500 Naturwissenschaften und Mathematik
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Entwicklung eines Sulfolobus-E. coli Shuttle-Vektors basierend auf dem Plasmid pRN1
(2007)
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Silvia Berkner
- Sulfolobus spp., ein Vertreter der thermoacidophilen Crenarchaeota, ist auf dem Weg sich als wichtiger archaealer Modellorganismus zu etablieren. Aufgrund seiner Wachstumsbedingungen von 75-80 °C bei pH 3-3,5 ist Sulfolobus biotechnologisch ebenfalls von hoher Bedeutung, da seine Enzyme thermostabil und, im Fall von sekretierten Enzymen, auch säurestabil sind. Bisher waren jedoch in vivo-Experimente in Sulfolobus nur schwierig durchzuführen, da trotz jahrelanger Bemühungen nur wenige genetische Systeme zur Verfügung standen, die außerdem Probleme hinsichtlich ihrer reproduzierbaren Anwendbarkeit aufwiesen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, einen kleinen, episomalen, einfach zu handhabenden Sulfolobus-Escherichia coli Shuttle-Vektor zu entwickeln. Zur Konstruktion eines Sulfolobus-E. coli Shuttle-Vektors wird ein E. coli-Replikon mit selektivem Marker, ein Sulfolobus-Replikon und ein selektiver Marker für Sulfolobus benötigt. Zu Beginn der Arbeiten unklar war, welcher Faktor entscheidend für die Etablierung verlässlicher Vektoren sein würde. Daher wurden, ausgehend von einer breiten, gut charakterisierten Auswahl verschiedener Shuttle-Konstrukte, möglicher selektiver Marker und potentieller Rezipientenstämme, optimale Kombinationen identifiziert. Als Sulfolobus-Replikon wurde das kryptische Plasmid pRN1 aus Sulfolobus islandicus REN1H1 gewählt, da es eine geringe Größe von 5,4 kb und eine geeignete Kopienzahl von 2-23 Plasmiden pro Zelle aufweist, sowie das am besten untersuchte crenarchaeale Plasmid ist. Auf dem Plasmid befinden sich drei konservierte offene Leseraster, die für das multifunktionelle Replikationsprotein Orf904 und die zwei sequenzspezifisch DNA-bindenden Proteine Orf56 und Orf80 codieren. Über den Replikationsmechanismus oder den Replikationsursprung des Plasmides ist jedoch nichts bekannt. Um die Funktionsweise des Plasmides pRN1 besser zu verstehen, wurde die Transkription des Plasmides untersucht. Dadurch sollten auch Hinweise auf essentielle Regionen bzw. mögliche Unterbrechungsstellen zur Shuttle-Vektorkonstruktion gewonnen werden. Es wurden fünf Transkripte im Bereich der offenen Leseraster kartiert. Erste Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen zur Kopienzahlkontrolle von pRN1 wurden durch die quantitative Bestimmung des Verlaufs der Transkriptanzahlen pro Zelle während verschiedener Wachstumsphasen und die Untersuchung der Stabilität der Transkripte gewonnen. In in vivo-Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Protein Orf56 als Transkriptionsrepressor wirkt und somit die Transkription des Replikationsoperons reguliert. Das Replikationsoperon orf56/orf904 wurde als essentiell zur Shuttle-Vektorkonstruktion eingestuft. Um möglichst viele gleichmäßig über den restlichen Teil des Plasmides verteilte Unterbrechungsstellen zur Vektorkonstruktion zu erhalten, wurde eine Transposon-basierte Bibliothek erstellt, aus der 13 Konstrukte ausgewählt wurden. Eine effiziente Selektion wurde durch die Verwendung uracilauxotropher, pyrEF-defizienter Mutanten erreicht. Daher wurden uracilauxotrophe Mutanten als potentielle Rezipientenstämme isoliert und phänotypisch, genotypisch und hinsichtlich ihrer Reversionsfrequenzen untersucht. Die funktionsfähigen pyrEF-Gene aus Sulfolobus solfataricus P2, codierend für Enzyme des Uridinmonophosphat-Syntheseweges, wurden als selektiver Marker zur Uracil-Selektion in die 13 verschiedenen pRN1-Unterbrechungskonstrukte integriert. Die verschiedenen potentiellen Shuttle-Vektorkonstrukte wurden in die sechs zur Verfügung stehenden uracilauxotrophen Rezipienten transformiert. 11 der 13 Vektorkonstrukte replizierten stabil in der Sulfolobus acidocaldarius pyrE-Deletionsmutante MR31 unter Uracil-Selektion. Die Vektoren zeigten Kopienzahlen von 2-8 Plasmiden pro Zelle in Sulfolobus, rekombinierten nicht und integrierten auch nicht in das Wirtschromosom. Sie waren in E. coli stabil und erlaubten eine einfache Klonierung zusätzlicher DNA-Sequenzen. Mit Hilfe der verschiedenen Unterbrechungskonstrukte und weiterer Deletionskonstrukte konnten erste Informationen zur Funktion des konservierten Leserasters orf80 erhalten und das minimale Replikon von pRN1 eingegrenzt werden. Außerdem wurde die Eignung der Shuttle-Konstrukte für Reportergenexperimente und zur Expression von Proteinen in Sulfolobus demonstriert. Weiterhin konnte mittels Lactose-Selektion das Wirtsspektrum der Shuttle-Konstrukte auf S. solfataricus ausgedehnt werden. Als Schlüsselfaktor zur erfolgreichen Etablierung der Shuttle-Vektoren konnte hoher Selektionsdruck, der nur mittels Deletionsmutanten erreicht werden kann, identifiziert werden. Die Identifizierung dieses kritischen Faktors wird die Entwicklung weiterer genetischer Systeme für Sulfolobus erleichtern.
