OPUS 4 | 570 Biowissenschaften; Biologie

Strukturelle Untersuchungen der Lck-Domänen unique und SH3 und ihre Wechselwirkungen mit zellulären und viralen Proteinen (2002)

Lars Briese

In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden amino-terminalen Domänen der Lymphocyten Spezifischen Kinase (unique- und SH3-Domäne, LckU3) mittels NMR-Spektroskopie in Lösung strukturell zu charakterisieren. Auf Basis dieser NMR-Untersuchungen war es möglich, die Wechselwirkungen von LckU3 mit verschiedenen Bindungspartnern auf atomarer Ebene zu verfolgen. Darüber hinaus wurden neue Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen dem HIV-1 Protein Nef und dem HIV Hauptrezeptor CD4 gewonnen. Die unique- und die SH3-Domäne der Lck wurden in E. coli exprimiert und anschließend gereinigt. Die Untersuchung von LckU3 mittels NMR-Spektroskopie zeigte, dass die unique-Domäne in wässriger Lösung unstrukturiert vorliegt. Für die SH3-Domäne wurde die dreidimensionale Struktur in Lösung mit hoher Präzision bestimmt. Mit Hilfe von 1H,15N-HSQC-Titrationsexperimenten konnten die Bindung eines durch Phagendisplay selektierten SH3-Liganden sowie die Interaktion von HIV-1 Nef mit der Lck SH3-Domäne nachgewiesen und diese charakterisiert werden. Ebenso wurde die zinkvermittelte Interaktion der Lck unique-Domäne mit der cytoplasmatischen CD4-Domäne gezeigt. Sowohl CD4 als auch die unique-Domäne binden spezifisch Zink mit einer Affinität, die eine optimale Regulation der Lck-CD4 Assoziation in der Zelle erlaubt. Mit Hilfe von Fluoreszenztitrationsmessungen wurde der KD der Lck-CD4 Interaktion auf 0,35 µM bestimmt. Darüber hinaus wurden experimentelle Bedingungen gefunden, die eine eingehende Charakterisierung des Lck-CD4 Komplexes ermöglichen werden. Die Untersuchung der Bindung von HIV-1 Nef an CD4 sowohl mit NMR- als auch fluoreszenzspektroskopischen Methoden zeigte, dass bislang unbeachtete Reste im N-terminalen Bereich des Nef-Proteins einen erheblichen Anteil an der CD4-Interaktion haben und die Affinität von Nef zu CD4 um etwa das 300fache erhöhen . Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, alle binären Interaktionen zwischen der Lymphocyten Spezifischen Kinase, dem Oberflächenrezeptor CD4 und dem HIV-1 Protein Nef eingehend zu untersuchen und zu charakterisieren. Da keine dieser Interaktionen kompetitiv sind, wurde die Existenz eines ternären Komplexes diskutiert.

Der Keimblattapoplast von Ricinus communis L. - Kinetische Wechselwirkungen zwischen der Substratkonzentration und dem Langstreckentransport (2002)

