19 search hits
-
Charakterisierung des Replikationsenzyms ORF904 aus Sulfolobus islandicus
(2010)
-
Martin Sanchez
- ORF904 ist ein multifunktionelles Enzym, welches durch das kryptische Plasmid pRN1 codiert wird. Das Protein besitzt eine C-terminale Primase/Polymerasedomäne und eine N-terminale ATPase/Helikasedomäne. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die molekulare Funktion der N-terminalen Domäne genauer untersucht. Sequenzanalysen der Helikasedomäne ermöglichten ORF904 als eine Superfamilie-3-Helikase zu klassifizieren und für die ATPase- und Translokationsaktivität relevante Sequenzmotive zu identifizieren. Darüber hinaus konnte zusätzlich eine Winged-Helix-DNA-Bindedomäne am C-Terminus der Helikasedomäne identifiziert werden. An Hand von CD-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Deletionsmutanten von ORF904 strukturiert vorlagen. Die thermische Denaturierung der Mutanten unterstreicht den thermophilen Charakter des Proteins (TM= 85-100°C). Der endgültige Nachweis der Hexamerisierung des Proteins in Gegenwart von dsDNA und AMP-PnP wurde mit der Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie erbracht. Es war bereits bekannt, dass die ATPase-Aktivität von ORF904 durch RNA gar nicht und durch ssDNA nur schwach stimuliert wird. Eine spezifische Zunahme der ATPase-Aktivität in Gegenwart von pRN1 konnte nicht beobachtet werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass dsDNA die ATPase-Aktivität um den Faktor 7 erhöht. Eine Bevorzugung der längeren Plasmid-DNA unter limitierenden Bedingungen konnte nicht beobachtet werden, weswegen von einer geringen Prozessivität der Helikase auszugehen ist. Die Wechselzahl und der KM für ATP konnten zu 0,7/s und 0,4 mM bestimmt werden. Die ATPase-Aktivität der Deletionsmutanten von ORF904 gaben Hinweise auf die Wichtigkeit der Region direkt N-terminal vor dem Helikasekernbereich. Es wird angenommen, dass diese Region für die Hexamerisierung des Proteins von Bedeutung ist. Die Analyse der Punktmutanten von ORF904 in den konservierten Bereichen erlaubten es R690 als den Argininfinger zu identifiziert. Der potentielle Lysinfinger K574 konnte nicht als solcher identifiziert werden. Wie zu erwarten war, zeigten die Mutanten des beta-Hairpins eine vernachlässigbare Abnahme in Gegenwart von dsDNA. Translokationsexperimente mit einem Biotin-Streptavidin-Verdrängungsversuch ermöglichten es, für die Helikase eine durch ATP induzierbare Translokation mit 3-5-Polarität auf ssDNA nachzuweisen. Dabei konnte K657 als das Lysin im beta-Hairpin identifiziert werden, welches vermutlich den direkten Kontakt zur DNA herstellt. Die Translokationsrate von ORF904 wurde zu etwa 6,2x10^-4 b/s bestimmt. Zusammen mit den Ergebnissen der Prozessivität ist anzunehmen, dass es sich bei OF904 nicht um eine prozessive Helikase handelt. Vielmehr scheint ORF904 am Aufschmelzen des Replikationsursprungs beteiligt zu sein. In der Vergangenheit konnte keine Entwindung von komplett doppelsträngigen Helikasesubstraten oder Substraten mit 5- oder 3-Überhang auf der Basis von M13-DNA oder Oligodesoxynukleotiden gezeigt werden. Es konnte jedoch eine ATP-abhängige Entwindung für ein kurzes DNA-Substrat mit 3- und 5-Überhang, ein Doppelstrangsubstrat mit internem 5-Überhang, eine Holliday-Struktur sowie eine Triple-Helix gezeigt werden. Mittels der letzten drei Substrate wurde auch die Translokation auf dsDNA nachgewiesen. Die Entwindungsraten für die Helikase liegen abhängig vom Substrat zwischen 1,0 und 7,2x10^-4 bp/s. Die Ergebnisse der Entwindungsexperimente untermauern nochmals die Ergebnisse der Translokationsexperimente. DNA-Bindungsexperimente auf der Basis von Fluoreszenzanisotropiemessungen bestätigten die DNA-Bindung der carboxyterminalen DNA-Bindedomäne und der Helikasedomäne, die in Gegenwart von ATP zunahm. Darüber hinaus scheint es, dass die Prim/Pol-Domäne in der Lage ist, die Helikasedomäne in Gegenwart von ATP und Abwesenheit des GTG-Bindemotivs zu maskieren, um so unter Umständen eine unspezifische DNA-Bindung zu erschweren. In Gegenwart des GTG-Bindemotivs bindet die Prim/Pol-Domäne ssDNA sowie dsDNA stärker. Dieser Effekt wird für ssDNA durch ATP weiter verstärkt. Möglicherweise unterstützt die Prim/Pol-Domäne die DNA-Bindung der Helikase bei Vorliegen des GTG-Bindemotivs im Bereich des Replikationsursprungs. Um den Replikationsursprung zu bestimmen, wurden mit einem für die Replikation essentiellen Sequenzabschnitt stromabwärts von orf904 Footprint-Analysen durchgeführt. Diese erlaubten es, Nukleotide in einer Region 60 bis 90 Nukleotide stromabwärts von orf904 zu identifizieren, die durch die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne scheinbar geschützt werden. Interessanterweise befindet sich in diesem Bereich auch ein GTG-Motiv, das als Erkennungssequenz für die Prim/Pol-Domäne dienen könnte, um die Bindung des Proteins an den vermeintlichen Replikationsursprung zu verstärken. Im Ganzen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne zusammen mit der Helikasedomäne den Replikationsursprung während der Replikationsinitiation erkennt.
