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Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen
(2012)
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Kristina Spieß
- Spinnenseide stellt aufgrund ihrer mechanischen und chemischen Eigenschaften ein faszinierendes Protein-basiertes Material mit Potential für vielfältige Anwendung in technischen und biomedizinischen Bereichen dar. Rekombinant hergestellte Spinnenseidenproteine können neben der natürlichen Assemblierungsform des Fadens zu diversen Morphologien, wie Vliesen, Mikropartikeln, Kapseln oder Filmen verarbeitet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Filme aus dem rekombinant produzierten Protein eADF4(C16) umfassend charakterisiert. eADF4(C16)leitet sich von der repetitiven Kerndomäne des Proteins ADF4 ab, welches ein Hauptbestandteil der sog. dragline Seide der Europäischen Gartenkreuzspinne Araneus diadematus ist. Der Einfluss verschiedener Prozessparameter auf bestimmte Eigenschaften des resultierenden Films wurde systematisch untersucht. Die Variablen umfassten dabei die Wahl des Lösungsmittels zum Gießen des Films (Hexafluoroisopropanol, Ameinsensäure sowie ein wässriger Puffer), die Art der Nachbehandlung (Methanol bzw. Ethanol sowie Kaliumphosphatlösung), sowie die relative Luftfeuchtigkeit. Alle Parameter zeigten dabei einen Einfluss auf die Sekundärstruktur der Proteine im Film. Zusätzlich wurden die thermische, chemische und mechanische Stabilität der Filme sowie ihre Oberflächeneigenschaften analysiert. Während sich alle untersuchten Filme kaum in ihrer thermischen Stabilität unterschieden, zeigte sich ein deutlicher Einfluss des verwendeten Lösungsmittels und der Nachbehandlung auf das mechanische Verhalten der Filme unter linearer Zugbelastung. Chemische und mechanische Eigenschaften konnten mit der Sekundärstruktur-Zusammensetzung korreliert werden. Aus Zugversuchen, DMA sowie einer Kombination aus linearer Zugbelastung und gleichzeitiger FTIR-Analyse konnte geschlossen werden, dass das verwendete Lösungsmittel nicht nur die Zusammensetzung der Sekundärstruktur beeinflusst, sondern auch die Vernetzung/Anordnung der einzelnen Strukturelemente. Dieser Einfluss überdauerte auch die Nachbehandlung der Filme. Alle untersuchten Nachbehandlungsarten führten zu einer Erhöhung des beta-Faltblattanteils. Allerdings konnte ein Effekt der gewählten Methode auf die Oberflächenbeschaffenheit der nachbehandelten Filme festgestellt werden: Die jeweiligen Filme unterschieden sich sowohl in ihrer Topographie als auch in ihrer Hydrophobizität. Für viele Anwendungen sind zusätzliche Funktionalisierungen vorteilhaft. Hierfür wurde die Methode der post-translationalen chemischen Kopplung gewählt.Um eine chemisch spezifische Reaktionsstelle bereitzustellen, wurden Cystein-Mutanten des Proteins eADF4(C16) hergestellt. Drei verschiedene Proteinvarianten wurden gereinigt und charakterisiert. Die Untersuchung ihrer Sekundärstruktur in Lösung und in assemblierten Filmen ergab keine signifikanten Änderungen im Vergleich zu dem Cystein-freien eADF4(C16). Zusätzlich konnten die Proteine sowohl in Lösung als auch nach Filmbildung in einer spezifischen Reaktion mit hoher Effizienz modifiziert werden. Um die Variabilität der Funktionalisierung zu zeigen, wurde die kovalente Kopplung von Fluorescein, Biotin und Nanogold durchgeführt. Des Weiteren konnte das Enzym Galaktosidase unter Beibehaltung seiner Aktivität immobilisiert werden. Für spätere Zellkulturanalysen wurde zudem eine RGD-Sequenz in Form eines zyklischen Peptids gekoppelt, die eine Integrin-vermittelte Zelladhäsion ermöglicht. Im Hinblick auf potentielle Anwendungen der rekombinanten Spinnenseidenfilme als Beschichtung wurden die Oberflächeneigenschaften der jeweiligen Filme analysiert. Dabei zeigte sich, dass besonders die Benetzbarkeit bzw. Hydrophobizität der Filmoberfläche in Abhängigkeit des verwendeten Substrats variierte. Auf hydrophoben Materialien (Polystyrol und Teflon) wiesen dünne Filme eine hydrophile Oberfläche auf, während Filme auf Glas hydrophobe Eigenschaften zeigten. Gleichzeitig konnten Unterschiede in der Sekundärstruktur der Filme nachgewiesen werden. In Anlehnung an Theorien für Block-Copolymere wurde ein Modell über eine mögliche Anordnung der Strukturelemente in diesen Filmen aufgestellt, um die beobachteten Oberflächeneffekte zu erklären. Natürliche Seidenmaterialien stellen aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und ihrer biologischen Abbaubarkeit auch interessante Kandidaten für biomedizinische Applikationen dar. Daher wurde die biologische Verträglichkeit der rekombinanten Spinnenseidenfilme in vitro untersucht. Erste Ergebnisse ergaben eine gute Verträglichkeit des Materials; so adhärierten Prä-Osteoblasten (MC3T3-E1) auf den Filmen und konnten über mehrere Tage kultiviert werden. Das verwendete Lösungsmittel und die Nachbehandlungsart beeinflussten signifikant das Resultat, was möglicherweise auf die unterschiedliche Oberflächenchemie und -topographie zurückzuführen ist. Während die Adhäsion der Zellen auf nicht-modifizierten Filmen schwach war, konnte diese durch Kopplung der spezifischen Zelladhäsions-Sequenz c(RGDfK)verbessert werden.