Heike Bauer-Ruckdeschel

Die stoffliche Zusammensetzung der Apoplastenlösung ist keine unabhängige Größe, sondern Ausgangspunkt und Ergebnis mehrerer in gegensätzliche Richtungen verlaufende Flüsse. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Nährstoffflüsse zwischen Blattapoplast, Blattgewebe, Phloem und Xylem nach Equilibrierung mit einer definierten apoplastischen Substratkonzentration zu messen und zu bilanzieren. Von Interesse waren die Elemente und Ionen Kohlenstoff (Saccharose), Stickstoff (Glutamin), Kalium, Phosphat und Sulfat. Als Versuchsobjekt diente der sechs Tage alte Keimling von Ricinus communis L.. Es kommt zu keiner Zirkulation von Saccharose über Phloem und Xylem. Die in den sink importierte Saccharose wird annähernd quantitativ verbraucht oder gespeichert. Auch der Xylemtransport der Hexosen Glukose und Fruktose erfolgt relativ unabhängig vom apoplastischen Angebot und spielt zu keiner Zeit eine entscheidende Rolle für die Ernährung der Pflanze. Externes Glutamin wird aktiv sowohl in den Keimblättern als auch im Phloem aufgenommen, jedoch mit unterschiedlichen Raten. Der Akkumulationsfaktor zwischen Exsudat und Medium zeigt, daß v.a. bei niedriger apoplastischer Konzentration der Fluß bevorzugt in den Ferntransport läuft. Es scheint, daß der/die Glutamincarrier am Phloem wesentlich aktiver sind als der/die Carrier am Mesophyll. Nur unter moderaten Mangelbedingungen fließt Glutamin in den Stoffwechsel der sink-Organe ein, ansonsten kommt es zu einer 1:1-Zirkulation über Phloem und Xylem. Nitrat wird bereits in der Wurzel größtenteils reduziert und nach Import in die Keimblätter erneut, vermutlich nach Aufnahme in spezielle Transfer-Zellen, über das Phloem exportiert. Kalium-Ionen haben einen entscheidenden Einfluß auf die Saccharosebeladung ins Phloem und den Volumenfluß dort. Sie scheinen sowohl aus dem Apoplasten als auch aus den Zellen der Keimblätter ins Phloem beladen zu werden, wobei die maximale Rate nicht sehr hoch ist (maximal 0,55 µMol x h-1 x Keimling-1). Bei Überangebot aus dem Xylem akkumuliert Kalium folglich in den Keimblättern. Die über das Phloem exportierten Kalium-Ionen werden kaum im sink festgelegt sondern zirkulieren (bis zu 80 %). Das Verhältnis Phosphat zu Phosphor insgesamt beträgt in den Keimblättern mit Endosperm 0,6, gleiches findet man im Siebröhrenexsudat wieder. Nach Transfer in phosphathaltiges Medium ist anteilig mehr Phosphat in den Keimblättern vorhanden, zusätzlich wird nun mengenmäßig mehr Phosphor über das Phloem exportiert. Nur ein Überangebot an externem, apoplastischem Phosphat verhindert einen Netto-Verlust von organisch-gebundenem Phosphor aus den Keimblättern. Eine Zirkulation von Phosphat zwischen Phloem und Xylem konnte zwar gefunden werden, jedoch ist sie in ihrem Ausmaß gering. Nach Angebot von Phosphat über die Wurzel kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der Phosphatflüsse im Xylem, aber zu keiner Phosphorakkumulation in den Keimblättern. Erfolgt die Phosphorzufuhr gleichzeitig über den Keimblattapoplasten und über die Wurzel sind die Massenflüsse in den Leitbahnen im Vergleich zu den Einzelinkubationen reduziert. Der Phosphattransport im Keimling wird somit hauptsächlich durch das Phosphatangebot an der Wurzel und den Phosphateintrag in die Wurzel (über das Phloem) bestimmt. Die Sulfataufnahme in die Keimblätter ist schon bei relativ geringen apoplastischen Konzentrationen maximal, anders verhält es sich mit der Phloembeladung. Dies läßt den Schluß zu, daß sich der/die Carrier an den Parenchymzellen (Mesophyll) in ihren Raten unterscheiden. 70 % der über das Phloem exportierten Sulfat-Ionen zirkulieren zwischen Phloem und Xylem. Die Sulfat-Assimilation scheint gleichzeitig in den Keimblättern und der Wurzel zu erfolgen. Dafür spricht auch die Feststellung, daß nach Angebot über die Wurzel der Xylemfluß und der Phloemfluß deutlich reduziert sind. Glutamin, Phosphat, Sulfat und Kalium-Ionen treten in weit höheren Konzentrationen in den Keimblättern auf als sie im Siebröhrenexsudat nachweisbar sind. Neben der apoplastischen scheint auch eine symplastische Phloembeladung dieser Substrate möglich. Um Hinweise über den Beladungsweg des Phloems zu gewinnen, wurde die Versorgung des Keimlings mit Substraten aus dem apoplastischen Raum zwischen dem Endosperm und der Unterseite der Keimblättern unterbrochen. Bleibt die Nachlieferung aus dem apoplastischen Raum und über die Wurzel aus, kommt es bei Kalium, Phosphat und Sulfat spätestens nach drei Tagen, trotz beträchtlicher intrazellulärer Gehalte, zum Erliegen der Netto-Translokation aus den Keimblättern. Dies läßt auf eine rein apoplastische Beladung des Phloems schließen. Stickstoffverbindungen werden weiterhin aus den Zellen des Phloems bzw. den Geweben entlang des Transportweges ins Phloem entlassen (symplastisch).

Kohlenstoffexport bei erhöhter CO2-Konzentration: Einfluss von Ammoniumnitratkonzentration und Wurzelraum auf Wachstum und Stoffwechsel bei Ricinus communis L. (2002)