-
Foamy Virus Enzymes - Activity, Regulation and Resistance
(2010)
-
Maximilian Hartl
- Foamy viruses or spumaretroviruses belong to the family of retroviridae but differ in several aspects from other retroviruses (orthoretroviruses). Viral particles contain DNA not RNA. The Pol protein, the precursor of the viral enzymes, is translated from a separate mRNA independently of the capsid and matrix proteins. The protease remains covalently bound to the reverse transcriptase, while in orthoretroviruses the protease is cleaved off autocatalytically. Thus, in mature spumaretroviruses a protease-reverse transcriptase protein (PR-RT) with three different catalytic activities is found: proteolysis, DNA polymerization and RNase H activity. In this work, the recombinant PR-RTs from the prototype foamy virus and a simian foamy virus isolate from macaques were purified and compared. The biophysical and enzymatic properties of the two enzymes were similar. However, their behavior towards the nucleoside inhibitor azidothymidine is different. This nucleoside analog inhibits the replication of foamy viruses by terminating polymerization. Prototype foamy virus was not able to develop resistance against azidothymidine, but we succeeded in the generation of an azidothymidine-resistant simian foamy virus. Up to four mutations within the reverse transcriptase were found to be necessary to confer high resistance against azidothymidine. To characterize the mechanism of resistance, the corresponding recombinant PR-RTs were investigated in vitro. The data reveal that the azidothymidine resistance is based on the excision of the incorporated inhibitor in the presence of ATP. Retroviral proteases are only active as homodimers. In this work, analysis of the PR-RT of prototype foamy virus and simian foamy virus isolated from macaques by analytical ultracentrifugation and size exclusion chromatography indicate, that foamy virus proteases are stable and inactive monomers in solution. The three-dimensional structure of the simian foamy virus protease domain was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy and revealed the typical folding of a monomer subunit of retroviral proteases. Furthermore, nuclear magnetic resonance analysis by paramagnetic relaxation enhancement suggested the formation of transient protease homodimers under native conditions. Finally, it is shown that polypurine rich sequences of the foamy virus RNA are able to activate protease activity. Chemical analysis of the secondary structure of these RNA sequences indicated a characteristic hairpin loop structure. Retardation and protein crosslinking experiments prove the formation of stable PR-RT dimers in the presence of the polypurine RNA sequences. Based on these in vitro data we propose a model for foamy virus assembly.
-
Self-Organizing n-type Perylene Derivatives for Organic Photovoltaics – Synthesis, Characterization and Application
(2010)
-
André Dominik Wicklein
- Diese Dissertation beschäftigt sich mit der maßgeschneiderten Synthese und der Charakterisierung verschiedener selbst organisierender Perylenderivate als n-Typ Halbleiter-Farbstoff zur Anwendung in organischen Photovoltaik-Bauelementen. Dabei liegt der Schwerpunkt auf zwei unterschiedlichen Selbstorganisationsphänomenen von Perylenfarbstoffen mit definierter Molekülstruktur: Zum Einen auf der thermotropen flüssigkristallinen Anordnung diskotisch geformter Moleküle, zum Anderen auf der Selbstanordnung zu Organogelen und nanostrukturierten Netzwerken mit Hilfe von Wasserstoffbrückenbindungen oder geeigneter Lösungsmittel. Beide Formen der Selbstorganisation sind vielversprechende Ansätze zur Erhöhung des Wirkungsgrades von Solarzellen. So werden bei einer kolumnaren flüssigkristallinen Ordnung hohe intrakolumnare Ladungsträgermobilitäten in solch quasi eindimensionalen „Nanodrähten“ ermöglicht. Ein nanostrukturiertes Netzwerk hingegen gewährleistet definierte Ladungstransport-wege sowie eine große Grenzfläche zwischen dem Elektronenakzeptor und einem geeigneten Elektronendonator. Zur zielgerichteten Steuerung dieser Selbstorganisationsprozesse wurden geeignete Substitutionsmuster am Perylengerüst sowie adäquate Syntheserouten entwickelt. In diesem Zusammenhang stellte auch die Erweiterung der Absorption im sichtbaren Wellenlängenbereich mit dem Ziel einer effektiven Lichtsammlung einen wichtigen Aspekt dieser Arbeit dar. Das thermotrope Phasenverhalten der synthetisierten, diskotischen Perylenfarbstoffe wurde durch Differentielle Wärmeflusskalorimetrie (DSC), temperaturabhängige Polarisations-mikroskopie sowie temperaturabhängige Röntgendiffraktometrie umfassend untersucht. Morphologien unterschiedlicher Nanostrukturen wurden mittels der Rasterelektronen-mikroskopie (REM) und der Rasterkraftmikroskopie (AFM) charakterisiert. Zusammenfassend dargestellt präsentiert diese Dissertation das zielgerichtete molekulare Design und die effektive Synthese verschiedenartiger, selbst organisierender n-Typ Perylenderivate mit hervorragenden Absorptionseigenschaften und diversen molekularen Anordnungen. Darüber hinaus wurde gezeigt, wie solch selbst anordnende Farbstoffe geschickt in organischen Solarzellen integriert werden können.