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Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen
(2012)
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Stephanie Hoffmann-Thoms
- Für die Infektion von E. coli Zellen benötigt der filamentöse Phage fd sein aus drei Domänen bestehendes Gen-3-Protein (G3P). Die C-terminale Domäne verankert das G3P in der Phagenhülle, die N-terminalen Domänen N1 und N2 vermitteln die initialen Schritte der Infektion. Im Ruhezustand des Phagen liegen N1 und N2 in assoziierter Form vor, wodurch die Bindungsfläche auf der N1-Domäne für den sekundären Rezeptor, die C-terminale Domäne von TolA, blockiert wird. Zur Aktivierung des G3P interagiert der Phage über seine N2-Domäne mit dem F-Pilus der Wirtszelle wodurch die für die Assoziation der Domänen wichtige Gelenkregion entfaltet und das dort befindliche Pro213 in die trans-Konformation übergeht. Die Lebenszeit des aktiven Zustandes wird limitiert durch die Reisomerisierung von Pro213, die jedoch sehr langsam abläuft. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Bereiche für die Population des offenen bzw. geschlossenen Zustandes und damit die Funktionalität des G3P wichtig sind. Über die Analyse des Faltungsmechanismus des Wildtyp G3P, sowie der Stabilität und Struktur seines Intermediates mittels NMR-Spektroskopie, konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in der aktiven Form komplett entfaltet vorliegt. In der Variante G3P IIHY, die unter anderem in der Gelenkregion zwei stabilisierende Substitutionen enthält, sind dagegen die Domänen im Intermediatszustand noch lose miteinander assoziiert. Die Unterschiede in der Stärke der Domänenassoziation beeinflussen die Wechselwirkung der entsprechenden G3P-Varianten mit TolAC, was in vitro anhand von Bindungsexperimenten nachgewiesen werden konnte. Sowohl im aktiven Intermediat, als auch in der nativen Form führen stabilisierende Austausche zu einer deutlichen Verschlechterung der Interaktionsfähigkeit des G3P mit TolAC. Dies wurde zusätzlich durch Infektionsexperimente sowohl mit pilusfreien, als auch mit pilushaltigen Zellen bestätigt. Die Analyse der Stabilität und des Faltungsmechanismus der P213G-Variante des fd G3P zeigt, dass auch Pro213 die Stabilität des inaktiven Ruhezustandes und damit die Lebensdauer der aktiven Form beeinflusst. Aufgrund des Verlustes des Prolinschalters liegt das entsprechende G3P P213G zum großen Teil in nicht assoziierter und damit instabiler Form vor. Durch den Austausch der beiden zu Pro213 benachbarten Reste sind die N-terminalen Domänen ebenfalls fast vollständig unabhängig voneinander, was unter anderem auf die beschleunigte Isomerisierung an Pro213 zurückgeführt werden kann. Um zu analysieren, welche Bereiche des G3P an der Weiterleitung des Signals der Bindung von N2 an den Pilus beteiligt sind, wurden verschiedene Substitutionsvarianten hergestellt, thermodynamisch charakterisiert und die Infektiositäten der entsprechenden Phagenvarianten untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erste Schleife der N1-Domäne, die sich in der Interaktionsfläche zur N2-Domäne befindet, eine wichtige Rolle spielt. Nach Ersatz durch eine kürzere Schleife liegen N1 und N2 fast vollständig dissoziiert vor, wie unter anderem aus der Analyse der Affinität gegenüber TolAC sowohl in vitro als auch in vivo hervorgeht. Während der Aktivierung müssen im Umkehrschluss auch die Wechselwirkungen zwischen der Schleifenregion von N1 und N2 gelöst werden. Aufgrund der hohen Stabilität seines G3P im Ruhezustand wird der fd Phage als Grundlage des PROSIDE-Selektionsverfahrens verwendet, um stabilisierte Proteinvarianten zu erhalten. Für das Gb1-Protein aus Streptococcus sp. wurden darüber unter anderem vier stark stabilisierende hydrophobe Austausche identifiziert, die in der Variante Gb1-M2 kombiniert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität dieser hyperstabilen Variante näher analysiert. Die relativ zum WT-Gb1 deutlich erhöhte Stabilität von Gb1-M2 ist dabei zum Teil durch deren Dimerisierung bedingt. Die Kristallstruktur des Proteins zeigt, dass die Assoziation der Monomere über die Ausbildung eines intermolekularen b-Faltblattes und eine hydrophobe Interaktionsfläche vermittelt wird. Der Kern dieser Assoziationsfläche wird durch Leucinreste an den Positionen 16 und 37 gebildet. Die Untersuchung weiterer Varianten hat gezeigt, dass die Kombination von hydrophoben Resten an diesen Positionen zur Dimersierung führt. Um den Beitrag der Austausche zur konformationellen Stabilität des Monomers von Gb1-M2 zu bestimmen, wurde dessen Faltungsmechanismus mittels Einzel- und Doppelmischexperimenten analysiert. Die Faltung des Monomers konnte dabei von der Einstellung des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes getrennt und seine Stabilität bestimmt werden. Diese ist gegenüber dem WT-Gb1 deutlich erhöht. Eine solche kinetische Analyse kann allgemein für oligomere Proteine verwendet werden, um die Stabilität ihrer monomeren Form zu ermitteln. Voraussetzung ist, dass, wie in Gb1-M2, die Faltung des Monomers schneller abläuft als die Einstellung des Monomer-Oligomer-Gleichgewichtes.
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Monte Carlo Simulation Methods for Studying the Thermodynamics of Ligand Binding & Transfer Processes in Biomolecules
(2012)
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R. Thomas Ullmann
- The binding and transfer of ligands is of central
importance for the function of many biomolecular
systems. The main topic of this thesis is the
development and application of Monte Carlo (MC)
simulation methods for studying complex ligand
binding equilibria which can also involve
conformational changes. The simulated systems
were described by microstates within a continuum
electrostatics/molecular mechanics (CE/MM) model
of the receptor-ligand system. The CE/MM modeling
methodology was improved. The improvements led to
more detailed molecular models that enable a more
realistic reproduction of system properties and
environmental conditions. The developed simulation
methods were applied to biomolecular systems whose
function involves aspects that are important for
the understanding of bioenergetic energy
transduction. The results of this thesis are
presented in five articles that are published in
peer reviewed scientific journals.