Frank Keller

Im Hinblick auf die ständig zunehmende CO2-Konzentration in der Atmosphäre seit der Industrialisierung und vor dem Hintergrund der essentiellen Bedeutung, welche Kohlendioxid durch die Photosynthese für Pflanzen hat, ist es von besonderem Interesse, wie Pflanzen auf die erhöhte CO2-Konzentration, die in 30 Jahren etwa das Doppelte der heutigen betragen soll, bei verschiedenen Wachstumsbedingungen reagieren. Deswegen sollte in diesem Projekt, das innerhalb des DFG-Schwerpunktprogramms "Stoffwechsel und Wachstum der Pflanzen unter erhöhter CO2-Konzentration" durchgeführt wurde, der Klärung des Zusammenhangs des verstärkten und beschleunigten Wachstums von Pflanzen bei erhöhter [CO2] mit dem Kohlenstoffexport in Form von Assimilaten aus source-Blättern bei unterschiedlichen Anzuchtsbedingungen nachgegangen werden. Als Modellpflanze für die Experimente wurde Ricinus communis L. ausgewählt, weil bei dieser Pflanze der Inhalt der Siebröhren, in denen die Translokation der Assimilate innerhalb der Pflanze stattfindet, leicht gewonnen werden kann und so auch Aussagen über den Transport der exportierten Assimilate möglich sind. Die Verfügbarkeit des Hauptnährelements Stickstoff ist für das Wachstum und die Biomasseentwicklung der Pflanze maßgeblich. Auf Grund der engen Verknüpfung des Kohlenstoff- mit dem Stockstoffstoffwechsel wurden die Experimente mit vier verschiedenen Ammomiumnitratkonzentrationen (1, 3, 6 und 12 mM) bei 350 und 700 ppm [CO2] in Klimakammern, in die die Pflanzen im Alter von 12 Tagen überführt wurden, durchgeführt. Aus den Experimenten ergaben sich folgende Resultate: 1. Rizinuspflanzen können bei höherer Stickstoffkonzentration (6-12 mM NH4NO3) in der Nährlösung die erhöhte CO2-Konzentration bei den gegebenen Bedingungen besser für Wachstum, Entwicklung und Biomasseproduktion nützen als Pflanzen, die bei niedrigerer Stickstoffversorgung (1-3 mM NH4NO3) kultiviert wurden. Dabei sind Pflanzen in kleineren Töpfen zunächst im Vorteil, werden aber darin von den Pflanzen in größeren Töpfen in der zweiten Hälfte der Klimakammerperiode (ca. ab Tag 28-30) übertroffen. 2. Bei Rizinuspflanzen sind mit zunehmender Stickstoffkonzentration in der Nährlösung bei erhöhter CO2-Konzentration deutlich höhere Kohlenstoffexportraten pro source-Blattfläche zu finden. Diese sind v.a. auf die Exportraten im Licht zurückzuführen, welche maßgeblich durch die Nettophotosyntheseleistung bestimmt werden. Der Kohlenstoffexport in der Dunkelphase wird wesentlich durch den Abbau der transitorischen Stärke beeinflusst. Mit abnehmender Stickstoffversorgung wird zunehmend Stärke im Blattgewebe angehäuft. 3. Rizinuspflanzen weisen unabhängig von der Stickstoffkonzentration in der Nährlösung bei erhöhter CO2-Konzentration eine nicht oder nur sehr leicht erhöhte Saccharose-konzentration im Siebröhrenexsudat auf. Es findet keine Rezirkulation von Saccharose durch das Xylem statt. Aufgrund der größeren Blätter bei 700 ppm [CO2] im Vergleich zu 350 ppm [CO2] ist auch der Querschnitt der Petiolen vergrößert. Der prozentuale Anteil der Phloemfläche an der Fläche des Querschnitts bleibt nahezu konstant (ca. 6,5 %) und somit ergibt sich eine größere totale Fläche des Phloemgewebes bei 700 ppm [CO2]. Für Pflanzen, die bei 700 ppm [CO2] kultiviert wurden, konnte bei allen Bedingungen eine erhöhte Flussrate des exportierten Kohlenstoffs in der Lichtphase berechnet werden. Da die Saccharosekonzentration im Siebröhrenexsudat jedoch nicht deutlich erhöht ist, muss von einer höheren Flussgeschwindigkeit ausgegangen werden. 4. Rizinuspflanzen können mit zunehmender Stickstoffversorgung das erhöhte CO2-Angebot in der Atmosphäre besser nützen. Es resultieren eine bessere Stickstoffnutzungseffizienz der Photosynthese sowie gesteigerte Raten der Nitratassimilation, wodurch deren Produkte, Aminosäuren und Proteine, in erhöhtem Maß im Blattgewebe zu finden sind. Die niedrigeren Serin- und Glycingehalte lassen auf verminderte Photorespiration bei erhöhter CO2-Konzentration schließen. Die niedrigere Konzentration an Aminosäuren im Siebröhrenexsudat (bei vergleichbaren Exsudationsraten) unterstützt die Hypothese der erhöhten Flussgeschwindigkeit in den Siebröhren bei 700 ppm [CO2]. 5. Rizinuspflanzen verfügen bei erhöhter CO2-Konzentration über höhere Gehalte an Hauptnährelementen pro source-Blatt. Dabei sind die Gehalte von Kalzium, Kalium, Magnesium, Phosphor und Schwefel stark von der Stickstoffversorgung der Pflanzen abhängig. Bei den Elementen Kalzium, Kalium und Schwefel ist ferner noch festzustellen, dass bei hoher Stickstoffversorgung die Werte von Pflanzen mit geringerem Wurzelraum deutlich die Werte von Pflanzen mit ausreichendem Wurzelraum überschritten.

Behavior and Ecology of Wild Slow Lorises (Nycticebus coucang): Social Organization, Infant Care System, and Diet (2002)