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Stabilisierung von Proteinen durch in vitro-Evolution - Selektion und biophysikalische Charakterisierung
(2007)
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Insa Kather
- Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, große Proteine bzw. Enzyme durch Proside zu stabilisieren und die selektierten Varianten biophysikalisch zu charakterisieren. Proside ist eine auf dem phage display basierende in vitro-Evolutions-Methode zur Selektion stabilisierter Proteinvarianten, wobei eine erhöhte Proteaseresistenz stabilisierter Proteinvarianten mit der Infektiosität filamentöser Phagen verknüpft wird. Die evolutive Stabilisierung großer Proteine bzw. Enzyme ist besonders wichtig, weil deren Optimierung mittels rationalen Designs aufgrund der fehlenden Kenntnis der Struktur-Stabilitäts-Zusammenhänge fast unmöglich ist. Zum einen sind stabilisierte Enzyme in der industriellen Anwendung von großem Interesse, zum anderen ermöglicht die Analyse der stabilisierenden Effekte, vor allem auch im strukturellen Zusammenhang, Einblicke in die Prinzipien der Stabilität von Mehr-Domänen-Proteinen. Im Proside-System wird das zu stabilisierende Gastprotein zwischen die N2- und die CT-Domäne des G3P filamentöser Phagen eingebaut. Proside ist ein sehr effektives Selektionssystem, die Stabilisierung größerer Gastproteine ist jedoch schwierig. Cysteinhaltige Gastproteine können mit den Disulfidbrücken des G3P inkorrekte Disulfidbrücken bilden, wodurch die Infektiosität der Phagen verlorengeht. Außerdem nimmt die Infektiosität der Phagen mit der zunehmenden Größe des Gastproteins ab. Dieses Phänomen tritt besonders in Kombination mit dem Problem des Verlusts von Gastproteinen durch homologe Rekombination in Erscheinung. Phagen, die durch Rekombination das Gastprotein verlieren, sind in der in vitro-Proteolyse stark begünstigt und zusätzlich auch infektiöser als Phagen mit dem vollständigen Gastproteininsert. Ziel der Arbeit war deshalb zunächst, das Selektionssystem so zu modifizieren, dass es auf größere Proteine angewendet werden kann. Um das Problem der inkorrekten Disulfidverbrückung zu eliminieren, wurden die drei Disulfidbrücken im N1N2-Fragment des G3P durch Proside-Selektion substituiert und damit ein infektiöser Phage mit disulfidfreiem G3P konstruiert. Das selektierte 0SS-G3P* ist stabiler als das disulfidverbrückte Wildtyp-Protein. Kombination aller selektierten Mutationen in einer Variante ergibt ein im Vergleich zum Wildtyp-Protein um 19,0 °C stabilisiertes disulfidfreies G3P*. Die 14 second-site Muationen konnten so den Verlust von drei Disulfidbrücken überkompensieren. Die Einzelbeiträge zur Stabilisierung wurden mit Hilfe vieler Einzel- und Mehrfachmutanten charakterisiert und auf der Basis der Kristallstruktur des stabilisierten 0SS-G3P* analysiert. Dies ergab, dass verbesserte Domäneninteraktionen einen enormen Beitrag zur Stabilität leisten. Das G3P besitzt neben den Domänen N1 und N2 eine C-terminale Domäne CT, die auch für den Infektionsprozeß von Bedeutung ist. Diese Domäne wurde allein oder in Fusion mit N2 bzw. N1 und N2 exprimiert. Die isolierte CT-Domäne ist bis auf eine hydrophobe Helix entfaltet. Lediglich in Gegenwart von N1 und N2 besitzt sie eine marginale konformationelle Stabilität. Die Funktion der CT-Domäne bei Infektion und Phagenaustritt aus der Wirtszelle beruht auf der Exponierung hydrophober Oberflächen für die Interaktion mit der Wirtszellmembran, so dass eine flexible bzw. nur marginal stabile Domäne hierfür sehr geeignet scheint. Als Modellprotein für große Enzyme wurde die TEM-1 Beta-Lactamase aus E. coli durch Zufallsmutagenese und Proside-Selektion stabilisiert. Ebenso wie im Fall des G3P wurde eine große Stabilisierung des Enzyms um 18,4 °C durch eine stufenweise Selektion und anschließende Kombination der stabilisierenden Mutationen erreicht. Die stabilisierte Kombinationsvariante ist bei niedriger Temperatur etwa doppelt so aktiv wie das Wildtyp-Protein, und das Optimum der Aktivität ist zu höheren Temperaturen verschoben. Die Selektion stabilisierter Varianten war nur bei gleichzeitiger Selektion auf Ampicillin-Resistenz der infizierten Zellen möglich. Da der Phagentiter niedrig war, dominierten in Abwesenheit von Ampicillin rekombinante Phagen ohne Gastprotein die in vitro- und in vivo-Selektion. Um dieses Problem bei großen Gastproteinen ausschließen zu können, wurde ein alternatives Selektionssystem etabliert, wobei das zu stabilisierende Gastprotein aus der ursprünglichen Position zwischen der N2- und der CT-Domäne an den Beginn des G3P verschoben und mit einem N-terminalen Cystein als Selektions-Tag versehen wird. Die Phagenbibliothek wird auch in diesem Fall einer Proteolyse unterworfen, die Selektion beruht jedoch nicht auf einer Kombination von Proteaseresistenz und Infektiosität des Phagen, sondern auf der Kombination Proteaseresistenz und Bindung an eine Affinitätsmatrix. Die Infektiosität der Phagen wird durch ein N-terminal angefügtes Gastprotein nicht beeinflußt, und in ersten Selektionsversuchen mit Beta-Lactamase konnten stabilisierte Varianten angereichert werden.