Manuscript A presents the Monte Carlo simulation
software GMCT which was largely developed in this
thesis. The software offers a variety of different
simulation methods that allow the user to harness
the full potential of CE/MM models in the simulation
of complex receptor systems.
Manuscript B presents a novel theoretical framework
for free energy calculations with the free energy
perturbation method. The novel framework is more
broadly applicable and can lead to more efficient
simulations than previous formulations. The
derivation of the formalism also led to interesting
insights into general statistical mechanics. The
formalism was implemented in GMCT and could already
be used fruitfully for the free energy calculations
presented in Manuscripts C and D.
Manuscript C demonstrates the application of free
energy measures of cooperativity to study the
coupling of protonation, reduction and conformational
change in azurin from Pseudomonas aeruginosa (PaAz).
Such a coupling is prototypic for bioenergetic systems
because it forms the thermodynamic basis of their
energy transducing function. PaAz is an experimentally
well characterized, small electron transport protein.
For this reason, PaAz was used here as model system
to demonstrate the usefulness of cooperativity free
energies in detecting and quantifying thermodynamic
coupling between events in complex biomolecular
systems. The results of this study led to new insight
that could help to determine the still enigmatic
physiological role of PaAz.
In Manuscript D, free energy calculations were
applied to study the thermodynamics of transport
through the ammonium transporter Amt-1 from
Archaeoglobus fulgidus (AfAmt-1). Ammonium is the most
directly utilizable nitrogen source for plants and
microorganisms. AfAmt-1 and its homologues facilitate
the transport of ammonia/ammonium across biological
membranes in living beings from all domains of life.
It is intensely debated how these proteins perform
their function and whether ammonia or its protonated
form ammonium is actually transported. The study
extended upon previous theoretical studies by
including the effects of substrate concentration,
electrochemical transmembrane gradients,
proton-coupled binding equilibria and competitive
binding of different ligand species. It was found
that the transported species is most likely the
ammonium ion. An ammonia/proton symport mechanism
that involves a pair of coplanar histidine residues
at the center of the transmembrane pore as transient
proton acceptor is made plausible by the high
genetic conservation of these residues.
Manuscript E presents a first application of the
microstate description within a CE/MM model to the
simulation of the non-equilibrium dynamics of a
molecular system. We simulated the re-reduction
kinetics of the primary electron donor in the
photocycle of the bacterial photosynthetic reaction
center from Blastochloris viridis. The simulation
results are in very good agreement with
experimentally measured data.
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Neue Materialien auf Basis arylsubstituierter 1,3,5-Triazine für blau phosphoreszierende organische Leuchtdioden
(2012)
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Andrea Jahreis
- Als Beleuchtungstechnologie der Zukunft stellen organische Leuchtdioden (OLEDs) eine effiziente Alternative zur Glühbirne dar und eröffnen darüber hinaus aufgrund ihrer Eigenschaft als Flächenstrahler gänzlich neue Design- und Anwendungsmöglichkeiten. Weißes Licht in OLEDs wird meist durch Kombination von Emittern der drei Primärfarben rot, grün und blau erzeugt. Für rot und grün sind bereits zahlreiche stabile Matrix-Emitter-Systeme sowie Transport- und Blockermaterialien bekannt. Stabile blaue Emitter und zu diesen kompatible Materialien sind dagegen rar und stehen deshalb im Fokus der Materialentwicklung. Diese Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung neuer niedermolekularer Verbindungen auf Basis arylsubstituierter 1,3,5-Triazine als Elektronenleiter, Lochblocker oder Matrixmaterial für OLEDs mit blauen Phosphoreszenzemittern. Für den Einsatz in diesen müssen die Materialien ein komplexes Anforderungsprofil erfüllen: neben der thermischen und chemischen Stabilität ist bei Verwendung von blauen Phosphoreszenzemittern vor allem ein ausreichend hohes Triplettniveau eine wichtige Voraussetzung. Die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten Aryl-1,3,5-triazine können aufgrund der Verknüpfung von Diphenyltriazin als Grundeinheit mit elektronisch unterschiedlichen Substituenten über verschiedene Brückeneinheiten in drei Materialklassen eingeteilt werden. Die symmetrisch aufgebaute Verbindungsklasse der arylsubstituierten Bis-1,3,5-triazine wurde durch die Verknüpfung zweier Diphenyltriazineinheiten über verschiedene aromatische Brücken erzielt und basiert auf der Struktur des literaturbekannten Elektronenleiters 4,4‘-Bis-[2-(4,6-diphenyl-1,3,5-triazinyl)]-1,1‘-biphenyl, der eine Biphenylbrücke - und damit ein für blau nicht ausreichendes Triplettniveau - besitzt. Durch Einführung neuer Brückeneinheiten sollte eine Verringerung der Konjugation und somit eine Anhebung des Triplettniveaus erreicht werden, um die Bis-1,3,5-triazine auch in Kombination mit blauen Phosphoreszenzemittern verwenden zu können. Hierfür wurden drei verschiedene Konzepte verfolgt: Eine Verdrillung des Biphenyls durch Methylgruppen in 2- und 2‘-Position, eine meta-Anknüpfung über einen Phenylring sowie die Verwendung von Dibenzofuran als Heteroaromaten mit geringerer Konjugation als Biphenyl. Die Synthese der Bistriazine erfolgte in zwei Schritten. Zunächst wurde in einer Ringschlussreaktion aus den jeweiligen Disäurechloriden der Brückeneinheit und dem gewünschten Benzonitrilderivat das 3,5-Diaza-pyryliumsalz gebildet. Die anschließende Ammonolyse lieferte schließlich das entsprechende