Frank Wiens

In this thesis I describe the social organization, infant care system, and diet of the slow loris Nycticebus coucang, a nocturnal arboreal prosimian primate, in the Malaysian rainforest. Data collected are locational data obtained during 1,000 h of radio-tracking slow lorises, behavioral data from visually observing radio-collared individuals, morphometric data, and records on food remains from fecal analysis. Though close-range encounters were very rare, I observed slow lorises to form stable social units ('social groups') characterized by home range overlap and friendly interactions among members and nonoverlap between groups. Four groups were observed, each consisting of a single adult female, a single adult male and a varying number of younger individuals. Group composition, together with relatively small testis volume and natal dispersal occuring in both sexes, hints towards a monogamous mating system. In one case an extended family group formed by delayed dispersal of a primary pair's offspring. Friendly interactions among group members included allogrooming, following, alternate click-calls, and sleeping in contact. Yet, members did not engage in any co-operative behaviour of the types usually thought to be responsible for group formation in gregarious mammals. One important factor contributing to the sharing of space between slow lorises is probably that chances of successful dispersal are low. However, subtle benefits arising from the presence of conspecifics (allogrooming, transfer of information on food resources) may also be crucial for the formation or maintenance of slow loris spatial groups. The infant care system was also notable for the very low frequency of direct encounters between animals. Active maternal care seemed to be limited to carrying the young to the sleeping place and regular suckling, and grooming of the infant. Non-maternal infant care appeared to be restricted to occasional infant grooming and infant carrying. It has been suggested that young lorises depend on their mothers for information on diet and that they obtain this information by watching their mothers feeding or interacting directly with their mothers over food. I tested this hypothesis on a group including one infant and four older individuals. The infant of the focus group only took food items to the mouth which were also part of its social group's diet and showed concordance in the frequency of use of feeding sites with other members of its group. These results speak against diet learning by trial and error. They indicate that diet learning by infants probably does depend on information obtained from older conspecifics. However, the infant of the focus group was not involved in direct interactions with conspecifics over food and fed mostly alone. It was not within a distance where it could see older conspecifics feeding more often than expected from the configuration and utilization of the individuals` home ranges. When feeding in vicinity of other slow lorises the infant never looked at them. This suggests that, contrary to expectations, visual observation or direct interaction over food are not the mechanisms by which information on food resources is passed from older individuals to young, but that other ways of obtaining such information are used by immature wild slow lorises. The slow loris is a slow-moving animal known to have a very low basal metabolic rate relative to other eutherian species of its body mass. A slow pace of life has been causally linked to a low intake rate of usable energy due to a diet that (1) is generally low in energy, (2) is unpredictably periodically scarce, and (3) contains high amounts of toxins or digestion inhibitors. In order to assess whether the slow loris faces any of these three kinds of limitation in energy supply I studied its dietary habits by direct observations of feeding behavior and by fecal analysis. The diet was composed of five distinct types of food: floral nectar and nectar-producing parts, phloem sap, fruits, gums (another group of plant exudates), and arthropods. The largest proportion of feeding time was spent on phloem sap (34.9%), floral nectar and nectar-producing parts (31.7%), and fruits (22.5%). These food types should provide the slow lorises with high amounts of easily digestible sugars indicating that slow lorises did not face an energy-poor diet. Furthermore, I found no evidence for seasonal food shortages: dietary habits were indistinguishable between rainy- and dry seasons, even though most dry season data were collected during periods of extreme drought induced by the 1997-1998 El Nino Southern-Oscillation event. However, many genera of food plants are known to contain secondary compounds that are toxic or reduce digestibility. I suggest that low metabolism in slow lorises is at least partly related to the need to detoxify secondary compounds in high-energy plant diet.

(alpha)-Glucan-Phosphorylasen aus Weizen (Triticum aestivum L.) Isolierung, Charakterisierung und Analyse der Expression (2002)

Nicole Schupp

Pflanzliche a-Glucan-Phosphorylasen (EC 2.4.1.1) können Stärke sowohl synthetisieren als auch abbauen. In Blättern und Körnern des Weizen var. Star können drei Phosphorylaseformen (P1, P2 und P3) mittels nicht-denaturierender Elektrophorese im Glycogen-haltigen Polyacrylamidgel unterschieden werden. Zwei der Formen (P1 und P2) sind cytosolische Enzyme, jedoch hat nur P1 die den cytosolischen Phosphorylasen eigene hohe Bindungsaffinität zu verzweigten Polyglucanen. Die dritte Form (P3) ist plastidisch und zeigt die für diesen Typ typische höhere katalytische Affinität zu Maltooligosacchariden verglichen mit verzweigten Polyglucanen. In der vorliegenden Arbeit wurde die cytosolische Phosphorylase aus Weizen-blättern mittels einer Affinitätschromatographie an dem an Sepharose gekoppelten Aktivitätsinhibitor Cycloheptaamylose bis zur Homogenität gereinigt. Die Phosphory-lase besteht aus einem Polypeptid, das nach denaturierender Polyacryl-amidgelelektrophorese ein Molekulargewicht von ca. 92 kD aufweist. Sie hat eine spezifische phosphorolytische Aktivität von 57 U/mg Protein, was einer ca. 7000-fa-chen Anreicherung bei einer Ausbeute von 32 % entspricht. Da das Protein die bei-den Phosphorylaseformen P1 und P2 bildet, liegt es vermutlich in zwei verschiede-nen Formen vor, von denen eine eine Maskierung des Polyglucan-Bindungsbereichs aufweist. Die höchste Aktivität hat die cytosolische Weizen-Phosphorylase, wie andere cytosolische Phosphorylasen, sowohl in der abbauenden als auch in der synthetisierenden Reaktion mit großen, verzweigten Polyglucanen im Vergleich zu linearen Maltooligosacchariden als Substrat. Ihre katalytische Affinität zu Amylopektin ist in der abbauenden Reaktion ca. 30mal höher als zu Maltoheptaose, in der Synthesereaktion sogar ca. 150mal höher. Die Umsatzgeschwindigkeiten mit verschiedenen Glucanen als Substrat sind in der Synthesereaktion vier- bis sieben-mal höher als in der abbauenden Reaktion. Maltopentaose ist das kleinste Substrat, das abgebaut werden kann, während Maltotetraose als Primer für die Glu-cansynthese dienen kann. Das pH-Optimum der abbauenden Reaktion liegt mit pH 7,0 etwas höher als das der Synthesereaktion (pH 6,0). Reduzierende Agenzien haben keinen Einfluss auf die Aktivitäten der cytosolischen Phosphorylase. Gegen das Protein der cytosolischen Phosphorylase wurden polyklonale Antikör-per hergestellt. Sie reagierten mit der gereinigten cytosolischen Phosphorylase und entsprechend großen Polypeptiden in Weizenextrakten, nicht aber mit Proteinen von Extrakten, die nur plastidische Phosphorylase enthielten. In hoher Konzentration re-agierte das Serum im Westernblot-Verfahren auch mit anderen Proteinen von Wei-zenextrakten, schien aber in geeigneter Verdünnung spezifisch für die cytosolische Phosphorylase zu sein. Aus einer cDNA-Bank aus jungen Weizenblättern wurde die cDNA einer cytosoli-schen Phosphorylase kloniert. Das erste Methionin (Met 20) der abgeleiteten Amino-säuresequenz des von Anfang an offenen Leserasters der cDNA stellt mit höchstwahrscheinlich den Translationsstart dar. Auch nach Verlängerung des 5´-Endes um 87 Basen in 5´-Richtung konnte kein Stoppcodon, aber auch kein weiteres Methionincodon entdeckt werden. Eine cDNA einer plastidischen Phosphorylase konnte nicht aus der Blatt-cDNA-Bank isoliert werden, aber aus einer cDNA-Bank aus Endosperm einer anderen Weizensorte. Die Sequenzen der beiden cDNAs dienten zur Herstellung spezifischer Primer, mit denen Fragmente von Phosphorylase-cDNAs aus Blättern und Körnern des Weizen var. Star amplifiziert werden konnten. Durch RACE konnten mit anhand dieser Fragmente hergestellten Primern cDNAs einer cytosolischen Phosphorylase aus Körnern und je zweier plastidischer Phosphorylasen aus Blättern und Körnern amplifiziert werden, die nur an den 5´-Enden noch vervollständigt werden müssen. In Blättern ist die Aktivität der cytosolischen Phosphorylase weitgehend auf junge, stark wachsende Primärblätter beschränkt. In Körnern wird sie während der späten Kornentwicklung höchstwahrscheinlich im Embryo gebildet und bleibt dort aktiv während der Keimung. Somit könnte die cytosolische Phosphorylase wichtig für die Aufrechterhaltung eines cytosolischen Glucose-1-Phosphatpools in Geweben sein, die massiv antransportierte Reservestärke-Abbauprodukte für das Wachstum des Keimlings verarbeiten müssen. Die Aktivität der plastidischen Phosphorylase bleibt langfristig in ausgewachsenen Blättern erhalten. Sie ist vermutlich am Metabolismus der transitorischen Stärke dieser Blätter beteiligt, zeigt aber keine diurnale Aktivitätsschwankung. Eine transient hohe Aktivität zeigte die plastidische Phosphorylase ebenfalls beim Einsetzen massiver Stärkesynthese im sich ent-wickelnden Korn. Da auch das Expressionsmuster ihres Transkripts dem der Stärke-synthetisierenden Enzyme ADP-Glucose-Pyrophosphorylase und Stärkesynthase ähnelt, spielt die plastidische Phosphorylase möglicherweise eine Rolle bei der Initi-ierung der Synthese von Reservestärke