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Die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus des Gen-3-Proteins filamentöser Phagen für die Infektion von Escherichia coli
(2007)
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Barbara Eckert
- Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus eines Proteins für dessen Funktionsweise in vivo zu untersuchen. Als Modellsystem diente der filamentöse Phage fd, der Gram-negative Bakterien infiziert. Das Gen-3-Protein (G3P) dieses Phagen ist für die initialen Schritte der Infektion essentiell. G3P ist aus drei Domänen aufgebaut, wobei die C-terminale Domäne das Protein in der Phagenhülle verankert. Die beiden N-terminalen Domänen N1 und N2 bilden eine strukturelle Einheit und wechselwirken mit den beiden zellulären Phagenrezeptoren, dem bakteriellen F-Pilus und TolA in der Zellmembran. Die Wechselwirkung der N2-Domäne mit der Pilusspitze führt zur Dissoziation der beiden Domänen und aktiviert so G3P für die anschließende Interaktion der N1-Domäne mit der C-terminalen Domäne von TolA. Die TolA-Bindungsstelle befindet sich auf N1 an der Domänengrenzfläche und ist deshalb im nativen Ruhezustand des Proteins durch N2 blockiert. Im Verlauf der Infektion muss nach der Pilusbindung die geöffnete, aktive Form des G3P so lange erhalten bleiben, bis N1 mit TolA wechselwirken kann. Die Analyse des Faltungsmechanismus des N1N2-Fragments in vitro zeigte, dass die beiden Domänen N1 und N2 sehr schnell falten, ihre Assoziation im letzten Rückfaltungsschritt jedoch außergewöhnlich langsam ist. Die Geschwindigkeit der Domänenassoziation wird durch die trans-nach-cis-Isomerisierung an Pro213 bestimmt, das in der Gelenkregion zwischen den beiden Domänen lokalisiert ist. Die Isomerisierung in den nativen cis-Zustand ist mit einer Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) sehr viel langsamer als Prolinisomerisierungen in anderen Proteinen und wird durch die lokale Sequenzumgebung um cis-Pro213 (Gln212-Pro213-Pro214) verursacht. Die Relevanz der langsamen Prolinisomerisierung für die Phageninfektiosität konnte in Kompetitionsexperimenten nachgewiesen werden. In diesen Experimenten konkurrierten jeweils zwei Phagenvarianten, die sich in ihrer Isomerisierungsrate und damit der Assoziationsrate der beiden Domänen unterschieden, um die Infektion einer E. coli-Kultur. Phagen, die eine langsame Prolinisomerisierung und damit eine lange Lebensdauer des aktiven, geöffneten Zustands mit dissoziierten Domänen aufweisen, setzten sich in den Kompetitionsexperimenten durch. Dass es sich bei der Inaktivierung der Phagen tatsächlich um einen prolinkontrollierten Mechanismus handelt, zeigte der Einfluss der Prolylisomerase Cyp18. Nach Dissoziation der Domänen kontrolliert also die langsame trans-nach-cis-Isomerisierung die Lebensdauer des infektiösen Zustands. Die Infektion von F--Zellen mit in vitro aktivierten Phagen ermöglichte es, die Lebensdauer des aktiven Zustands und die Kinetik der Inaktivierung der Phagen zu bestimmen. Die für verschiedene Phagenvarianten erhaltenen Zeitkonstanten spiegelten dabei die Isomerisierungskinetik des entsprechenden G3P-Proteins in vitro wider. Die langsame Prolinisomerisierung in der Gelenkregion steuert so die Funktion des G3P bei der Phageninfektion, indem Pro213 sowohl als Schalter als auch als Zeitgeber wirkt. In der nativen cis-Konformation steht dieser Schalter auf „aus“, die beiden Domänen N1 und N2 sind fest miteinander assoziiert und die Gelenksubdomäne liegt gefaltet vor. Entsprechend sind die Phagen in dieser Ruheform stabil, aber nicht infektiös. Die Bindung der N2-Domäne an den F-Pilus führt zur Dissoziation der beiden Domänen. Mit Hilfe CD-spektroskopischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in diesem offenen, aktivierten Zustand entfaltet vorliegt. Dies führt zu einer Destabilisierung der N2-Domäne. Ob N2 bei der Infektion ebenfalls entfaltet vorliegt, konnte jedoch nicht gezeigt werden. Als Folge der partiellen Entfaltung der Gelenkregion isomerisiert Pro213 aus dem sterisch anspruchsvollen cis- in den stabileren trans-Zustand, welcher der „an“-Stellung des Prolinschalters entspricht. Die sehr langsame Rückisomerisierung in die native cis-Konformation fungiert nun als Zeitgeber und gewährleistet, dass G3P lange genug geöffnet und partiell entfaltet bleibt, um eine Wechselwirkung zwischen der N1-Domäne und TolA in der Zellmembran zu ermöglichen. Neben dem Faltungsmechanismus beeinflusst auch die Stabilität des G3P die Infektiosität der Phagen. Mit Hilfe von Infektionsexperimenten von F+- und F--Zellen konnte gezeigt werden, dass die Infektiosität stark von der Stabilität des G3P, insbesondere von der Stärke der Domäneninteraktion, anhängt. Mit zunehmender Stabilität nimmt die Infektiosität ab, und stabilisierende Mutationen erschweren den Übergang in die aktive, partiell entfaltete Form mit dissoziierten Domänen. Die Stabilität des G3P ist daher so angepasst, dass einerseits eine Stabilität der Phagen im Ruhezustand garantiert ist, und es andererseits bei Bindung an den F-Pilus durch Domänendissoziation aktiviert werden kann.