Bistriazin. Durch Alkylsubstitution der äußeren Phenylringe konnte die Löslichkeit der Materialien stark verbessert werden. Alle Verbindungen zeichnen sich durch hohe thermische Stabilität und eine für den späteren Aufdampfprozess vorteilhafte Sublimationsneigung aus. Durch die Substitution mit tert-Butylgruppen gelang es, die Kristallisationsneigung zu unterdrücken und amorphe Filme mit hohen Glasübergangstemperaturen bis zu 182 °C zu erhalten. Die größte Verringerung der Konjugation konnte für die Derivate mit meta-Anknüpfung erreicht wird. Die dafür maßgeblichen optischen Bandlücken lagen zwischen 3,9 eV und 4,1 eV. Die Konjugation bestimmt ebenso das Triplettniveau, das für einen effizienten Betrieb der OLEDs höher liegen muss als das Triplettniveau des Emitters. Die Bistriazine erreichten Triplettenergien bis zu 2,84 eV und sind damit ausreichend für die Verwendung mit blauen Phosphoreszenzemittern. Die Stabilität der Materialien unter dem Einfluss von Elektronen wurde sowohl im Cyclovoltammetrie-Experiment als auch im „Single-Carrier“-Bauteil nachgewiesen. Für die Klasse der silylsubstituierte Phenyl-1,3,5-triazine wurde zur Verbesserung der morphologischen Eigenschaften und der Löslichkeit eine der Diphenyltriazineinheiten der Bistriazine durch eine Triphenylsilylgruppe ausgetauscht. Im Vergleich zu den Bistriazinen konnte die Löslichkeit der Materialien deutlich verbessert und die Kristallisationsneigung gesenkt werden. Die Verbindungen bilden stabile amorphe Filme und weisen Glasübergangstemperaturen bis 115 °C auf. Ihre Triplettenergien von bis zu 2,91 eV liegen über denen der Bistriazine und sind daher auch in Kombination mit tiefer blauen Phosphoreszenzemittern verwendbar. Durch wiederholte Reduktionen im Cyclovoltammetrie-Experiment konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Klasse ebenfalls um stabile Elektronenleiter handelt. Die donorsubstituierten Phenyl-1,3,5-triazine bilden durch Kombination von Diphenyltriazin als Akzeptor und Phenylcarbazol als Donor ein bipolares Matrixmaterial. Die beiden Einheiten sind dabei nicht konjugativ über eine Etherbindung verknüpft, um ein Absinken der Triplettenergie zu vermeiden. Die Materialien dieser Klasse zeigen von allen untersuchten Verbindungen in dieser Arbeit die geringste Neigung zur Kristallisation. Sie bilden stabile amorphe Filme mit Glasübergangstemperaturen bis 90 °C aus. Die erfolgreiche Trennung des Ladungstransports auf separierten Molekülteilen wurde in der Cyclovoltammetrie und in quantenmechanischen Rechnungen bestätigt. In fluoreszenzspektroskopischen Messungen konnte das Vorliegen von Carbazolexcimeren nachgewiesen werden. Daher konnten die Materialien nicht als Matrix in blau phosphoreszierenden organischen Leuchtdioden eingesetzt werden. Abschließend wurde ein Material aus der Klasse der Bistriazine als Elektronenleiter und Blocker für Löcher und Exzitonen in OLEDs mit blauen Phosphoreszenzemittern eingesetzt. Für das beste Bauteil mit optimierter Ladungsträgerbalance wurden eine externe Quantenausbeute von 14,7 % (bei 300 cd/m²) und eine maximale Leuchtdichte von 113.000 cd/m² erzielt.
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Kombination von Substratanreicherung und Katalyse als generelles Prinzip von Faltungshelferenzymen
(2012)
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Anne-Juliane Geitner
- In der Zelle existieren eine Vielzahl von Faltungshelferenzymen: molekulare Chaperone, die durch Bindung an aggregationssensitive Oberflächen die Konzentration aggregationssensitiver Intermediate herabsetzen und Peptidylprolylisomerasen und Thioldisulfidoxidoreduktasen, die geschwindigkeitsbestimmende Schritte während der Proteinfaltung katalysieren. Viele Faltungshelferenzyme kombinieren katalytische Funktion und Chaperonfunktion, die häufig innerhalb verschiedener Domänen lokalisiert sind.
Ein solches Beispiel ist die Peptidylprolylisomerase SlpA, die aus einer FKBP-Domäne und einer Chaperondomäne aufgebaut ist. Die FKBP-Domäne besitzt Prolylisomeraseaktivität, die IF-Domäne ist für die Chaperoneigenschaften von SlpA verantwortlich. SlpA besitzt eine sehr geringe Prolylisomerase- und Faltungshelferaktivität, ist jedoch ein äußerst effizientes Chaperon.
Die NMR-Struktur von SlpA und ein Vergleich mit der Struktur der homologen Prolylisomerase SlyD liefert keine Erklärung für die sehr geringe Prolylisomeraseaktivität. Die Untersuchung von homologen SlpA-Proteinen aus verschiedenen anderen Organismen zeigt, dass die niedrige Prolylisomeraseaktivität und die hohe Chaperonaktivität in der Familie der SlpA Proteine konserviert sind.
SlpA bindet mit hoher Affinität und sehr hoher Dynamik an permanent entfaltete RNaseT1. Die geringe Faltungshelferaktivität von SlpA ist also auf die geringe Prolylisomeraseaktivität der FKBP-Domäne zurückzuführen, und nicht auf eine gestörte Substratbindung oder Dynamik der IF-Domäne. Die Konstruktion einer Chimäre aus der FKBP-Domäne von SlyD und der IF-Domäne von SlpA bestätigt dies. Da in diesem chimären Protein die effiziente Prolylisomerasedomäne von SlyD vorhanden ist, ist es ein hochaktiver Faltungshelfer.
SlpA gehört zu den Zwei-Domänen-Proteinen, bei denen eine Domäne (IF) in die Schleife einer anderen Domäne (FKBP) insertiert ist. Stabilitätsuntersuchungen zeigen, dass die IF Domäne in isolierter Form gefaltet vorliegt. Innerhalb des Gesamtproteins stabilisiert die Insertion der IF-Domäne die FKBP-Domäne. Die Faltung der IF-Domäne ist sehr schnell und läuft zum größten Teil autonom von der FKBP-Domäne ab. Bei höheren Konzentrationen an Denaturierungsmittel ist die Stabilität der IF-Domäne nicht mehr ausreichend um selbstständig zu falten. Daher wird sie von der FKBP-Domäne abhängig und beide Domänen bilden eine Faltungseinheit. Die FKBP-Domäne wird nicht nur durch die IF Domäne stabilisiert, sondern stabilisiert auch ihrerseits die IF-Domäne.