-
Investigations on the Reaction Mechanism of Xenobiotic Reductase A
(2010)
-
Olivia Spiegelhauer
- Xenobiotic reductase A (XenA) from Pseudomonas putida 86 is a member of the Old Yellow Enzyme family of FMN containing enzymes. It catalyzes the NADH/NADPH dependent reduction of various substrates, including 2-cyclohexenone, coumarin, 7- and 8-hydroxycoumarin in a two-step mechanism consisting of a reductive and an oxidative half-reaction. The overall structure of the family members is similar but the active site residues show considerable variations. One distinct difference of XenA compared to other members is the presence of a cysteine residue (Cys25) in the active site, where most other members have a threonine. Further, the active site of XenA is lined up by two tyrosine (Tyr27 and Tyr183) and two tryptophan (Trp302 and Trp358) residues. To get a better understanding of the reaction mechanism of XenA we analyzed the enzyme using a combination of transient and steady-state kinetics, redox potentiometry and crystal structure analysis. Thermodynamic and kinetic investigations revealed a preference of XenA for NADPH over NADH. Furthermore, the reaction catalyzed by XenA follows a ping-pong mechanism in which both substrates are bound to the same position in the active site but interact with different amino acids. The crystal structures of XenA without and with coumarin bound to the active site were solved at true atomic resolution. The oxidized complex with coumarin showed a compressed active site geometry in which the isoalloxazine ring of FMN is sandwiched between coumarin and the protein backbone. The crystal structure of reduced XenA showed a distortion of the isoalloxazine ring and the movement of Trp302 into the active site. Furthermore, we analyzed the individual contributions of the five active site residues using site-directed mutagenesis. An exchange of Cys25 against serine shifted the reduction potential of the FMN/FMNH- couple by 82 mV, increased the limiting rate constant of the reductive and decreased the limiting rate constant of the oxidative half-reaction. Therefore we conclude that Cys25 modulates substrate binding and the reduction potential of FMN. Moreover, we revealed that Tyr27 contributes to the stabilization of the transition state during the reductive half-reaction by an interaction of its hydroxyl group with the transferred hydride ion. The exchange of Tyr183 resulted in a decreased affinity of XenA for NADPH and a considerable decrease of the rate of the oxidative half-reaction. These results are in agreement with its function as indispensable proton donor in the oxidative half-reaction. Exchanging Trp302 resulted in multiphasic kinetics for both half-reactions and a decreased affinity of XenA for NADPH. In combination with its movement between the reduced and oxidized state of XenA, we propose a redox dependent shaping of the active site by Trp302. Hence, this residue is responsible for the correct positioning of the substrates in both half-reactions, which is an essential part in the reaction mechanism. The results from the exchange of Trp358 indicated that this residue is involved in the orientation of the nicotinamide ring of NAD(P)H by spatial exclusion. Crystal structures of enzyme substrate complexes are usually determined from non-reactive states. The Y183F variant of XenA, lacking the proton donor of the oxidative half-reaction, allowed us to freeze-trap the true Michaelis complexes of reduced XenA in complex with four different substrates. For the first time we were able to observe 2-cyclohexenone in an active site. Finally, we prove that mode of substrate binding of XenA is redox dependent. In summary our results provide a more detailed description of the reaction mechanism of XenA and offer new insights on how substrates interact with flavoenzymes.