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Star-shaped Polyelectrolytes
(2007)
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Felix Plamper
- Star-shaped polyelectrolytes were prepared by means of atom transfer radical polymerization (ATRP) utilizing the core-first approach. Star-shaped poly(acrylic acid) (PAA) with 5, 8 and 21 arms and different arm lengths was prepared via the corresponding poly(tert-butyl acrylate) (PtBA) precursors having a glucose, saccharose or beta-cyclodextrin core. Adopting the attempt for preparation of PAA we used the same scaffolds for the preparation of star-shaped poly(dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA). It is a weak cationic polyelectrolyte and it can be easily transformed to a strong one by quantitative quaternization (with methyl iodide) leading to poly{[2-(methacryloyloxy)ethyl] trimethylammonium iodide}, PMETAI). In order to reach high arm number a novel, hybrid silsesquioxane initiator with 58 initiation sites was introduced. The solution behavior of the obtained PAA stars was analyzed. Potentiometric titrations indicate a decrease of PAA’s acidity when increasing the arm number whereas a slight increase of the acidity was observed when increasing the molecular weight by increasing the length of the arms at constant arm number. The results are explained by the higher segment density of samples with short arms and high arm numbers, leading to a pronounced osmotic pressure inside the stars due to the presence of counterions. The osmotic pressure opposes further deprotonation, resulting in a decreased acidity. The osmotic coefficient decreases with increasing arm number, indicating higher counterion confinement within structures with higher branching. The use of strong polyelectrolytes facilitates the determination of the osmotic coefficient. It was seen directly that increasing arm numbers and decreasing arm lengths lead to a decrease of the osmotic coefficient. The osmotic coefficients of the investigated stars are in the range from 0.03 to 0.13, indicating the strong counterion confinement. Theory and experiment meet in the same order of magnitude. However the concentration dependence predicted by theory is not rendered by the experiment. The size of PMETAI stars in solution was investigated by dynamic light scattering (DLS), showing the expected collapse of the stars with increasing ionic strength. Electrostatic and osmotic screening leads to a retraction of the originally stretched arms, when no additional salt is present. However ion-specific effects lead to a more pronounced shrinkage when sodium chloride was exchanged with sodium iodide. The considerable osmotic pressure inside the star helps to incorporate multivalent counterions. The ion exchange reduces the number of counterions within the star, simultaneously increasing the translatory entropy of all counterions, since a multiple number of monovalent counterions is released into bulk for one multivalent counterion, which has been incorporated. The ion exchange leads to a decrease in osmotic pressure inside the star, reducing the strong stretching of the polymer’s arms, as seen by DLS. The collapse is more pronounced for counterions of higher valency. The switching of the counterion’s charge can therefore lead to smart polyelectrolytes. This was seen for the trivalent, light-sensitive hexacyanocobaltate(III), which by UV illumination transforms to a divalent counterion. Simultanously the hydrodynamic radius increases upon irradiation. Finally the thermoresponsive properties of aqueous solutions of star-shaped PDMAEMA were investigated. PDMAEMA is both pH-sensitive as temperature-sensitive, showing a miscibility gap at higher temperatures (LCST behavior). PDMAEMA shows a typical Flory-Huggins behavior irrespective to polymers architecture at high pH (in buffer), where it is virtually uncharged. Charge density starts to account for the deviations from ideal Flory-Huggins behavior at intermediate pH. The presence of multivalent ions leads in buffered solutions of PDMAEMA to the appearance of a miscibility gap at low temperatures (UCST behavior). In salt-free solutions the electrostatic stabilization is especially pronounced for polymers with high arm numbers (having higher charge density). No macroscopic demixing was observed for polymers with more than 9 arms.
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A Continuum Electrostatic Approach for Calculating The Binding Energetics of Multiple Ligands
(2007)
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Timm Essigke
- Complex biomolecules like proteins or nucleic acids can transiently bind various ligands, e.g., electrons, protons, ions or larger molecules. This property is the key to enzymatic catalysis, regulation and energy transduction in biological systems. Interactions between different ligand binding sites can lead to complex titration behaviors, which can be explained based on a microstate description of the system. Previous approaches to calculate the binding behavior of multiple ligand, only treated sites with one or no ligand bound by using a binary state vector to describe the system. Also only one or two ligand types, i.e., protons or electrons, were used for the calculation. In this thesis, I derive a more general formulation of the theory of ligand binding to biomolecules. For each site any number of charge forms and rotamer forms are allowed as well as any number of ligands and any number of ligand types can be bound. Charge and rotamer forms of sites can be parameterized by measurements on model reactions in solution or by quantum chemical calculations. An energy function is described, consistently combining experimentally determined contributions and those, which can be calculated by continuum electrostatics, molecular mechanics and quantum chemistry. Programs (i.e., QMPB and Perl Molecule) were developed to perform calculations based on the generalized ligand binding theory. The class library Perl Molecule was developed to write powerful Perl programs, which perform the necessary processing steps, e.g., for the conversion of a pdb-file into the input required for energy calculations. The generated input contains all experimentally determined or molecular mechanically and quantum chemically obtained parameters. The energy calculations are performed by the program QMPB, which uses other programs for the continuum electrostatics calculations to solve the linearized Poisson-Boltzmann equation. The computations scale linearly with the total number of sites of the system and can easily be performed in parallel. From the obtained energies, microscopic ligand binding probabilities can be calculated as function of chemical potentials of ligands in solution, e.g., by a Monte Carlo program. Additionally, microscopic and macroscopic equilibrium constants can be computed. The usefullness and correctness of the new approach based on a generalized ligand binding theory is demonstrated by a number of studies on diverse examples. Because various groups used Lysozyme as benchmark system for continuum electrostatics, it is chosen to test if previously obtained results can be reproduced with QMPB. Different quantum chemical approaches are applied to the benzoquinone system for parameterizing a site with several protonation and reduction forms. A complex site is also the CuB center in Cytochrome c oxidase, which is studied to decide if multiple protonation forms of the coordinating histidines are involved in the reaction mechanism. Factors influencing the reduction potential of the electron transfer protein ferredoxin are analyzed using the programs Perl Molecule and QMPB. Here, in particular conformational changes of a peptide bond in the vicinity of the [2Fe-2S] center are of interest. The protonation form of a neighboring glutamate turns out to influence the reduction potential strongly. Protonation and phosphorylation studies on the protein HPr lead to the development of a four-microstate model to explain conformational changes on a histidine, which can be observed by experiment, molecular dynamics simulation and electrostatic calculations. The phosphorylation and protonation state dependent conformational change can be related to the dual role of the protein in regulation and phosphate-transfer. The new microstate description does not only allow to analyze thermodynamic properties but also paved the road for the study of the kinetics of charge transfer.