Die Analyse der Stabilität und der Faltung der SlyD-SlpA-Chimäre zeigt ebenfalls, dass die SlpA-IF-Domäne einen enormen stabilisierenden Einfluss auf die Wirtsdomäne, in dem Fall die SlyD FKBP Domäne, besitzt. Damit unterscheiden sich SlpA und SlyD aufgrund der unterschiedlichen Stabilitäten ihrer IF-Domänen grundlegend in ihren Faltungsmechanismen.
Um solche modular aufgebauten Faltungsenzyme genauer zu untersuchen, wurden artifizielle Proteine konstruiert, bei denen nicht-homologe Chaperondomänen, die apikale Domäne aus GroEL aus E. coli, die b'-Domäne der PDI aus S. cerevisiae und die Chaperondomäne des periplamatischen Faltungshelfers SurA aus E. coli in die Prolylisomerase hFKBP12 insertiert wurden.
Die Insertion dieser Domänen in eine Schleife von hFKBP12 wirkt stark destabilisierend, da durch den Einbau die lokalen Kontakte der Schleife zerstört werden. Durch das Einführen natürlich vorkommender Linkerbereiche und ihre schrittweise Verlängerung konnte die Wirtsdomäne hFKBP12 stabilisiert werden und ihre Prolylisomeraseaktivität, die durch die Destabilisierung stark beeinträchtigt war, wiederhergestellt werden. Auch durch das Einführen einer Disulfidbrücke im Linkerbereich konnten sowohl hFKBP12 als auch die Gastdomänen enorm stabilisiert werden konnten.
Die Anwesenheit der Chaperondomänen steigert in allen Fällen die Faltungshelferaktivität von hFKBP12 und verringert die hohe Substratspezifität der Prolylisomerase gegenüber Proteinsubstraten. Demzufolge ist dies ein generischer Effekt, der unabhängig ist von der Herkunft der Chaperondomäne.
Die chimären Faltungshelferenzyme binden mit hoher Affinität und hoher Dynamik an entfaltete Proteinsubstrate.
Neben seiner Chaperondomäne besitzt SurA zwei Parvulindomänen, von denen nur eine als Prolylisomerase aktiv ist. Durch den Einbau der IF-Domäne von SlyD als Chaperondomäne in die beiden Parvulindomänen sind die chimären Parvulinkonstrukte in der Lage, entfaltete Protein zu binden und als Chaperon zu wirken. Die Faltungshelferaktivität der katalytisch aktiven Parvulindomäne konnte durch den Einbau der IF-Domäne enorm gesteigert werden. Diesre Arbeit zeigt, dass separate Bindungsstellen für generische Substratbindung und spezifische Katalyse Voraussetzung sind für die Konstruktion von aktiven, artifiziellen Faltungsenzymen aus nicht-verwandten Domänen.
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Entwicklung von Janus-Partikeln auf Basis des Schichtsilicats Kaolinit
(2012)
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Dunja Hirsemann
- Einige Teile der folgenden Arbeit wurden in Kooperation mit Bayer MaterialScience (Leverkusen) erstellt.
Die wichtigste Errungenschaft dieser Dissertation war die Produktion von Janus-Partikeln auf Basis des Schichtsilicats Kaolinit. Diese neue Methode zur Fabrikation von Janus-Partikeln ermöglicht eine maßgeschneiderte Anpassung der Grenzflächenspannungen von beiden äußeren Oberflächen, den so genannten Basalflächen, des Kaolinit.
Das 1:1 Schichtsilicat Kaolinit Al2Si2O5(OH)4 ist ein preisgünstiges, natürliches Mineral, das eine polare Struktur aufweist, und besitzt daher zwei chemisch unterschiedliche Basalflächen. Die zwei gegenüberliegenden externen Basalflächen des Kaolinitplättchens bestehen aus einer Al2(OH)4 oktaedrischen Schicht (oktaedrische Oberfläche, OS), die von µ-Hydroxyl-Gruppen begrenzt ist und die andere Basalfläche des Kaolinits ist begrenzt durch die basalen Sauerstoffatome der SiO4 tetraedrischen Schicht (tetraedrische Oberfläche, TS). Durch die Adressierung dieser chemisch unterschiedlichen Basalflächen entsteht ein Partikel mit einem ausgeprägten Janus-Charakter. Dies ist eine viel billigere Route um Janus-Partikel zu produzieren, verglichen mit den etablierten Methoden.
Daher war das erste Ziel eine kovalente, irreversible Modifikation der oktaedrischen Aluminol-Basalfläche des Kaolinitplättchens sicherzustellen. Eine Festkörper NMR Studie des Modellsystems EG Kaolinit wurde durchgeführt, da auf Grund der Interkalation von EG in den Zwischenschichtraum von Kaolinit dieses System eine erhöhte grafting Dichte pro Gramm Kaolinit aufweist. Die 27Al MQMAS Messungen von EG Kaolinit zeigten bereits, dass 60% der 27Al Kerne der oktaedrischen Schicht eine drastisch veränderte chemische Umgebung besitzen, was höchstwahrscheinlich durch eine kovalente Bindung verursacht wird. Die REAPDOR Messungen an EG Kaolinit erlauben eine Bestimmung des Abstandes von 3.1 Å zwischen dem 13C Kern des EGs und der 27Al Kerne des Kaolinits. Dieser Abstand beweist eineindeutig ein kovalentes Aufpfropfen der EG Moleküle auf die oktaedrische Schicht des Kaolinits.