Populationsökologische Untersuchungen zur Spargelfliege (Platyparea poeciloptera) und Zwiebelfliege (Delia antiqua) unter besonderer Berücksichtigung des Einsatzes von Simulationsmodellen im Integrierten Pflanzenschutz (2002)

Mathias Otto

Spargelfliege (Plioreocepta poeciloptera, Syn.: Platyparea poeciloptera; Diptera: Tephritidae) und Zwiebelfliege (Delia antiqua; Diptera: Anthomyidae) sind durch den Fraß ihrer Larven Schädlinge in Spargel- (Asparagus officinalis) bzw. Zwiebelkulturen (Allium spp.). In der vor-liegenden Arbeit wurde die Populationsökologie beider Schadfliegen untersucht und die Er-gebnisse in ein Konzept für den Integrierten Pflanzenschutz (IPM) umgesetzt. Als Teil des IPM-Ansatzes wurde ein Simulationsmodell zur Populationsdynamik erstellt. Entwicklungsgeschwindigkeit, Lebensdauer, Fekundität und Ressourcennutzung beider Arten wurden unter Labor- und Freilandbedingungen untersucht. Die zur Befallskontrolle entwickelten Methoden basieren auf dem Nachweis der Pupalstadien und sind in der Praxis anwendbar. Spargelfliege P. poeciloptera Die hohe Bindung aller Entwicklungsstadien von P. poeciloptera an die Wirtspflanze, der univoltine Lebenszyklus und die relativ kurze adulte Lebensdauer (ca. 20 Tage) entsprechen der von Zwölfer (1983) aufgestellten IIIb-Strategie zur ökologischen Klassifizierung von Bohrfliegen. Spargelfliegen erwiesen sich in Versuchen als sehr ortsfest. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigen, daß der Flug von Spargelfliegen - im Ge-gensatz zu den meisten anderen Schadfliegen - nicht mittels Klebetafeln oder Wasserfallen erfaßt werden kann. Lediglich Stabfallen erwiesen sich als attraktiv für P. poeciloptera. In weiteren Versuchen wurde das Fallendesign der Stableimfallen optimiert (Farbe, Dicke, Länge und Aufstellwinkel). Grüne Stableimfallen (grasgrün; Höhe 400 mm; Durchmesser 25 mm) stel-len eine sehr effektive Fangmethode für P. poeciloptera dar. Die Anzahl gefangener Fliegen mit diesen Fallen war stark mit dem Prozentsatz befallener Pflanzen korreliert. Die vorliegende Arbeit liefert erstmals detaillierte Daten zum Flugverlauf von P. poeciloptera. Adulte P. poeciloptera wurden von Mitte April bis Anfang August (Flugspitzen: Mai, Juni und Juli) nachgewiesen. Die Dauer der Flugperiode kann dabei sehr ausgedehnt sein, und betrug im Einzelfall bis zu 132 Tage. Der Flugverlauf variierte stark innerhalb der Regionen und korre-lierte mit dem Anlagenalter. Im Vergleich zu Altanlagen (> 4. Pflanzjahr) konnte in Junganlagen (2. und 3. Pflanzjahr) ein deutlich verfrühter Flugverlauf beobachtet werden. Schlupfversuche unter Labor- und Freilandbedingungen mit überwinterten Puppen belegen, daß der im Feld beobachtete Flugverlauf durch einen stark gestreuten Schlupf der Spargel-fliegen zustande kommt. Befallszeitpunkt (Eiablage) und Schlupf im Folgejahr sind positiv mitei-nander korreliert. Dieser Befund erklärt den beobachteten früheren Schlupf von P. poeciloptera aus Junganlagen, da diese nicht oder lediglich kurz beerntet werden und damit eher von P. poeciloptera befallen werden können als Altanlagen. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit wurde ein alternatives Bekämpfungskonzept ge-gen P. poeciloptera entwickelt, das auf Routinespritzungen verzichtet und Insektizidapplika-tionen vom Befallsgrad des Vorjahrs und dem aktuellen Flugaufkommen abhängig macht. Zwiebelfliege D. antiqua Anhand von Laborversuchen wurde die temperaturabhängige Entwicklungsdauer aller Stadien von D. antiqua ermittelt, und in ein Simulationsmodell zur Populationsdynamik überführt. Die Struktur des Modells entspricht einem erweiterten Leslie-Modell (Söndgerath 1987; Söndgerath & Richter 1990) und baut auf zwei existierenden Simulationsmodellen für D. radicum und Psila rosae auf, die bereits als Expertensysteme im Pflanzenschutz eingesetzt werden. Erwartungsgemäß werden in den kommenden Jahren weitere Tests und eine Feinanpassung des Modells für D. antiqua erforderlich sein. Aus diesem Grund wurde das Modell Anfang des Jahres 2000 in PASO (Prognose Agrarischer Schadorganismen) integriert, das über die Zen-trale der Pflanzenschutzdienste für