-
Towards a Better Physical Understanding of Human Hair: Development of Fiber Tribology-Methods at the Micro- and Nanoscale
(2010)
-
Eva C. Max
- Die Zielsetzung dieser Arbeit ist die Weiterentwicklung verschiedener physikalischer Messmethodiken zur Untersuchung von Mikrofaseroberflächen. Das zugrunde liegende System hierbei hat das Augenmerk auf die Veränderungen der Oberflächen von Haaren durch applizieren mit unterschiedlichen Shampooformulierungen. Fokussiert werden die physikalischen Veränderungen, einerseits in der Makro - und Mikroskala und andererseits in der Nanoskala. Haarpflegemittel wie Shampoos oder Conditioner spielen eine wichtige Rolle für unser Wohlbefinden und bieten einen weltweit attraktiven Markt für die Industrie. Von Seiten der Forschung wurde die Wirkungsweise und Adsorption von aktiven Wirkstoffen in Haarpflegemitteln deshalb intensiv untersucht. Im Gegensatz dazu stecken quantitative Messungen der Veränderungen in den Reibungs- und Wechselwirkungseigenschaften, die durch die Behandlung erreicht werden noch in den Anfängen. Unser Ziel ist hier, Methoden zu entwickeln, die es erlauben solche Eigenschaften zu untersuchen und damit die Basis für eine gezielte Optimierung von Haarpflegeprodukten zu bieten. Die wichtigsten aktiven Substanzen in Haarpflegemitteln sind kationische Polymere. In dieser Arbeit wurden drei der auf dem Markt käuflich erwerbbaren Polymere (Polyquaternium-10, Polyquaternium-87 und Jaguar C-13S) in Hinblick auf ihr Wechselwirkungsverhalten mit dem negativ geladenem Netzwerk der Haaroberfläche untersucht. Ein modifizierter Aufbau des so genannten Universal Oberflächen Testers lieferte Ergebnisse zu den Reibungseigenschaften von Haaren im Mikrometerbereich. Mit der Entwicklung einer neuen Messzelle und der Kalibrierung eines selbst konstruierten Messkopfes wurde das Instrument an das Haarfasersystem angepasst und optimiert. Das Material des Messkopfes (Styrol-Butadien-Kautschuk) wurde dem Material von herkömmlichen Kämmen angeglichen, um einen direkten Vergleich mit Ergebnissen, die aus der so genannte Kämmkraftmethode hervorgingen, zu ermöglichen. Der Schwerpunkt lag auf der Veränderung der auftretenden Reibungskräfte nachdem die Wirkstoffe auf das Haar aufgebracht wurden. Alle drei Polymere verursachten eine Reduktion der Reibungskräfte, die höchste konnte dabei dem Polymer Polyquaternium-87 zugeschrieben werden. Bei beiden Methoden werden jedoch viele verschiedene Wechselwirkungen detektiert, nämlich die Reibung zwischen den einzelnen Haaren, deren Verwicklungen untereinander, die Reibungen zwischen den kationischen Polymereren mit den Haaren und mit dem Kammmaterial und die Wechselwirkungen der Haare mit dem Styrol-Butadien-Kautschuk. Mit dieser Erkenntnis galt es einen Weg zu finden, der diese auftretenden Multikräfte voneinander separiert. Hierfür wurde der Aufbau eines Rasterkraftmikroskop so modifiziert um die Wechselwirkungen zwischen zwei einzelnen Haaren zu detektieren. In einem Rasterkraftmikroskop dienen mikrofabrizierte Blattfedern (Cantilever) als ultra-sensitive Kraftdetektoren, wodurch Kräfte im Bereich von 10^{-11} bis 10^{-5} N gemessen werden können. Um dieses Werkzeug zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einzelnen Haaren zu nutzen, wurden mit einem Laser-Skalpell Haarfragmente passender Größe (~50 µm) zurecht geschnitten und an den Cantilever fixiert. Dadurch konnten die direkten Wechselwirkungs- und Reibungskräfte zwischen einem Haarfragment und einem weiteren, auf der Oberfläche immobilisierten Haar, gemessen werden. Zunächst lag der Fokus darin, die auftretende Adhäsionskraft zu charakterisieren und mit einem statistischen Ansatz zu quantifizieren. Mit einem Wert der Adhäsionskraft von 38.08 ± 11.60 nN war es möglich anhand eines Kontinuumskontaktmechanikmodells nach Johnson, Kendall und Roberts die daraus resultierende Adhäsionsenergie pro Kontaktflächeneinheit zu 0.1124 {mJ/ m² zu ermitteln. Dieser relative kleine Wert kann unter anderem darin begründet liegen, dass die eigentliche Kontaktfläche zwischen dem Haarfragment und dem Substrathaar in Wirklichkeit relativ ungewiss ist, da die Schuppen auf der Haaroberfläche einige Mikrometer lang sind und eine Höhe von mehreren hunderten Nanometern besitzen. Solche Größenordnungen sind für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen von Wechselwirkungskräften riesig. es Weiteren wurde unter der eben erwähnten Aufbausmodifikation des Rasterkraftmikroskops ein Schwerpunkt auf die Ermittlung der auftretenden Reibungskräfte zwischen zwei einzelnen Haaren gelegt. Ein entscheidender Unterschied zu den vorangegangenen Messungen liegt darin begründet, dass die beiden Haare emph{in situ} mit den verschiedenen Polymeren behandelt wurden. Hierbei wurde einem Waschzyklus nachempfunden. Somit war es möglich nach der Behandlung mit den verschiedenen Polymeren die Änderung der Reibungskraft festzustellen. Die auftretende Reduktion der Reibung konnte in einem guten Einklang mit den Kämmkraftdaten gebracht werden. Genau wie bei diesen, erzielte das Polymer Polyquaternium-87 ein anderes Verhalten, verglichen zu den anderen beiden Polymeren. Bei den Einzelhaarmessungen wurde mit dem Polymer Polyquaternium-87 die geringste Reibungsreduktion gemessen. Ein Vergleich zwischen sogenannten Haptikprüftests und den Ergebnissen, die von den verschiedenen Messmethodiken dieser Arbeit erzielt wurden, eröffnet neue Wege solche Sinnestests physikochemisch zu quantifizieren.