Basierend auf dieser Erkenntnis wurde eine Modifikation der OS von Kaolinit ausgeführt durch eine Reaktion von Kaolinit mit Catechol, das sogar noch reaktiver als EG ist. Zusätzlich wurde die tetraedrische Basalfläche durch einen Ionenaustausch von hydratisiertem Na+ gegen Ru(bpy)32+ modifiziert. Die Modifikation von beidem, OS und TS, wurde separat bestätigt und überdies konnte die Selektivität der Modifikation durch SIMS Messungen bewiesen werden. Dies war das erste Mal, dass Janus-Partikel auf Basis des Schichtsilicats Kaolinit produziert wurden. Zusätzlich wurde eine spezifische Anpassung der Grenzflächenspannung der Basalflächen von Kaolinit für ein unmischbares Zwei-Komponenten-System wie Öl und Wasser erfolgreich realisiert und eine stabilisierte Emulsion konnte hergestellt werden.
In einem weiteren Schritt wurden diese modifizierten Kaolinitplättchen als Phasenvermittler in einem PS/PMMA blend angewandt. Hierbei wurden die externen Basalflächen von Kaolinit durch zwei Copolymere modifiziert. Ein Copolymer besaß Catechol-Gruppen um an die OS zu ankern, während die positiv geladenen Gruppen des anderen Copolymers es erlaubten, die Grenzflächenspannung der TS zu ändern. Die konsekutive Modifikation von Kaolinit mit den Copolymeren wurde erfolgreich mittels 13C Festkörper NMR Messungen nachgewiesen. Zuletzt zeigte die Einbettung in einen PS/PMMA Film, dass die modifizierten Kaolinit-Partikel eine sehr hohe Grenzflächenaktivität aufweisen auf Grund der maßgeschneiderten Anpassung der Grenzflächenspannungen, die viel spezifischer ist als die des unmodifizierten Kaolinits.
Diese Dissertation ist kumulativ. Alle Ergebnisse sind in Kapitel 4 zusammengefasst und im Detail in den Manuskripten in Kapitel 5 erklärt.
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Etablierung von Methoden zur Bioevaluation antitumoraler Naturstoffe, Metabolite und Analoga
(2011)
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Sebastian Knauer
- Die Ziele, die ich mir vor Beginn meiner Arbeit gesteckt habe (siehe 1.3), wurden weitestgehend erreicht. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe Illudin M 11 zuverlässig gewonnen werden kann. Die Aufzucht von O. olearius im Medium HA- und die Extraktion nach Kutscher-Steudel erwiesen sich hierbei als Methoden der Wahl. Illudin S 11a konnte jedoch nicht isoliert werden.
Daneben konnte eine Reihe von Verfahren zur Evaluierung von Testsubstanzen etabliert werden. Die Untersuchungen der Substanzeigenschaften (siehe 2.5 bis 2.8) lieferten nützliche und verlässliche Ergebnisse, auch wenn man hinsichtlich des Einsatzbereiches manchmal Einschränkungen in Kauf nehmen musste. Die Stabilität von Esterbindungen wurde auf zwei Arten untersucht. Die getesteten Substanzen 16c, 18 und 19b erwiesen sich hierbei als weitestgehend stabil gegenüber Hydrolyse (siehe 3.2). Die Methode, die zur Untersuchung der Komplexbildung eingesetzt wurde, lässt sich nicht auf alle Verbindungen übertragen, sondern nur auf solche, deren Komplexe ein Absorptionsmaximum im sichtbaren Bereich besitzen (siehe 3.3). Bei den Eisenkomplexen war das Potential der getesteten Liganden, Komplexe zu bilden vergleichbar mit dem von EDTA. Bei den anderen getesteten Kationen war dieses schwächer ausgeprägt. Im Rahmen des Glutathion-Monitorings wurde festgestellt, dass – im Gegensatz zur Muttersubstanz 11 – keines der getesteten Illudinderivate 27 eine spontane Reaktion mit GSH eingeht (siehe 3.4). Der Alkylierungsassay mit Aceton liefert nur für farblose Verbindungen verlässliche Ergebnisse. Bei den getesteten Illudinderivaten 27 konnte zwar ein Alkylierungspotential gemessen werden, doch stellt deren vorhandene Eigenabsorption einen gewissen Unsicherheitsfaktor dar. Der Alkylierungsassay mit Acetophenon lieferte keine verwertbaren Ergebnisse (siehe 3.5).
Die zellbasierten Analysen (siehe 2.9 bis 2.11) sowie der CAM-Assay (siehe 2.12) sind für alle Stoffe durchführbar. Auch wenn die untersuchten Organismen (Zellen und Embryonen) nicht immer auf die gleiche Weise reagieren, kommen auch hierbei verlässliche Resultate zu Stande. Da die Zahl der durchführbaren Tests durch Kosten und Verfügbarkeit der Untersuchungsobjekte limitiert ist, wurde hinsichtlich der Testsubstanzen immer eine Vorauswahl getroffen. Beim TUNEL-Test zeigten die meisten Verbindungen ein proapoptotisches Verhalten, besonders gut wirkten die Illudinderivate 27 (siehe 3.6). Der Annexin-Test ist nur bedingt aussagekräftig. Er ließ sich zum einen nur mit Suspensionszellen durchführen, zum anderen war es manchmal kaum möglich, spätapoptotische von nekrotischen Zellen zu unterscheiden (siehe 3.7). Mit Hilfe von Immunoblots wollte man Rückschlüsse hinsichtlich des Mechanismus der Apoptoseinitiierung ziehen. Die schnelle Prozessierung der Caspase 9 legt den Schluß nahe, dass die Platinkomplexkonjugate 13 (HL 60), die Oxazole 26 (Kb-V1), die Illudinderivate 27 (HL 60 und 518 A2) und die Chalkone 20, 21a und 21c (HL 60) zu einer Aktivierung über den mitochondrialen Weg führen. Die anderen Testverbindungen bedürfen weiterer Untersuchungen in Bezug auf den Signalweg der Apoptoseinitiierung (siehe 3.8). Einige Derivate der antivaskulären Verbindung Combretastatin A-4 7a wurden mit Hilfe des CAM-Assays untersucht. Die meisten zeigten hierbei erwartungsgemäß ein vergleichbares Verhalten. Besonders interessant ist der Aktivitätsunterschied der Combretastatin-Analoga 26h und 26i. Dieser wurde sowohl beim TUNEL-Test als auch beim CAM-Assay beobachtet, obwohl sich beide Verbindungen strukturell kaum unterscheiden.