computergestützte Entscheidungshilfen (ZEPP, Mainz) ver-fügbar ist. Das Zwiebelfliegenmodell steht somit den Pflanzenschutzdienststellen zur Evaluierung und Nutzung zur Verfügung. Der Flugverlauf von D. antiqua wurde in kommerziellen Schnittlauchfeldern untersucht. Zwie-belfliegen bilden in Deutschland i.d.R. drei Generationen aus. Sowohl Wasserschalen als auch Klebetafeln eignen sich zum Fang von D. antiqua. Von den drei im Feld getesteten Fallenfarben erwiesen sich Weiß und Blau attraktiver für D. antiqua als Gelb. Untersuchungen an Zuchten im Freilandinsektarium weisen darauf hin, daß die Entwicklung der zweiten und dritten Generation bei hohen Temperaturen durch eine Sommerruhe (Aestivation) unterbrochen werden kann. Die Versuche weisen auf eine mögliche Kopplung von Sommer- und Winterdormanz hin.

In vitro-Selektion am lentiviralen Transaktivator-Protein aus HIV-1 (2002)

Gesa Jonas

In der vorliegenden Arbeit konnte für das lentivirale Transaktivatorprotein HIV-1-Tat ein ternäres Phagen-Display-System etabliert werden. Die Bindung von phagenpräsentiertem HIV-Tat an HIV-TAR-RNA erfolgt im Phagen-Display nur mit geringer Affinität. Durch die Erweiterung des Tat-TAR-Phagen-Displays mit dem zellulären Kofaktor Cyclin T1 konnte die Affinität und Spezifität der Bindung von HIV-Tat an HIV-TAR-RNA gesteigert werden. Somit konnte zum ersten Mal der in vitro und in vivo dokumentierte Einfluss eines Kofaktors in einem Phagen-Display-System reproduziert werden. Bereits durch erste funktionelle Tests des ternären Phagen-Display-Systems konnte gezeigt werden, dass der Verlust der basischen Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne von HIV-Tat keine negative Auswirkung auf die Wechselwirkung zwischen Cyclin T1 und HIV-Tat hat. Für die weitere Untersuchung der Rolle der Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne wurden voneinander unabhängige Tat-random-Bibliotheken konstruiert, in denen die Aminosäurepositionen R49, K50, K51, R52 bzw. die Aminosäurepositionen R53, R55, R56, R57 vollständig randomisiert wurden. Zusätzlich wurde eine Tat-C31S-random-Bibliothek basierend auf der Mutante Tat-C31S konstruiert, in der die Randomisierung an den Positionen R53, R55, R56, R57 erfolgte. Die Bibliotheken erwiesen sich mit einer Anzahl an unabhängigen Klonen zwischen 1,1 x 106 und 1,5 x106 als ausreichend divers für eine Selektion. Das Selektionssystem ermöglicht die Anreicherung von Tat-Varianten, die tatsächlich unter den gegebenen Selektionsbedingungen d.h. in Anwesenheit oder Abwesenheit von Cyclin T1 an TAR-RNA binden. Tat-wt wurde in keiner der Selektionen angereichert. Ebenso wurde keine Präferenz für basische Aminosäuren erhalten. Sie scheinen für die Bindung von HIV-Tat an TAR-RNA nicht notwendig zu sein. Alle selektierten Tat-Varianten besitzen die Fähigkeit, einen ternären Tat-TAR-Cyclin T1-Komplex auszubilden. Alle charakterisierten Tat-Varianten besitzen in vivo Transaktivierungsaktivität, die mit der Lokalisation der Tat-Variante in der Zelle korreliert ist. Tat-Varianten, die ausschließlich im Kern lokalisieren, weisen die größte Aktivität auf, während Tat-Varianten, die nur in geringem Maß in die Zelle gelangen auch nur eine geringe Aktivität aufweisen. Die Anhäufung von Argininen und Lysinen innerhalb eines Peptides übt keinen entgegengesetzten Selektionsdruck aus. Dies konnte durch die Selektion einer Ph.D.12-Peptidbibliothek nachgewiesen werden. Unter verschiedenen Selktionsbedingungen konnten Peptide selektiert werden, die mit verschiedenen Affinitäten und Spezifitäten TAR-RNA binden. Unter unspezifischen Bedingungen konnte ein Peptid mit einer großen Anzahl an basischen Aminosäuren gefunden werden, welches hochaffin aber unspezifisch an TAR-RNA bindet. Im Gegensatz dazu wurden unter spezifischen Bedingungen Peptide gefunden, die mit hoher Affinität spezifisch an TAR-RNA binden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein ternäres Phagen-Display-System für die Untersuchung von Protein-RNA Wechselwirkungen genutzt. Damit gelang es, Aufschluss über die Bedeutung der basischen Sequenzdomäne von HIV-1-Tat für die Bindung an TAR RNA zu erhalten.