-
Proton Transfer Networks and the Mechanism of Long Range Proton Transfer in Proteins
(2010)
-
Mirco Till
- The main energy providing reaction systems in living cells, for example the photosynthesis or the respiratory chain, are based on long range proton transfer (LRPT) reactions. Even since these LRPT reactions have been heavily investigated in the last decades, the mechanism of these reactions is still not completely understood. The reaction kinetics of the LRPT are under heavy discussion and it is not clear, whether the reorientation of the hydrogen bond network (HBN)or the electrostatic barrier for the charge transfer is rate limiting. The main purpose of this work is to investigate the dynamics of chemical reactions inside of proteins, focused on long range proton transfer reactions. Electron transfer reactions, rotations of water molecules or conformational changes of the protein are also considered. The developed sequential dynamical Monte Carlo (SDMC) method is applicable to almost all kinds of chemical reactions. For all proton transfer reactions, the HBN of a protein plays a major role. Protons are transferred along such hydrogen bonds. Therefore, knowledge about the hydrogen bond network of a protein is crucial for the simulation of LRPT systems. The HBN can be calculated from the protein structure and the rotational state of the amino acid side chains. The reaction rate can be calculated from the electrostatic energies of the participating proton donor and acceptor groups. These two criteria are combined for the decision if a proton transfer between two molecules is possible and how fast this transfer would happen. While the calculation of electrostatic energies of protonatable amino acid side chains or relevant cofactors in proteins (among them also water molecules) is already solved - implemented in various programs - the remaining tasks - calculating the hydrogen bond network followed by calculating the reaction rates - were solved during this work. Before the hydrogen bond network and the electrostatic energies could be calculated, the lack of water positions in many available crystallographically resolved protein structures made it necessary to develop an algorithm to detect internal cavities in proteins and fill these cavities with water molecules. The derived water positions could be included in the electrostatic calculations as well as in the calculation of the HBN. The simulation of the LRPT in Gramicidin A (gA) compared to experimental data of the proton transfer in this polypeptide showed the possibilities of the simulation of the LRPT by the SDMC algorithm. The promising results encouraged us to investigate the mechanism of the LRPT, especially, if the reorientation of the HBN or the electrostatic energy barrier of the charge transfer is rate limiting for the LRPT. The results indicate, that both effects influence the LRPT and none of them is exclusively responsible for the LRPT rate. Further analysis of the hydrogen bond network topology showed that graph algorithms can be used to analyze these networks. Hydrogen bond networks can be clustered into regions which are close connected to each other. On the other hand, residues connecting two or more of these densely connected regions might play an important role for proton transfer pathways since a loss of such residues cuts a proton transfer pathway. A comparison of an analysis of the HBN topology of the photosynthetic reaction center with mutation studies of the same system showed, that residues identified as important for proton transfer by the mutation studies are identified as connection points between clusters by the network analysis. The developed algorithms together with the introduction of a new method for the simulation of the LRPT process (SDMC) improved the picture of the proton transfer processes in proteins. Starting from the protein structure, the developed algorithms cover all steps from the detection of protein cavities, the placement of water molecules in these cavities, the calculation and analysis of the hydrogen bond network, the simulation of the LRPT and the investigation of the reaction kinetics. The analysis of the HBN by graph theoretical methods gives further insight into the HBN topology and identifies residues important for proton transfer pathways and therefore important for the protein activity.