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Elicitoren der Duftstoffemission von Rainfarnpflanzen
(2012)
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Lienhard Mack
- Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Suche nach Elicitoren im Vorderdarmsekret (Regurgitat) von Spodoptera littoralis - Raupen für die Auslösung der Duftstoffproduktion in Rainfarnpflanzen.
Vier HPLC-Fraktionen F0/2, F0/4, F0/5 und F0/6 der durch Festphasenextraktion aus dem Regurgitat von Spodoptera littoralis - Raupen erhaltenen Fraktion F0 induzieren nach Applikation an verletzte Rainfarnpflanzen die Emission von Mono- und Sesquiterpenen, die auch nach Fraß dieser Raupen an Rainfarn abgegeben werden.
Bei der Extraktion eines Aliquots der Fraktion F0 mit CH3OH/H2O 85:15 wurden 0,3 mg eines Rückstandes erhalten, der nach HPLC-Vergleich eine sehr ähnliche Zusammensetzung wie die HPLC-Fraktion F0/6 aufwies.
Um Informationen über die Strukturen der in den Fraktionen enthaltenen Verbindungen zu erhalten, wurden NMR-Spektren von den Fraktionen F0 und F0/6 aufgenommen, die 1H NMR Resonanzsignale in dem Bereich von delta = 3,20 – 5,40 ppm zeigten, was auf Oligosaccharide hindeutete. Die Auswertung der 1D- und 2D-NMR Daten von Fraktion F0/6 führten zur Struktur von Stachyose. Weiterhin wurden im 13C-NMR Spektrum von F0/6 Signale mit chemischen Verschiebungen beobachtet, die im gleichen Bereich wie Stachyose lagen. Es wurde vermutet, dass es sich hierbei um Homologe von Stachyose wie Saccharose, Raffinose und Verbascose handeln könnte. Dieser Annahme wurde deshalb mit HPLC- und HPLC/ESI-MS Untersuchungen nachgegangen.
Durch Vergleich der HPLC-Retentionszeiten eines Standards aus den drei kommerziell erhältlichen Oligosacchariden Saccharose, Raffinose und Stachyose mit denen von Fraktion F0/6 konnten diese Saccharide identifiziert werden. Verbascose wurde durch Coinjektion von kommerziell erhältlicher Verbascose mit der Fraktion F0/6 detektiert. HPLC/ESI-MS des Saccharidgemisches von Fraktion F0/6 lieferte bei den entsprechenden Retentionszeiten die ESI-Massenspektren der vier Oligosaccharide. Hochaufgelöste ESI-Massenspektren von Saccharose, Raffinose, Stachyose und Verbascose aus der Fraktion F0/6 wurden an einem HR-ESI-FT-ICR-Massenspektrometer erhalten und sind in Übereistimmung mit den Strukturen.
Die kommerziell erhältlichen Oligosaccharide Saccharose, Raffinose, Stachyose und Verbascose wurden in analoger Weise wie die Regurgitatfraktionen an verletzte Rainfarnpflanzen appliziert, das Rainfarnduftstoffspektrum mit der CSLA gesammelt und durch GC qualitativ und quantitativ analysiert.
Saccharose erhöht wie die anderen drei Oligosaccharide die Emission von trans-Sabinol, Campher, Limonen und 1,8-Cineol. Außerdem induziert sie die Bildung von cis- und trans-Sabinenhydrat. Raffinose, Stachyose und Verbascose elicitieren zusätzlich zu den schon aufgeführten Monoterpenen die Abgabe von m-Cymen, p-Cymen, cis-Sabinenhydrat, trans-Sabinenhydrat und Borneol.
Die verstärkte Emission der Rainfarn Sesquiterpene Germacren D und Bicyclogermacren ist möglicherweise auf ein polareres Oligosaccharid mit dem Molekulargewicht M = 990 g/mol aus der Fraktion F0/6 zurückzuführen, das durch HPLC/ESI-MS identifiziert wurde. Bei dieser Verbindung handelt es sich wahrscheinlich um Ajugose.
Ob die Konzentrationen der von Rainfarn nach Fraß von Spodoptera littoralis - Raupen emittierten Monoterpene p-Cymen, 1,8-Cineol, Campher und Limonen ausreichen, um eine toxische Wirkung gegenüber Spodoptera littoralis- Raupen zu entfalten, müsste in weiteren Untersuchungen geklärt werden.
In dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass Oligosaccharide aus dem Vorderdarmsekret von Spodoptera littoralis - Raupen nach Applikation an verletzte Rainfarnpflanzen die Emission von Mono- und Sesquiterpenen induzieren, die auch nach Fraß dieser Raupen an Rainfarn abgegeben werden. Das Hepta-β-D-glucosid aus der Zellwand des Pilzes Phytophthora sojae, der bei der Sojabohnenpflanze Glycine max die Stamm- und Wurzelfäule auslöst, induziert in ihr die Synthese des Phytoalexins Glyceollin I, das fungizid wirkt. In den Zellmembranen von Glycine max Keimblättern gibt es ein Bindungs-Protein, an das das Hepta-beta-D-glucosid spezifisch mit hoher Aktivität bindet und eine rezeptorvermittelte Signaltransduktion einleitet. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zwischen diesem Hepta-beta-D-glucosid und den im Vorderdarmsekret von Spodoptera littoralis - Raupen detektierten Oligosacchariden, die die Induktion des charakteristischen Duftstoffbuketts von Rainfarnpflanzen auslösen, könnten die Oligosaccharide möglicherweise auch eine rezeptorvermittelte Signaltransduktion bewirken.