Regulation der Transkription durch das Ubiquitin/Proteasom-System (2002)

Michael Rape

Ein Großteil eukaryontischer Proteine wird nach regulierter Modifikation mit Ubiquitin durch das 26S-Proteasom abgebaut. In wenigen bisher bekannten Fällen wird ein ubiquitiniertes Protein durch diese Protease zwar erkannt, jedoch nur teilweise degradiert. Diese regulierte Ubiquitin/Proteasom-abhängige Prozessierung (RUP) wurde bei den Transkriptionsfaktoren NF-kB aus Säugerzellen sowie SPT23 und MGA2 aus der Bäckerhefe S. cerevisiae beobachtet. In dieser Arbeit wurde zunächst der Mechanismus der proteasomalen Prozes-sierung des Transkriptionsfaktors SPT23 analysiert. SPT23 wird als integrales Mem-branprotein des Endoplasmatischen Retikulums synthetisiert. Dort wird es durch die Ubiquitin-Ligase RSP5 ubiquitiniert und durch das 26S-Proteasom in eine verkürzte 90kDa-Form prozessiert. Die proteasomale Prozessierung von SPT23 setzt die Ausbildung von Homodimeren voraus und resultiert in einem stabilen Komplex aus Prozessierungssubstrat (SPT23 p90) und Dimerisierungspartner (SPT23 p120). In diesem Komplex liegt SPT23 p90 als monoubiquitiniertes Protein vor und wird so durch die konservierte CDC48UFD1/NPL4-Segregase, die in dieser Arbeit für S. cerevisiae beschrieben wurde, erkannt. CDC48UFD1/NPL4 entwindet in einer ATP-abhängigen Reaktion den membranständigen Komplex und ermöglicht den Transport von SPT23 p90 in den Zellkern. Interessanterweise erkennt CDC48UFD1/NPL4 präferentiell ubiquitinierte Proteine und ist daher ein ubiquitin-selektives Enzym. SPT23 p90 kontrolliert die Transkription der D9-Fettsäuredesaturase OLE1. Es konnte gezeigt werden, daß die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors im Zellkern mit Hilfe des E4-Enzyms UFD2 erfolgt. Dieser Ubiquitinierungsfaktor fördert die Multiubiquitinierung von SPT23 p90 und führt es dem proteasomalen Abbau zu. Mit SPT23 p90 konnte damit das erste natürliche Substrat des E4-Enzyms UFD2 in S. cerevisiae identifiziert werden. Interessanterweise wird UFD2 mit dem Substrat und der Segregase CDC48 in einen ternären Komplex rekrutiert. In diesem Komplex kann CDC48 die Aktivität des Multiubiquitinierungsfaktors UFD2 regulieren. Die beobachteten Reaktionen sind von physiologischer Relevanz. Ist die durch UFD2 vermittelte Inaktivierung von SPT23 p90 gestört, können Zellen die OLE1-Transkription in Gegenwart ungesättigter Fettsäuren nicht reprimieren. Diese Produkte der von OLE1 katalysierten Reaktion sind dadurch für UFD2-Deletions-mutanten toxisch. Die vorgestellten Daten veranschaulichen, wie ein Transkriptionsfaktor mit Hilfe des Ubiquitin/Proteasom-Systems reguliert werden kann. Das bereits synthetisierte Protein kann durch Prozessierung und Mobilisierung schnell aktiviert werden, wobei gleichzeitig die Lebensdauer der aktiven Form begrenzt wird. Dies gibt der Hefezelle die Möglichkeit, sich effizient variablen Umweltbedingungen anzupassen.

