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Transformation einer argentinischen Sommerweizenvarietät (Triticum aestivum L.) durch Transfer eines Seneszenz-verzögernden Gens zur Verbesserung der Ertragsleistung
(2012)
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Eduardo Daniel Souza Canada
- Um den Seneszenz-Prozess der Weizenpflanze zu verzögern und so eine höhere Ertragsleistung zu erreichen, wurde eine bisher noch nicht übertragene Nutzgenkassette in eine argentinische Weizenvarietät (Triticum aestivum L.) eingebracht. Diese Nutzgenkassette besteht aus der proteincodierenden Region des Isopentenyltransferase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens und dem Seneszenz-spezifischen HvS40-Promotor aus Hordeum vulgare.
SCREENING VON WEIZEN-VARIETÄTEN
Die Kombination der Embryo-Entwicklungsstadien H und W mit den zwei 2,4-D Konzentrationen ergab vier verschiedene Bedingungen, denen alle 22 argentinischen Sommerweizenvarietäten ausgesetzt wurden. Insgesamt wurden 10091 unreife Embryonen getestet. Die besten Ergebnisse bei fünf von sechs der getesteten Parameter erbrachte die Kombination des Entwicklungsstadiums H und der Auxinkonzentration 1 mg 2,4-D /l medium. Die Induktion eines Scutellarkallus sowie die Regenerationsfähigkeit der unreifen Embryonen zur Pflanze waren vom Genotyp, vom Entwicklungsstadium und von der 2,4-D Konzentration im Medium abhängig.
TRANSFORMATION UND IN VITRO GEWEBEKULTUR DER EMBRYONEN DES WEIZENS
Für Klein Brujo konnte ein auf Partikelbeschusstechnik basierendes Transformationssystem etabliert werden.
Nach der Optimierung der Beschussbedingungen ergaben sich drei Variable, die für eine hohe Transformationseffizienz von Klein Brujo (10 % im besten Versuch) entscheidend waren: das Kallus-Induktionsmedium, die Vorkultur und das osmotische Behandlungsmedium.
Die neu etablierte Gewebekulturstrategie führte zu einer Verkürzung der in vitro Kulturdauer zwischen Embryonenpräparation und ex vitro Kultur. Die Verwendung von Phosphinothricin (PPT) als Selektionsmittel während der ex vitro Kultur minimierte die Anzahl falscher Positiver unter den überlebenden Pflanzen (Cotransformanten 97,4%). Allerdings ließen sich durch unabhängige Segregation keine Reporter- bzw. Selektionsgen-freien T1-Pflanzen kultivieren.
In allen T0-Regeneraten konnte über Southern blot-Analysen die proteincodierende Region des eingeführten ipt-Gens nachgewiesen werden (Genkopien zwischen 2 und 7). Das Konstrukt aus einem um 2 kb verkürzten HvS40-Promotor (welcher in dieser Arbeit neu konstruiert wurde) und dem ipt-Gen (pS40-IPT) wurde in Weizenblättern sowohl bei künstlich induzierter als auch bei natürlicher Seneszenz exprimiert. Dies wurde mittels RT-PCR der ipt-mRNA in T0- und T2-Pflanzen nachgewiesen.
PHYSIOLOGISCHE EFFEKTE DER ÜBERTRAGUNG DES IPT-GENS UND DER ERTRAGSLEISTUNG
Um einen Hinweis auf die Funktion des ipt-Gens zu bekommen wurde der Chlorophyll-Gehalt während der induzierten Seneszenz von voll entwickelten, abgeschnittenen Fahnenblättern von transgenen T1-Pflanzen gemessen. Bei fünf von den sechs untersuchenden Transgenen zeigte sich ein deutlich geringerer Chlorophyll-Verlust was auf die Aktivität des ipt-Gens und eine erhöhte Cytokininkonzentration hindeutet. Das Chl a/b-Verhältnis war höher als bei den Kontrollen, da das Chl a während der Seneszenz-Verzögerung langsamer als das Chl b abgebaut wird.
Der Gehalt der dominierenden Cytokinine und der O-Glucoside, wurde in seneszierenden Fahnenblättern von T1- und T2-Pfanzen der drei pS40-IPT Linien analysiert. Eine beinahe Verdopplung des Cytokinin-Gesamtgehaltes gegenüber der Azygoten konnte in Extrakten der seneszierenden Fahnenblätter nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der RT-PCR Analyse der transgenen Pflanzen zeigten eine höhere Expression des ipt-Gens während der Kornfüllungsphase verglichen mit der Anthese. Allerdings war der Cytokiningehalt in intakten Pflanzen trotz des Promoters aus Gerste nicht ausreichend, um eine deutliche Seneszenz-Verzögerung hervorzurufen. Dieser Effekt von ipt-Expression kann durch den schwachen Promotor oder durch eine partielle Fremdgenstilllegung des übertragenen Gens zustande gekommen sein.
Die homozygoten T2-Pflanzen der vier Klein Brujo-Linien wurden mit den entsprechenden azygoten Pflanzen verglichen. Bei der Sorte „Klein Brujo“ wurde in allen vier transgenen Linien keine deutlich sichtbare Seneszenz-Verzögerung sowohl während der sequenziellen Seneszenz der Blattorgane als auch während der monokarpischen Seneszenz der ganzen Pflanze festgestellt. Allerdings zeigten zwei Linien gegenüber den Azygoten bei den Parametern Körner pro Ähre, Korngewicht insgesamt sowie durchschnittliches Korngewicht höhere Ergebnisse. Die Steigerung der Kornanzahl wurde durch ein niedrigeres Korngewicht nicht aufgewogen. Es ist heutzutage allgemein akzeptiert, dass die Photosynthese der Ähre einen wichtigen Beitrag zum Kornertrag liefert. Die höhere Blattanzahl sowie die längere Lebenszeit der Fahnenblätter und Ähren der zwei homozygoten Linien könnte die bessere Versorgung ihrer Körner erklären. Neben einer Bestätigung der Expression des ipt-Gens könnte sowohl die Steigerung des Cytokinin-Gehalts in der Weizenähre als auch in Endosperm-Zellen des Weizenkorns eine weitere Erklärung für die bessere Ertragsleistung der zwei transgenen Linien sein. Denn es wurde gezeigt, dass Cytokinin die Kornanzahl steigert und die Kornentwicklung stimuliert, wenn es auf die Ähre oder auf die oberirdischen Teile der Weizenpflanze aufgetragen wird.
Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sollte versucht werden, eine Seneszenzverzögerung in den Blättern durch den Transfer des ipt-Gens unter Kontrolle des homologen Seneszenz-assoziierten Promotors zu erreichen, der aber nicht in Fahnenblatt aktiv ist. Dies könnte sich letztlich günstig auf das Ährenwachstum auswirken, so dass Ähren mit einer größeren Kornzahl und somit einem höheren Kornertrag entstehen würden.