-
ORMOCER (inorganic-organic hybrid polymer)-zeolite Nanocomposites: Advanced Membrane Materials for Gas Separation
(2010)
-
Suresh M. Kumbar
- This work represents a comprehensive study on the applicability of novel ORMOCER® (inorganic-organic hybrid polymer) resins for the fabrication of free-standing mixed matrix membranes. Such mixed matrix membranes comprise molecular sieve entities integrated in ORMOCER® matrix. Mixed matrix membranes have the potential to combine the processability of ORMOCER® materials with the superior transport and ion exchange properties of molecular sieves. The versatility of ORMOCER® materials is a decisive factor in achieving the desired separation properties of a novel mixed matrix membrane material. The glycerine-1,3-dimethacrylateurethanetriethoxysilane (GUS)-based ORMOCER® and dimethylsiloxane modified GUS-ORMOCER® resins were used for the fabrication of freestanding mixed matrix membranes. The zeolite Beta was used as a dispersed phase and its amount was varied between 10 to 40 wt.%. The effect of different type of zeolites was also studied using zeolite 3Å, 4Å, and 5Å. The membranes were prepared by conventional solution casting method followed by UV-curing. The ORMOCER® resins and cured membranes were analysed using FT-IR, liquid-state 29Si NMR, TG, DSC, SEM, N2 sorption and single-gas permeation measurements. The permeation performance of the membranes was examined using H2, He, CO2, O2 and N2 as a test gases at room temperature, the upstream pressure was varied between 1.3 to 2.5 atm. The effect of the amount of dimethylsiloxane moiety, zeolite content, different zeolite type and annealing temperature were systematically investigated in relation to the gas permeation performance of the membranes. The addition of dimethylsiloxane moiety in GUS-based ORMOCER® membrane appears to result in a significant increase in gas permeability, with a correspondingly large decrease in selectivity. The mixed matrix membranes show improved gas permeation performance in comparison to pure ORMOCER® membranes. This study was shown important role of zeolite particles in inorganic-organic hybrid (ORMOCER®) system. The potential usefulness of ORMOCER®-zeolite mixed matrix membranes as gas separation membranes is discussed.
-
Novel Metal Amido-Complexes – Syntheses, Reactivity and Asymmetric Catalysis
(2010)
-
Kathrin Kutlescha
- In the context of this thesis two classes of novel imidazo[1,5-b]pyridazine-substituted amines 2 were developed. Imidazo[1,5-b]pyridazine-substituted amines can be synthesized in high purity and good yields via the nucleophilic ring transformation of oxadiazolium halides 1 and N-nucleophiles, followed by deacetylation and cyclocondensation with 1,3-diketones. The deprotonated amines can act as monoanionic amido-ligands. Previous results regarding diamine-bridged imidazo[1,5-b]pyridazines have shown, that the deprotonated compounds are suitable for the stabilization of early as well as late transition metal complexes. Since only dinuclear group 9 metal complexes could be obtained, one objective of this work was to enable the synthesis of mononuclear amido-complexes by means of a novel ligand structure. Thus, a series of imidazo[1,5-b]pyridazine-substituted (pyridylmethyl)amines was synthesized via a one-pot approach. Salt metathesis or alcohol elimination route were chosen for the synthesis of the iridium amido-complexes. The (2-pyridylmethyl)amine-derived complexes exhibited an unusual reactivity in solution. An intermolecular C-C coupling reaction of the mononuclear complexes was observed, yielding a dimeric species. Based on mechanistic and kinetic investigations, it was postulated that the coupling reaction is due to tautomerization yielding an enamido hydrido complex, which subsequently undergoes an intermolecular attack. This gives rise to the dimeric species with iridium mediated hydrogen evolution. Because of the modular ligand design, optically active imidazo[1,5-b]pyridazine-substituted amines can easily be obtained via the utilization of chiral N-nucleophiles such as amino alcohols. Motivated by previous results regarding chiral imidazo[1,5-b]pyridazine-stabilized iridium amido-complexes, which exhibit high selectivities and good activities in the asymmetric hydrogenation of ketones, the development of amido-complex catalysts for the enantioselective hydrogenation of imines represents a major focus of this work. A library of novel amines 4 was synthesized by deprotonation of the hydroxyl function of 3 with nBuLi followed by the addition of chlorophosphines or chlorophosphite. Alcohol elimination reaction of 4 with 0.5 equiv. of [MOCH3(cod)]2 (M= Ir, Rh) gave rise to transition metal amido-complexes, which were applied to the asymmetric hydrogenation of N-aryl imines. Upon activation with KOtBu moderate initial selectivities and good activities were obtained for rhodium amido-complexes. Following the optimization of the reaction conditions (temperature, pressure, base) a ligand screening was performed. The highest activities and selectivities in the asymmetric hydrogenation of various imines were obtained by combining electron donating P-substituents (iPr) and amino alcohols (iBu). Additionally, the catalyst loading was reduced from 1 mol%, which represents the common usage, to only 0.1-0.2 mol%. Thus, a novel ligand motif, based on chiral imidazo[1,5-b]pyridazines, was established for the efficient rhodium-catalyzed asymmetric hydrogenation of N-aryl imines. In the third section of this thesis a novel potassium-mediated synthesis of 6-aminofulvenes from N-aryl imines is introduced. During the hydrogenation experiments regarding the optimization of the added base, the formation of a by-product was observed, if potassium hydride was utilized as a base. The by-product could be identified as novel 6-aminofulvene, namely [(2,4-diphenyl-cyclopenta-2,4-dienylidene)-phenyl-methyl]-phenyl-amine. Upon this exciting discovery, the reaction conditions leading to fulvene formation were explored by means of reaction stoichiometry and added base. The resulting novel synthesis route was applied to various N-aryl imines. Mechanistic as well as kinetic investigations indicated, that the reaction is based on the formation of the metalated enamine, which nucleophilicly attacks the imine-carbon. The herein reported new synthesis method provides an easy access to novel 6-aminofulvenes.