Diversity of geometrid moths in a montane rainforest in Ecuador (2002)

Gunnar Brehm

The diversity of the very species-rich family of geometrid moths was investigated in a montane forest at the border of the Podocarpus National Park in southern Ecuador along an altitudinal gradient ranging from 1,040 m to 2,677 m above sea level. This study is part of a larger interdisciplinary project on diversity and functioning of a montane forest ecosystem. A total of 13,938 moths representing 1,010 species were sampled in light-traps at eleven elevational levels (two replicate sites each). Most species belonged to the subfamily Ennominae (500 sp.), followed by Larentiinae (391 sp.), Sterrhinae (58 sp.), Geometrinae (57 sp.), Oenochrominae (3 sp.), and Desmobatrinae (1 sp.). The study covers aspects of host-plant relationships, community structure, endemism, alpha-, beta-, and gamma-diversity. The role of different environmental factors as mechanisms for the diversity of the moths is discussed. Furthermore, methodological aspects of light-trap sampling, and selection of appropriate diversity measures and analytical tools are considered in this study.

Funktion und Regulation von D- und E-Typ-Cyclin-Cdk-Komplexen während der Entwicklung von Drosophila (2002)

Claas Aiko Meyer

In dem vorliegenden Dokument werden 3 Originalarbeiten (s. S. 35) zusammengefasst. Die Embryonalentwicklung eines Vielzellers beginnt im allgemeinen mit einer Pha-se exponentieller Zellproliferation. Anschließend erfolgt in den meisten Zellen ein Zellproliferationsarrest und die terminale Zelldifferenzierung. Hierbei muss das Ausmaß der Zellproliferation mit anderen Entwicklungsvorgängen wie Musterbil-dung und Wachstum abgestimmt werden. Der G1/S-Übergang im Zellzyklus ist ein wichtiger Kontrollpunkt für die Zellproliferation. Hier wird in der Zelle entschieden, ob die DNA in einer S-Phase repliziert und ein weiterer Zellteilungszyklus durchlaufen wird. Die Aktivität von Cyclin E-Cdk(Cyclin-dependent kinase)2-Proteinkomplexen ist essentiell für den Eintritt in die S-Phase. Umgekehrt erfordert der Austritt aus der Zellproliferation zum korrekten Zeitpunkt in der Entwicklung die Inaktivierung von Cyclin E-Cdk2-Komplexen. Es wird allgemein angenommen, dass Cyclin E-Cdk2-Komplexe durch Cyclin D-Cdk4-Komplexe reguliert werden. So phosphorylieren Cyclin D-abhängige Kina-sen das Retinoblastoma-Protein Rb, wodurch die Repression von Klasse I-Zielgenen des Rb-Signalwegs, wie Cyclin E, beendet wird. Anschließend kommt es infolge der Cyclin E-Aktivierung zur Hyperphosphorylierung von Rb durch Cyc-lin E-Cdk2-Komplexe. Dies bewirkt die Freisetzung und Aktivierung von E2F-Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von S-Phasen-Genen kontrollieren. Um die funktionelle Bedeutung von Cyclin D-Cdk4-Komplexen während der Entwicklung zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine Cdk4-Nullmutation in Drosophila melanogaster charakterisiert. Überraschenderweise entwickeln sich adulte Fliegen auch in Abwesenheit jeglicher Cdk4-Funktion. Cdk4-Mutanten sind allerdings von reduzierter Größe und eingeschränkter Fertilität. Cdk4 ist daher nicht essentiell für die Zellproliferation. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass Cyclin D-Cdk4-Komplexe eine wachstumsstimulatorische Funktion besitzen und für das Wachstum sowohl der einzelnen Zelle als auch des gesamten Organismus benötigt werden. Konditionale Überexpression von Cyclin D und Cdk4 zeigt, dass Cyclin D-Cdk4-Komplexe im Rb-Signalweg wirken und unabhängig von Cyclin E die Transkription von RnrS in physiologischer Stärke induzieren. RnrS kodiert für die kleine Untereinheit der Ribonukleotidreduktase und ist ein bekanntes Zielgen von E2F-Transkriptionsfaktoren. Die Überexpression von Cyclin D-Cdk4 in der embry-onalen Epidermis kann jedoch den rechtzeitigen Austritt aus dem Zellzyklus nicht verhindern. Cyclin D-Cdk4-Komplexe sind daher keine Entscheidungsträger über Ein- und Austritt aus der Zellproliferation. Im Gegensatz zu Cyclin D-Cdk4-Komplexen müssen Cyclin E-Cdk2-Komplexe inhibiert werden, um einen rechtzeitigen Zellproliferationsarrest sicher-zustellen. Für die rechtzeitige Inhibition wird beginnend in der G2-Phase vor der terminalen Mitose das dacapo(dap)-Gen exprimiert. DAP-Protein bindet an Cyclin E-Cdk2-Komplexe und inhibiert diese. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Mechanismen die embryonale Ex-pression von dap und damit den Austritt aus dem Zellzyklus steuern. Die Analyse verschiedener Mutanten hat gezeigt, dass dap-Expression auch unabhängig vom vollständigen Ablauf des Zellproliferationsprogramms direkt durch Zellschicksals-determinanten reguliert wird. Eine Analyse der genomischen 5´-Kontrollregion von dap mit Hilfe von Deletions- und Reporterkonstrukten ergab, dass die Expression von dap in verschiedenen Geweben durch unabhängige Enhancermodule gesteu-ert wird. An einem dieser Enhancer wirkt der HOX-Transkriptionsfaktor Abdominal B (ABD-B), der eine zentrale Bedeutung für die Spezifizierung von Entwicklungs-schicksalen besitzt. Die 5´-Kontrollregion von dap spielt daher eine wichtige Rolle bei der Koordination von Entwicklungschicksal und Zellproliferation.

570 Biowissenschaften; Biologie

Refine

Author

Year of publication

Document Type

Language

Keywords

Institute

129 search hits