleich zum Polyethylen, das mit reinem Metallocenkatalysator hergestellt wurde, merklich geändert haben. Des weiteren konnten durch Untersuchungen der Materialeigenschaften des Polymers sowie rheologische Untersuchungen Veränderungen im Verhalten der Polymere beobachtet werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine "in-situ" Co-polymerisation stattgefunden hat. Es konnte somit eine interessante Anwendungs-möglichkeit für die vorgestellten Vanadiumkatalysatoren gezeigt werden. Die große Vielfalt der Kombinationsmöglichkeiten legt gerade auf diesem Gebiet weitergehende Untersuchungen nahe.
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Diversity of geometrid moths in a montane rainforest in Ecuador
(2002)
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Gunnar Brehm
- The diversity of the very species-rich family of geometrid moths was investigated in a montane forest at the border of the Podocarpus National Park in southern Ecuador along an altitudinal gradient ranging from 1,040 m to 2,677 m above sea level. This study is part of a larger interdisciplinary project on diversity and functioning of a montane forest ecosystem. A total of 13,938 moths representing 1,010 species were sampled in light-traps at eleven elevational levels (two replicate sites each). Most species belonged to the subfamily Ennominae (500 sp.), followed by Larentiinae (391 sp.), Sterrhinae (58 sp.), Geometrinae (57 sp.), Oenochrominae (3 sp.), and Desmobatrinae (1 sp.). The study covers aspects of host-plant relationships, community structure, endemism, alpha-, beta-, and gamma-diversity. The role of different environmental factors as mechanisms for the diversity of the moths is discussed. Furthermore, methodological aspects of light-trap sampling, and selection of appropriate diversity measures and analytical tools are considered in this study.
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Funktion und Regulation von D- und E-Typ-Cyclin-Cdk-Komplexen während der Entwicklung von Drosophila
(2002)
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Claas Aiko Meyer
- In dem vorliegenden Dokument werden 3 Originalarbeiten (s. S. 35) zusammengefasst. Die Embryonalentwicklung eines Vielzellers beginnt im allgemeinen mit einer Pha-se exponentieller Zellproliferation. Anschließend erfolgt in den meisten Zellen ein Zellproliferationsarrest und die terminale Zelldifferenzierung. Hierbei muss das Ausmaß der Zellproliferation mit anderen Entwicklungsvorgängen wie Musterbil-dung und Wachstum abgestimmt werden. Der G1/S-Übergang im Zellzyklus ist ein wichtiger Kontrollpunkt für die Zellproliferation. Hier wird in der Zelle entschieden, ob die DNA in einer S-Phase repliziert und ein weiterer Zellteilungszyklus durchlaufen wird. Die Aktivität von Cyclin E-Cdk(Cyclin-dependent kinase)2-Proteinkomplexen ist essentiell für den Eintritt in die S-Phase. Umgekehrt erfordert der Austritt aus der Zellproliferation zum korrekten Zeitpunkt in der Entwicklung die Inaktivierung von Cyclin E-Cdk2-Komplexen. Es wird allgemein angenommen, dass Cyclin E-Cdk2-Komplexe durch Cyclin D-Cdk4-Komplexe reguliert werden. So phosphorylieren Cyclin D-abhängige Kina-sen das Retinoblastoma-Protein Rb, wodurch die Repression von Klasse I-Zielgenen des Rb-Signalwegs, wie Cyclin E, beendet wird. Anschließend kommt es infolge der Cyclin E-Aktivierung zur Hyperphosphorylierung von Rb durch Cyc-lin E-Cdk2-Komplexe. Dies bewirkt die Freisetzung und Aktivierung von E2F-Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von S-Phasen-Genen kontrollieren. Um die funktionelle Bedeutung von Cyclin D-Cdk4-Komplexen während der Entwicklung zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine Cdk4-Nullmutation in Drosophila melanogaster charakterisiert. Überraschenderweise entwickeln sich adulte Fliegen auch in Abwesenheit jeglicher Cdk4-Funktion. Cdk4-Mutanten sind allerdings von reduzierter Größe und eingeschränkter Fertilität. Cdk4 ist daher nicht essentiell für die Zellproliferation. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass Cyclin D-Cdk4-Komplexe eine wachstumsstimulatorische Funktion besitzen und für das Wachstum sowohl der einzelnen Zelle als auch des gesamten Organismus benötigt werden. Konditionale Überexpression von Cyclin D und Cdk4 zeigt, dass Cyclin D-Cdk4-Komplexe im Rb-Signalweg wirken und unabhängig von Cyclin E die Transkription von RnrS in physiologischer Stärke induzieren. RnrS kodiert für die kleine Untereinheit der Ribonukleotidreduktase und ist ein bekanntes Zielgen von E2F-Transkriptionsfaktoren. Die Überexpression von Cyclin D-Cdk4 in der embry-onalen Epidermis kann jedoch den rechtzeitigen Austritt aus dem Zellzyklus nicht verhindern. Cyclin D-Cdk4-Komplexe sind daher keine Entscheidungsträger über Ein- und Austritt aus der Zellproliferation. Im Gegensatz zu Cyclin D-Cdk4-Komplexen müssen Cyclin E-Cdk2-Komplexe inhibiert werden, um einen rechtzeitigen Zellproliferationsarrest sicher-zustellen. Für die rechtzeitige Inhibition wird beginnend in der G2-Phase vor der terminalen Mitose das dacapo(dap)-Gen exprimiert. DAP-Protein bindet an Cyclin E-Cdk2-Komplexe und inhibiert diese. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Mechanismen die embryonale Ex-pression von dap und damit den Austritt aus dem Zellzyklus steuern. Die Analyse verschiedener Mutanten hat gezeigt, dass dap-Expression auch unabhängig vom vollständigen Ablauf des Zellproliferationsprogramms direkt durch Zellschicksals-determinanten reguliert wird. Eine Analyse der genomischen 5´-Kontrollregion von dap mit Hilfe von Deletions- und Reporterkonstrukten ergab, dass die Expression von dap in verschiedenen Geweben durch unabhängige Enhancermodule gesteu-ert wird. An einem dieser Enhancer wirkt der HOX-Transkriptionsfaktor Abdominal B (ABD-B), der eine zentrale Bedeutung für die Spezifizierung von Entwicklungs-schicksalen besitzt. Die 5´-Kontrollregion von dap spielt daher eine wichtige Rolle bei der Koordination von Entwicklungschicksal und Zellproliferation.