-
Von der Faltung zur Funktion: Steuerung des Infektionsmechanismus filamentöser Phagen durch Faltungsprozesse und Beschleunigung oxidativer Faltung durch Thioloxidasen
(2010)
-
Stefan Lorenz
- Die filamentösen Phagen IF1 und fd sind eng miteinander verwandt. Dies spiegelt sich auch bei der Infektion von E. coli Zellen wider, die bei beiden Phagen nach einem Zweischrittmechanismus abläuft, der durch die jeweiligen Gen-3-Proteine (G3P) vermittelt wird. Im ersten Schritt bindet die N2 Domäne von G3P an den bakteriellen Pilus, beim Phagen IF1 an den I Pilus, beim Phagen fd an den F Pilus. Durch die spezifische Bindung an einen Pilus bestimmt die N2 Domäne von G3P die Wirtsspezifität des Phagen. Im zweiten Schritt der Infektion interagiert in beiden Fällen die N1 Domäne mit dem bakteriellen Rezeptor TolA-C. Die N1 Domänen der G3Ps beider Phagen binden mit demselben Bindungsmuster an die gleiche Stelle von TolA C, wie die Röntgenstrukturanalyse der beiden Komplexe zeigt. Der molekulare Mechanismus der Infektion unterscheidet sich, da die G3Ps der Phagen IF1 und fd eine verschiedenartige Domänenorganisation besitzen. Im G3P des Phagen IF1 stellen N1 und N2 zwei eigenständige und stabile Einheiten dar, die Bindungsstellen für den I Pilus und TolA-C sind daher permanent zugänglich. Das native G3P des Phagen fd liegt dagegen in einer geschlossenen, inaktiven Konformation vor, in der N1 und N2 fest miteinander assoziiert sind und die Bindungsfläche für TolA-C auf N1 in der Grenzfläche zwischen N1 und N2 verborgen ist. Erst die Bindung von N2 an den bakteriellen F Pilus führt zur Domänendissoziation, wodurch die Bindungsstelle für TolA C auf N1 zugänglich wird. Dieser komplexe Infektionsmechanismus des Phagen fd konnte in den einfacheren Infektionsmechanismus des Phagen IF1 überführt werden, indem die Domäneninteraktion durch die Deletion von sieben Aminosäuren im Gelenkbereich zwischen N1 und N2 aufgelöst wurde. Eine Erhöhung der Infektionsraten auf das Niveau des Referenzphagen fd wurde durch eine nachträgliche selektive Stabilisierung der N2 Domäne erreicht. Die Phagen fd und IF1 entwickelten unterschiedliche Strategien um Infektiosität und eine hohe thermodynamische Stabilität der G3Ps zu vereinen. In IF1 G3P bildeten sich zwei eigenständige, stabile Domänen aus, in fd G3P hingegen etablierte sich eine geschlossene Konformation, in der die labile N2 Domäne durch eine starke Assoziation mit der N1 Domäne stabilisiert wird. Die Notwendigkeit der Domänendissoziation in G3P während der Infektion durch den Phagen fd wurde durch die Konstruktion eines G3Ps nachgewiesen, in dem N1 und N2 durch eine Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Diese Verknüpfung verhindert die Domänendissoziation und folglich die Infektion. Das Phagenkonstrukt mit dieser G3P Variante als Vermittler der Infektion ermöglicht eine steuerbare Infektion, die durch Reduktion der Disulfidbrücke induziert werden kann. Die Konstruktion von Disulfidbrücken wurde ebenfalls benutzt, um die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlpA zu stabilisieren. In weitergehenden Untersuchungen werden die Disulfidbrücken in das Volllängenprotein SlpA eingebaut, um die Auswirkung dieser entropischen Stabilisierung auf Funktion und Stabilität des Zweidomänenproteins analysieren zu können. Die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlyD, die in isolierter Form ungefaltet vorliegt, konnte ebenfalls durch den Einbau einer Disulfidbrücke stabilisiert werden. Die konformationelle Faltung dieser stabilisierten Variante ist strikt an die Ausbildung der Disulfidbrücke gekoppelt. Daher eignet sich dieses Protein hervorragend als Substrat, um die Beschleunigung der oxidativen Faltung durch