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Characterization of Oligonucleotide Microarray Hybridization: Microarray Fabrication by Light-Directed in situ Synthesis – Development of an Automated DNA Microarray Synthesizer, Characterization of Single Base Mismatch Discrimination and the Position-Dependent Influence of Point Defects on Oligonucleotide Duplex Binding Affinities
(2008)
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Thomas Naiser
- The present thesis focuses on nucleic acid hybridization between free-floating target sequences and complementary end-tethered oligonucleotide probes on the surface of DNA microarrays. Hybridization experiments were performed on oligonucleotide microarrays (DNA Chips) which were fabricated with an automated synthesis apparatus (developed in the framework of the present thesis). The working principle of the microarray synthesizer is based on a photochemically controlled in situ synthesis process. By means of the combinatorial approach up to 25000 different (arbitrary) probe sequences can be fabricated in parallel - starting from nucleotide building blocks (NPPOC-phosphoramidites) - directly on the surface of the microarray. Great flexibility with regard to the choice of probe sequences is achieved by use of virtual photomasks on the basis of a spatial light modulator (Digital Micromirror Device, DMD, Texas Instruments Inc.). A microscope projection photolithography system is employed to project the virtual masks (i.e. the photomask images shown on the DMD) onto the surface of the microarray substrate. Spatially controlled photodeprotection of photolabile NPPOC protective groups (followed by coupling of a further nucleotide building block) enables massively parallel synthesis of DNA probe sequences. In the automated synthesis process microarrays are routinely fabricated over night. Comparable in situ synthesis systems are currently operated only at very few institutions around the world. We first report the application of phosphorus dendrimer substrates in the in situ synthesis of DNA microarrays. With the phosphorus dendrimer functionalization we obtained superior results in regard to sensitivity, surface homogeneity, signal/background-ratio and reusability of the microarrays. We performed microarray hybridization experiments to investigate the impact of single base defects (deliberately introduced single base mismatches and single base bulges) on the binding affinity of oligonucleotide duplexes. This is particularly interesting with regard to genotyping microarrays which are increasingly employed as a molecular diagnostics tool for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs). In a number of experiments we investigated the large influence of the single-defect position on duplex binding affinity. The origin of this positional dependence - which is apparently not in agreement with the (two-state) nearest-neighbor model - had not been identified so far. We discovered that the influence of the defect position is not restricted to single base mismatches but can also be observed for single base bulge defects. On the basis of the double-ended zipper model (assuming fluctuating end-domain-opening of the oligonucleotide duplex) we could reproduce the experimentally observed positional influence. Moreover, our theoretical investigations on the zipper model indicate a significant positional influence in regard to the contributions of the individual Watson-Crick nearest-neighbor pairs to the Gibbs free energy of oligonucleotide duplex formation. The present work provides for the first time a theoretical approach for the positional-dependent nearest-neighbor model (PDNN) of Zhang et al.. In the in situ synthesis process of DNA microarrays random point-mutations are introduced into the microarray probe sequences. We have shown - experimentally and by means of a numerical model - that synthesis-related defects significantly affect microarray hybridization characteristics. With regard to single base mismatch discrimination, we discovered significant differences between DNA/DNA- and RNA/DNA hybridization: experimental results indicate an improved discrimination of purine-purine mismatch base pairs in RNA/DNA-duplexes. For the experimentally observed, unexpectedly high stability of Group II single bulges we provide an explanatory approach on the basis of the zipper model. The selection of appropriate (specific and sensitive) probe sequences is of crucial importance for successful application of DNA microarray technology. Our experimental results confirm previous results which show that only a small fraction (in piecewise sections about 20-30%) of a long cRNA target sequence is available for hybridization with the complementary microarray probes. Reduced binding affinities are assumed to originate from the influence of target secondary structure. Using software tools for antisense oligonucleotide design (accounting for target accessibility) we were able to predict efficient microarray probes. We discovered evidence that mechanically stable secondary structures (e.g. double-helical sections) interfere with the microarray surface (sterical hindrance) and thus result in reduced microarray binding affinities.
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Comparative Life Cycle Assessment of CFC-replacement Compounds in Different Technical Applications
(2008)
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Monika Weckert
- Aim of the present project is to compare the results of the widely used concept of life cycle assessments (LCA) with those obtained by Discrete Mathematics. Mobile air conditioning (A/C) systems in passenger cars are chosen as an example for technical application of refrigerants. The environmental impacts due to life cycles of different possible substitute refrigerants are compared with the presently used 1,1,1,2-tetrafluoroethane (R134a). Additional refrigerants included in this study comprise dichloromethane (R30), propane (R290), isobutane (R600a), carbon dioxide (R744), pentafluorodimethyl ether (E125), 1,1,1’,1’-tetrafluorodimethyl ether (E134), hepta-fluoropropyl methyl ether (E7000), methyl nonafluorobutyl ether (E7100), ethyl nonafluorobutyl ether (E7200), and 1,1-difluoroethane (R152a). The data interpretation is carried out by means of independent methods such as the Dutch Handbook method (CML02), Eco-indicator 99 (EI99) and Total Equivalent Warming Impact (TEWI). According to the CML02 assessment method, R290, R600a, and R744 have a lower environmental impact compared with R134a in the impact categories “Stratospheric ozone depletion” (SOD), “Climate change” (CC), “Fresh water aquatic toxicity” (FAETP), and “Terrestrial ecotoxicity” (TETP). E125, E7000, E7100, and E7200 are the refrigerants with the lowest impacts in the categories “Acidification” (AP), “Eutrophication” (EP), “Photo-oxidant formation” (POCP), and “Human toxicity” (HTP). In the impact category “Depletion of abiotic resources” (ADP), R152a has a lower impact than R134a. The operation phase is the dominant phase within the life cycle. It accounts to > 79 % for impact category ADP, 71 – 99 % for CC, and > 50 % for FAETP. By means of EI 99 and TEWI, R152a, R290, R600a, R744, and E7200 have a smaller environmental impact than R134a under average operation scenario. According to EI99, the operation phase is with 43 – 63 % the dominating life cycle phase. Comparing the assessment of refrigerants by the three methods shows that each method ranked E134 higher than R134a. E7200, E7100, E7000, R152a, R600a, R290, and R744 are ranked lower than R134a. The fate of some persistent degradation products of the studied refrigerants is modelled. The concentrations of perfluorinated carboxylic acids in surface