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Novel Group 4 Metal Amido Complexes - syntheses, reactivity and olefin polymerization catalysis
(2012)
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Muhammad Hafeez
- A series of amine functionalized electron rich aminopyridinato ligands was synthesized by the methodology developed by Fort and coworkers and subsequent Ulmann thermal amination. In addition to this some tripodal ligands containing nitrogen donor functionalities were also synthesized. The corresponding titanium and hafnium complexes of these ligands were synthesized using the amine / diethyl-ammonium chloride / toluene elimination and salt metathesis routes. These compl-exes were characterized by NMR and elemental analysis. Many of these complexes have been studied on the basis of structure and their catalytic potential was investigated. The overall evaluation of this work tells about the electrophilicity of the metal centre and the steric and electronic effects of the ligand.
Mono Ap di / trichloride complexes of titanium were synthesized by amine / diethyl-ammonium chloride elimination and salt metathesis routes by reacting the corresponding ligand with diethylamido titanium trichloride or titanium tetrachloride respectively. The structural investigation of these complexes gives insight into the more electron donating capability of the aminopyridinato ligands. These complexes were found moderatly active for ethylene and styrene polymerization when activated with d-MAO giving syndiotactic polystyrene of high molecular weight and aluminum terminated polyethylene. The low activity of these complexes was attributed to the ligand transfer to aluminum during catalysis.
Mono Ap trialkyl hafnium complexes were synthesized by reacting the respective aminopyridinato ligand with tetrabenzyl hafnium at room temperature. Some of these complexes were studied by single crystal X- ray analysis. These complexes have shown very low activity towards ethylene polymerization when activated with d-MAO probably due to very fast ligand transfer to aluminum. The low temperature NMR investigations of these complexes indicate the η3-coordination of one benzyl with hafnium metal centre.
To overcome the problem of ligand transfer during catalysis, we synthesized the tri-podal ligands containing nitrogen donors either by Pd2(DBA)3 / DPPP catalysed cross coupling reactions or by Ni(o) / 2, 2 -bipyridine catalyst system followed by thermal amination. The titanium trichloride complexes of these ligands were synthesized by reacting the respective tripodal ligand with [Et2NTiCl3] at room temperature. The titanium complexes containing tripodal ligands were found less active towards ethyl-ene polymerization.
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Smart Hydrogels based on Responsive Star-Block Copolymers
(2012)
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Alexander Schmalz
- The work presented in this thesis is focused on the synthesis of double-responsive star-shaped block copolymers and their formation of smart hydrogels in response to different external stimuli, specifically temperature and pH. Our concept was based on (AB)x diblock copolymer stars where both blocks are responsive to temperature and pH. This approach led to physically crosslinked hydrogels, which could form/disintegrate in response to a first trigger, i.e. the outer B blocks are alternating between hydrophilic and hydrophobic. The mechanical properties of the gels could still be manipulated by a second, independent trigger, i.e. upon applying the second trigger, the inner A blocks contract, leading to a change in mechanical properties.
The first part deals with the synthesis and characterization of linear and star-shaped poly((2 diethylamino)ethyl methacrylate) (PDEA) to investigate its double-responsive behavior and its potential for the design of double-responsive gelators. This polymer responds to variations in both pH and temperature, just like the analogous poly((2 dimethylamino)ethyl methacrylate) (PDMA). At a given temperature PDEA exhibits a critical pH value above which the chains collapse and aggregation takes place. The temperature-responsive behavior of PDEA does not depend on molecular weight or architecture, i.e. arm number. However, the cloud point does strongly depend on pH, as it affects the overall charge of the star.
For the second part we combined PDMA and PDEA to create double-responsive star-shaped block copolymers (DMA-DEA)x where both blocks are responsive to pH and temperature. The collapse of the PDEA outer blocks is first selectively triggered by heating. This has been proven by dynamic light scattering and is due to the significantly lower cloud point of PDEA with respect to that of PDMA at identical pH. The gelation behavior was investigated in dependence on block length and arm number. At high concentrations hydrogel formation was observed under conditions where only the PDEA outer blocks are insoluble. Rheology measurements showed that a minimum DEA fraction is necessary for gel formation and that the DEA fraction strongly influences the properties of the gels. Another factor controlling the gelation behavior of the diblock copolymer stars is the pH value, as the sol-gel transition temperature at a given concentration is shifted to lower values upon increasing the pH. The mechanical properties of some gel can be manipulated, as a decrease in the storage modulus was only observed for soft gels, if the temperature is increased above the transition temperature of the inner PDMA block, i.e. when the PDMA blocks contract. Thus, we successfully created double-responsive star-shaped gelators which formed reversible hydrogels that were still able to respond to a second trigger. However, the aggregation and hydrogel formation turned to out to be quite complex, due to the high number of parameters controlling them.
Finally, our concept was extended to other polymers and simplified by changing the outer block of the block copolymer stars to a polymer that is only responsive to temperature. This allows for an easier tuning of the sol-gel transition, as only one parameter is involved. The new diblock stars are comprised of PDMA inner blocks and outer blocks of poly(diethylene glycol methyl ether methacrylate) (PDEGMA), which can be triggered independently of each other as confirmed by turbidimetry and dynamic light scattering. They form hydrogels at relatively low concentrations upon heating above the transition temperature of PDEGMA independent of the pH value. The fraction of DEGMA is an important parameter for the gelation behavior of the (DMA-DEGMA)x stars, the same as the DEA fraction was for the (DMA-DEA)x stars. Unexpectedly, the mechanical properties of these gels can also not be changed by heating above the transition temperature of PDMA at pH values around 8. The gels formed in this pH region are strong and too rigid to be affected, similar to strong gels formed from (DMA-DEA)x stars. Only when the pH is increased close to 9 and the subsequently formed gels are softer, a decrease in the moduli is observed.
We also quaternized the inner PDMA blocks of the (DMA-DEGMA)x stars to transform them it into strong polycations. This leads to an increase in the effective volume fraction of the stars and consequently to a significant decrease of the critical gelation concentration. The quaternization opens our concept up to the introduction of light sensitivity through multivalent counterions and the incorporation of nanoparticles.