Thioloxidasen zu charakterisieren. Die Effizienz der Katalyse der oxidativen Faltung korreliert dabei nicht mit dem Reduktionspotential der Faltungshelfer, sondern mit der Fähigkeit nicht-native Substratproteine über hydrophobe Bindungsflächen, hier Chaperondomänen, zu binden. Die Bindung nicht-nativer Substrate über Chaperondomänen, sowie ein geeignetes Reduktionspotential des katalytischen Disulfids, sind ebenfalls Voraussetzungen für eine Disulfidisomeraseaktivität von Faltungshelfern. Deshalb besitzen PDI und DsbC neben einer hohen Thioloxidaseaktivität auch eine hohe Disulfidisomeraseaktivität. Für diese Untersuchungen wurde ein sensitiver Test auf Grundlage der Reaktivierung fehlgefalteter RNase T1 und der Hydrolyse von Fluorophor-markierten Oligonukleotiden etabliert und zur Analyse von PDI, DsbC und DsbA eingesetzt. Mia40 ist eine neuartige Thioloxidase im Intermembranraum von Mitochondrien. Für Mia40 konnte die Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,3 Å gelöst werden. Mia40 zeigt keine strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Thioloxidasen. Wie viele andere Faltungshelfer wirkt Mia40 als Chaperon, in vitro verhindert es effektiv die Aggregation rückfaltender Citratsynthase. Mia40 zeigt in vitro lediglich Oxidase-, aber keine Disulfidisomeraseaktivität. Ob Mia40 in vivo ausschließlich als Thioloxidase wirkt, oder bei speziellen Substraten doch fehlerhafte Disulfidbrücken auflösen kann, ist noch unklar und Gegenstand weiterführender Forschungsarbeiten.
-
3-Funktionalisierung von Tetron- und Tetramsäuren - Beiträge zur Totalsynthese von Bakkenolid-A und Macrocidin A
(2010)
-
Bertram Barnickel
- Ziel des ersten Projekts dieser Arbeit war die Totalsynthese von Bakkenolid A. Der Schlüsselschritt hierfür war die Entwicklung einer regioselektiven Methode zur 3-Funktionalisierung von Tetronaten mittels Pentadienyl-Verbindungen. Bis zur Realisierung der Reaktion waren detaillierte Untersuchungen bezüglich deren Reaktionsmechanismus und der damit einhergehenden Regioisomere nötig. Durch die Synthese diverser Pentadien-Buildingblocks konnte letztlich der optimale Reaktionspartner für eine regioselektive Tsuji-Trost-Reaktion gefunden werden. Eine vollständige Synthese von Bakkenolid A scheiterte jedoch aufgrund unüberwindbarer, sterischer Hinderung bei der anschließenden Diels-Alder Reaktion. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Totalsynthese von Macrocidin A angestrebt. Ein zentraler Teil der Retrosynthese-Strategie beruhte auf der erfolgreichen 3-Acylierung von Tetramsäuren gemäß Yoshii et al. Da die Ausbeuten dieser Methode aufgrund des bis heute ungeklärten Mechanismuses sehr schwer vorherzusagen sind, wurden deren Möglichkeiten detailliert untersucht. Hierbei zeigte sich eine starke Abhängigkeit von der Kettenlänge und v.a. dem Verzweigungsgrad in α-Position der verwendeten Carbonsäure. Die so erhaltenen 3-Acyl-Tetramsäuren wurden in ihre partiell bzw. global entschützten Derivate überführt und somit eine Substanzbibliothek aufgebaut. Diese wurde bezüglich ihrer cytotoxischen bzw. antibakteriellen Wirksamkeit untersucht. Hierbei konnten einige Verbindungen mit IC50-Werten im einstelligen µM-Bereich identifiziert werden. Die Erstellung einer eindeutigen Struktur-Wirkungs-Beziehung gelang allerdings nicht. Der entscheidende nächste Schritt in Richtung Totalsynthese von Macrocidin A war der Ringschluss zum 17-gliedrigen Makrocyclus. Ursprünglich nur als Entschützung der Phenol-Funktion geplant, gelang durch Palladium-Katalyse der direkte Ringschluss eines Nor-Macrocidin A Precursors. Hierbei handelt es sich um eine bis dato unbekannte, mit einer Williamson-Ether-Synthese vergleichbaren Methode zur Synthese von Makrocyclen.