freshwater systems in Germany due to the annual direct refrigerant emissions of E7000, E7100, and E7200 from the A/C system of a passenger car are about the factor 107 to 109 smaller than the precautionary limit of 0.1 µg/L of the Federal Environment Agency for partly or non-assessable substances in drinking water (UBA 2003). Assuming that all 46 million German passenger cars (Destatis 2006a) are equipped with A/C systems using E7000, E7100, or E7200, the concentration of the degradation products in German surface waters will amount to 0.1 – 1 µg/L. That means even under the best-case scenario the above mentioned precautionary limit will be reached and under worst-case scenario exceeded. The ranking of refrigerants due to the aggregation of six substance-intrinsic properties by means of the mathematical model METEOR (METhod of Evaluation by ORder theory) was performed for 15 refrigerants i.e. chlorodifluoromethane (R22), difluoromethane (R32), pentafluoroethane (R125), 1,1,1-trifluoroethane (R143a), propene (R1270), ammonia (R717), R134a, R152a, R290, R30, R600a, R744, E7200, and the blends R407C and R410A. A high rank is accompanied with a high environmental impact. Considering a selection of possible aggregations, R22 is ranked to 87 % within the five highest ranks, followed by R143a with 85 %, and R32 with 71 %. Refrigerants which are ranked predominantly in the five lowest ranks include R717 (88 %), E7200 (81 %), and R290 (74 %). R744 has in ca. 40 % of the selected aggregations the highest rank and in 24 % the lowest rank. Two third of the refrigerants show a modification in their rank distribution pattern when putting an extreme low or high weight on the thermodynamic properties critical temperature and heat capacity. Additional to the results derived by the LCA conducted in this study, literature LCA results comprising different refrigeration processes and refrigerants were included in the comparison with results from METEOR. In general, METEOR does not agree with the results from LCA. In summary, ranking of refrigerants based on substance-intrinsic properties using METEOR can only give a rough estimation about general environmental impact of a certain refrigerant compared to others. Considering A/C systems in passenger cars, R152a, R290, R600a, and R744 appear as the most recommendable replacements of R134a in this application taking into account the results of the present LCA study derived by the three assessment methods and the fate modelling of some refrigerant degradation products.
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Charakterisierung des Replikationsproteins ORF904 des archaealen Plasmids pRN1
(2008)
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Kirsten Beck
- Das Plasmid pRN1 kann als Modell für die Untersuchung der DNA-Replikation im thermoacidophilen Crenarchaeon Sulfolobus genutzt werden. Ein offenes Leseraster kodiert für das Protein ORF904. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dieses Protein eine N-terminal lokalisierte Primase/Polymeraseaktivität besitzt, sowie eine C-terminale ATPase/Helikasedomäne. Vermutlich ist ORF904 involviert in die Replikation von pRN1. Ein Ziel dieser Arbeit war die weitere Charakterisierung der Primaseaktivität von ORF904. Ein Reihe von Oligodesoxynukleotiden wurden untersucht und es konnte ein Templat identifiziert werden, welches von ORF904 für die Synthese eines Primers genutzt werden konnte. Die Primaseerkennungssequenz GTG konnte identifiziert werden und als minimales Substrat für die Synthese eines Volllängenprimers wurde 5’-N8GTGN-3’ bestimmt. Es war außerdem bekannt, dass ORF904 Ribonukleotide und Desoxynukleotide für die Primersynthese benötigt. Die Quantifizierung des Einbaus radioaktiv markierter Ribo- und Desoxynukleotide zeigte, dass der Primer aus einem initiierenden Ribonukleotid besteht, welches mit Desoxynukleotiden verlängert wird. Der Startpunkt des Primers befindet sich direkt 5’ des Erkennungsmotivs. Die Kopiergenauigkeit des Enzyms wurde untersucht, indem die Einbaurate nichtkomplementärer Nukleotide analysiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Selektivität des Enzyms bei der Auswahl des ersten Nukleotids (Ribonukleotid) gering ist und dass ATP an dieser Position bevorzugt und gegenüber allen Basen eingebaut wird. Im Gegensatz dazu kommt es beim Einbau der Desoxynukleotide extrem selten zu Misinkorporationen, die Fehlerrate beträgt hier weniger als 0,02. Die minimale Primasedomäne von ORF904 (Aminosäuren 40-370) hat eine erhöhte Affinität für DNA mit dem Erkennungsmotiv, die Dissoziationskonstante beträgt hier 225 nM, im Vergleich zu DNA mit einem Basenaustausch im Erkennungsmotiv mit einer Dissoziationskonstante von 1200 nM. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ORF904 in der Lage ist, ein einzelsträngiges Oligodesoxynukleotid templatunabhängig zu verlängern. Diese terminale Transferaseaktivität wurde auch bei einer Reihe weiterer archaealer zellulärer und plasmidaler Primasen gefunden. Es wird vermutet, dass diese Proteine zusätzlich an DNA-Reparaturprozessen beteiligt sind. Bisher gibt es nur wenige Informationen über den Reaktionsmechanismus von Primasen. Deshalb wurde versucht, kurze DNA-Matrizen mit verschiedenen Deletionsmutanten des Proteins zu kristallisieren, um die Röntgenkristallstruktur des Komplexes zu lösen. Nur mit einer kurzen Deletionsmutante (Aminosäuren 40-370) konnten Kristalle erzeugt werden, welche allerdings keine DNA enthielten. In der Struktur zeigte sich, dass die C-terminale Subdomäne der Deletionsmutante (Aminosäuren 260-370), welche für die Primersynthese essentiell ist, ausschließlich alpha-helikal gefaltet vorliegt. Die Anordnung der beiden Subdomänen und ihre Verbindung mit einem nicht auflösbaren, flexiblem Linker führte zu der Vermutung, dass das Protein verschiedene Konformationen einnehmen kann. Dies wurde untersucht, indem eine Reihe von Aminosäuren ausgetauscht wurden und die Primaseaktivität untersucht wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass Y352 und schwächer W314 in die Erkennung des GTG involviert sind, da eine Mutation dieser Aminosäuren zu einem Verlust der Primaseaktivität mit einem Templat mit der Erkennungssequenz führt. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass dieser Verlust der Aktivität vermutlich auf eine Veränderung der Erkennungssequenz zurückzuführen ist, da die Proteine in der Lage waren, mit M13 DNA, welche eine Vielzahl möglicher Sequenzen enthält, einen Primer zu synthetisieren. In der Kristallstruktur liegen das vorher identifizierte aktive Zentrum und die Aminosäuren Y352 und W314 weit voneinander entfernt, aber die Ergebnisse zeigen, dass sich diese Teile des Proteins während der Primersynthese vermutlich in räumlicher Nähe befinden. Dies unterstützte die Vermutung, dass die aktive Form von ORF904 eine geschlossene Konformation einnimmt und sich von der offenen Form im Kristall unterscheidet. Um die Replikation von pRN1 genauer untersuchen zu können, wurde versucht ein in vitro Replikationssystem aufzubauen. Es gelang nicht, den Replikationsursprung von pRN1 zu identifizieren. Viele der Proteine, welche in die DNA-Replikation involviert sind, sind in Komplexen organisiert, deshalb könnten weitere Proteine, die an der Replikation von pRN1 beteiligt sind, durch die Identifizierung von Interaktionspartnern von ORF904 gefunden werden. Mit einem modifizierten ELISA-Assay wurde die Interaktion von ORF904 mit PCNA1 beobachtet, welches Teil der archaealen sliding clamp ist und mit ORF80, welches ebenfalls auf pRN1 kodiert ist. Für die Interaktion von ORF904 mit diesen Proteinen war die Anwesenheit von ATP und einem Oligodesoxynukleotid notwendig. Die Aminosäuren 371-526 von ORF904 wurden als Ort der Interaktion identifiziert.
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Mechanism of carbon monoxide oxidation at the active site [Ni-4Fe-5S] cluster of carbon monoxide dehydrogenase from Carboxydothermus hydrogenoformans
(2009)
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Seung-Wook Ha
- The carbon monoxide (CO) metabolism relies on CO-dehydrogenase (CODH) that oxidizes CO with H2O to CO2. The crystal structures of the native Ni-Fe CODHIICh from the CO-grown thermophilic hydrogenogenic anaerobic bacterium Carboxydothermus hydrogenoformans reveal the active site as a [Ni-4Fe-5S] cluster C, carrying a bimetallic Ni-(mu2S)-Fe1 subsite with a bridging mu2S. This is the assumed site, where the oxidation of CO occurs. However, cluster C in other catalytically active Ni-Fe CODHs, from Rhodospirillum rubrum, Moorella thermoacetica, and recombinant CODHIICh expressed in Escherichia coli, for example, lack the ¥ì2S bridging Ni and Fe and contain a [Ni-4Fe-4S] form of a cluster C. The CO oxidation mechanism proposed based on crystallographical and biochemical studies involved the apical binding of CO at the nickel ion and the activation of water at the Fe1 ion of the cluster. In order to understand how CO interacts with the active site of native CODHIICh and what function does the bridging mu2S ligand fulfill in the enzyme, this research work focuses (i) on the interaction of cluster C with CO analogue potassium cyanide and analysis of the resulting type of nickel coordination and (ii) on the effect of sodium sulfide on the enzymatic activities of the native CODHIICh. Under catalytic conditions, cyanide acts as a competitive inhibitor of CODHIICh with respect to CO. Under N2 gas phase without electron acceptor (non-catalytic conditions), cyanide inhibits CODHIICh at highly reduced state (low redox-potentials - 500 mV), not at oxidized and slightly reduced (- 320 mV) states. Cyanide is not able to inhibit CODHIICh at reduced conditions (- 500 mV) when CO is present in the atmosphere. Therefore, the interaction of cyanide with reduced active site is expected to mimic the substrate. The binding of cyanide to the nickel ion has been discovered by x-ray absorption spectroscopy and confirmed by x-ray crystallography at the atomic resolution. This structure comprises an intermediate state of cluster C with CO in NiFe-CODHIICh. In this reaction, cyanide displaces the mu2S ligand giving rise to square-planar Ni with three S and one CN ligands. Cluster C and its protein environment undergo significant conformational changes induced by the binding of cyanide. Remarkably, Fe1 is displaced by 1,1 A, which reduces the Fe1 to Ni distance by 0,1 A. Electron densities of the CN ligand estimate an occupancy of 80 % and N atom of cyanide is in hydrogen bonding distance to His93 and Lys563, which are involved in proton transfer network. The binding of cyanide eliminates the bridging ¥ì2S from the cluster C yielding H2S, whereas the Ni-(mu2S)-Fe1 bridge is reformed after the catalytic cycle. It is likely that the high rate of CO oxidation (Kcat/Km of 1.7 x 109 M-1 s-1 at 70 ¡ÆC) and subsequent rebinding of mu2S would prevent the release of this ion from the protein by diffusion-controlled process (108 to 109 M-1 s-1). Cyanide-inhibited reduced CODHIICh is fully reactivated after the release of cyanide upon incubation at 70 ¡ÆC in the presence of low-potential reductants. The square-planar NiS4-coordinated cluster C is recovered by reactivation with sulfide, resulting in fully active enzyme, which includes the reformation of the Ni-(mu2S)-Fe1 bridge. Reactivation in the absence of sulfide generates the NiS3-coordination, lacking the mu2S ligand, and results in partially active enzyme. NiS3-coordinated cluster C is readily converted to NiS4-conformation by incorporation of sulfide. This conversion results in an increase of CO oxidation activity and a stabilization of cluster C at growth temperatures of the bacterium. In addition, the NiS4-conformation displays better catalytic efficiency (Kcat/Km) than NiS3 under low concentrations of CO. Inhibition of CO2 reduction activity by sulfide and higher CO2 reduction activity of NiS3-conformation suggest that the mu2S ligand retards the binding of CO2 to Ni. The crystal structure of CO2 loaded NiS3-cluster further convinces this assumption. The mu2S ligand accelerates the physiologically relevant CO oxidation, prevents inhibition by the product CO2, and inhibits a non-physiological CO2 reduction. These functions of the bridging mu2S are of physiologically importance for the metabolism of C. hydrogenoformans in highly reducing, CO-limited, and CO2-rich volcanic environments. Thus, it is concluded that the [Ni-4Fe-5S]-form of cluster C is the biologically relevant species in CODHIICh. A CO oxidation mechanism developed in this thesis is based on the structures of cyanide-bound intermediated state and CO2-bound state, as well as on the kinetic data on the reactivity of the enzyme with CO, potassium cyanide and sodium sulfide.
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Konzertierter Ansatz zur Untersuchung von Polymorphie - Experiment und Simulation
(2008)
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Jürgen Thun
- Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Polymorphie und Kristallisation verschiedener organischer Moleküle. Als Techniken standen sowohl computerchemische Methoden als auch ein modernes automatisches Laborreaktorsystem zur Verfügung, welches über verschiedene Online-Sensoren und eine akurate Temperatursteuerung verfügte. Mittels einer FBRM-Sonde, welche eine zeitnahe Detektion der Keimbildung erlaubt, und einer ATR FT-IR Sonde, über die zu jedem Zeitpunkt der Kristallisation der Konzentrations- und somit auch der Überssättigungsverlauf gemessen werden konnte, war eine genaue Steuerung der Kristallisationsprozesse möglich. Unter Verwendung des beschriebenen Laborreaktorsystems gelang es, das 175 Jahre alte Rätsel über die Polymorphie des einfachen organischen Moleküls Benzamid zu lösen. Bereits im Jahre 1832 wurde zum ersten Mal das Phänomen der Polymorphie an organischen Molekülkristallen von den Grossvätern der modernen anorganischen und organischen Chemie, Friedrich Wöhler und Justus von Liebig am Beispiel des Benzamids entdeckt und veröffentlicht. Die Strukturlösung dieser von Wöhler und Liebig beschriebenen nadelförmigen Modifikation von Benzamid gelang allerdings erst im Rahmen dieser Arbeit im Jahr 2007. Von Benzamid ist eine weitere metastabile Phase II bekannt, welche bislang fälschlicherweise für die Wöhler und Liebig Phase gehalten wurde, da sie ebenfalls, wie auch die echte Wöhler Phase, in einer nadelförmigen Morphologie auskristallisiert. Diese Phase wurde 2005 von David et al. aus Röntgenpulverdaten gelöst. Allerdings wichen die verwendeten Kristallisationsbedingungen stark von den von Wöhler und Liebig beschriebenen Kühlraten ab. Durch eine schnelle, Lösungsmittel getriebene Umwandlung entzog sich diese Phase bislang jedoch weiteren Untersuchungen. Erst im Rahmen dieser Dissertation ist es gelungen, die Umwandlung dieser metastabilen Phase II soweit zu verlangsamen, dass sowohl röntgenographische Methoden, als auch Festkörper-NMR-, Raman- und IR-Spektroskopie möglich war. Durch die Einfachheit des Moleküls, nur einem Torsionsfreiheitsgrad, sowie der bekannten Polymorphie bietet sich Benzamid als Testsystem für Computersimulationen an. Benzamid wurde so als "benchmark"-System für Kristallstrukturvorhersagen unter der Verwendung zweier kommerziell erhältlicher Programmpakete (MS Modeling 4.0 und Cerius2) ausgewählt. Mit beiden Programmpaketen ist es gelungen sowohl die thermodynamisch stabile Phase I als auch die Wöhler und Liebig Phase richtig "vorherzusagen". Bei der metastabilen Phase II konnte die experimentelle Struktur leider nicht in den Vorhersagen gefunden werden. Die aus experimentellen Daten gelöste Kristallstruktur stellte im Hinblick auf das bei den Simulationen verwendete Kraftfeld einen Sattelpunkt auf der Energiehyperfläche dar, so dass selbst einfache Energieoptimierungen dieser Phase bereits scheiterten und zu einer deutlichen Veränderung in den Gitterparametern führte. Ein weiteres interessantes Ergebnis war die Vorhersage eines energetisch günstigen Packungsmusters, welches bislang schon von einigen kurzkettigen Carbonsäuren bekannt ist, dem sogenannten Katamer-Synthon. Dieses bildet sich aus langen über Wasserstoffbrücken gebundenen Ketten, in denen keine Dimere enthalten sind. Dieses vorhergesagte Packungsmotif bedarf noch einer experimentellen Bestätigung. Hierfür ist es allerdings notwendig geeignete Kristallisationsbedingungen zu schaffen, welche es erlauben die Bildung von Benzamid-Dimeren in Lösung zu verhindern. Parallel zum Modelsystem Benzamid wurde die Polymorphie des Wirkstoffes Montelukast und seiner Salze näher untersucht. Im Rahmen dieser Dissertation gelang es, die Kristallstruktur der freien Säure von Montelukast aus Röntgeneinkristalldiffraktometriedaten zu lösen. Die durchgeführten Kristallisationsexperimente zusammen mit der gelösten Kristallstruktur und computerchemischen Simulationen halfen, die Probleme bei der Kristallisation des Natrium-Salzes zu erklären. So scheint es notwendig, dass als strukturdirigierendes Agenz bei der Kristallisation dringend Wasserstoffbrücken notwendig sind. Experimentell bestätigt sich dies darin, dass neben der freien Säure auch ein mikrokristallines Ammonium-Salz bekannt ist, jedoch entgegen aller in den Patenten enthaltenen Behauptungen, kein kristallines Natrium-Salz. Dieser Befund lässt sich noch dadurch unterstützen, dass sich auch in den Originalmedikamenten keine kristalline Natrium-Verbindung finden lässt. Die Kombination aller hier vorgestellter Methoden erlaubt es, eine genaue Kenntniss über die Polymorphie von verschiedenen Systemen zu erlangen und bei der Lösung von Problemen in der experimentellen Kristallisation neue Lösungswege zu finden. Ungewöhnlich ist, dass alle verwendeten Techniken, sowohl Theorie als auch Experiment, an einem Ort, von einer Person durchgeführt wurden.
