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The Effect of Zr-Doping and Crystallite Size on the Mechanical Properties of TiO2 Rutile and Anatase
(2008)
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Eva Susanne Holbig
- TiO2 is an important technological material, used as white pigment, as wide band gap semiconductor in electrochemical dye solar cells, for photocatalysis and in photochemical energy-conversion processes. The most abundant phases are rutile, anatase and brookite. In addition, there are a number of metastable low density modifications. The compression behavior of anatase and rutile was studied for TiO2 and Ti0.9Zr0.1O2 starting materials with crystallite size in the micro- and also nanometer range. Quenched samples of rutile, anatase and high pressure polymorphs synthesized at up to 10 GPa adopt 10 mol% ZrO2, Zr-doped TiO2 starting materials therefore have the composition Ti0.9Zr0.1O2. Compression experiments were carried out in the diamond anvil cell and samples were characterized by in-situ X-ray diffraction, X-ray absorption and Raman spectroscopic measurements. A sol-gel route was developed for the synthesis of nanoscale anatase Tix:Zr1-xO2 with x=0.90 and 1.0, which was annealed at 1000°C to microscale rutile. In hydrothermal experiments, nanoscale anatase Ti0.9Zr0.1O2 was used as starting material for the synthesis of microscale Zr-doped anatase. Neither the incorporation of Zr nor the decrease of crystallite size to the nanometer range modifies the bulk modulus of rutile. These results are different from those of anatase, where a decreasse of crystallite size and doping with Zr leads to an increase of the bulk modulus. Second order EoS fits (K0’=4) resulted in a bulk modulus of microscale anatase of K0=178 GPa and K0=179 GPa. The nanoscale counterpart shows much higher values of K0=237 GPa and K0=243 GPa. In this study, it was found that microscale anatase Ti0.90Zr0.10O2 has K0=195 GPa, which is comparable to undoped material. Largest values were found for nanoscale anatase Ti0.90Zr0.10O2 with K0=258 GPa. Zr-doping thus reduces the compressibility of nanoanatase, even though ZrO2 polymorphs are more compressible than the corresponding TiO2 forms. For the Zr-doped nanoanatase, XRD analysis showed a significant change in compression behavior at pressures 4 GPa, suggested as a consequence of deviatoric stresses during experimental compression of the nanoscale material. Computations on supercells with different distances of neighboring Zr-atoms suggested cluster formation of Zr in the (Ti,Zr)O2 anatase. The resulting structural distortions can further augment the change in compression behavior. Zr-doped nanoanatase becomes stiffer upon multiple compression cycles. While the bulk modulus of the first compression was 211 GPa, after the sample was decompressed, the second compression showed a bulk modulus of 249 GPa. We suggest that partial pressure induced amorphization plays an important role for the observed stiffening. Anatase and rutile TiO2 transform to the MI phase upon compression. The transition pressure increases with a decreasing crystallite size from 12 GPa for microscale material to 18 GPa for crystallite size of 12 nm. For anatase, smaller particles transform to an amorphous phase at pressures of 20–24 GPa. Zr-doping does not seem to vary the transformation pressure. Ab-initio all-electron density functional electronic structure simulations on the ground state energetics of the TiO2 phases rutile, anatase, brookite, TiO2II and MI-phase were performed using the projector augmented wave and the linear augmented plane wave methods along with local density approximation (LDA) and two types of generalized gradient approximations (GGA), using the formulations by Perdew, Bunge and Enzerhoff, referred to as PBE, and by Wu and Cohen, reffered to as WC. The zero pressure volumes are predicted smaller by <3% in LDA computations and larger by 8 and 0.4% in PBE and WC computations. The stable structure at 0 GPa is baddeleyite for LDA computations and anatase for GGA computations, contradicting experimental results that determine rutile as the most stable phase. Rutile appears to have the highest energy in LDA computations and intermediate energy in GGA computations.
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Characterization of SsoSSB, Sso1450, Sso2001 Proteins and Analysis of CRISPR and cas Genes from Sulfolobus solfataricus P2
(2008)
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Dong Han
- Following the complete sequencing of the genome of Sulfolobus solfataricus (Sso) P2, this organism has been widely used as a model strain for crenarchaea. The present work concentrated on the characterization of a newly discovered single-stranded binding (SSB) protein from Sso P2 and the computational and experimental analyses of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (cas) genes, respectively. The DNA-binding properties of SsoSSB, the organization of the CRISPR loci and the biochemical properties of some of the cas gene products of Sso P2 were studied. Size-exclusion chromatography indicated that SsoSSB exists as a monomer in solution. Using fluorescence anisotropy as a method to study the interaction of SsoSSB to DNA, it can be shown that SsoSSB binds as a monomer to small oligonucleotides. The approximate binding site size is 4- 6 nt per protein molecule as determined by native electrophoresis. SsoSSB shows a more than 10 fold higher binding affinity to single-stranded (ss) DNA as compared to double-stranded (ds) DNA, which is consistent with former reports. The dissociation constant could be determined to be in a low nanomolar range. Furthermore, SsoSSB preferentially binds to pyrimidine-rich ssDNA as compared to purine-rich DNA. This property is similar to that observed for human replication protein A (RPA). The clustering of repeat sequences in CRISPR loci and the associated cas genes have emerged recently as a new genomic feature of Archaea and of some Bacteria. Formerly, the cas genes have been predicted to encode repair proteins. In the present work, five CRISPR loci and their cas genes in Sso P2 were analyzed with respect to their genomic organization. The repeats of the CRISPR loci show highly conserved sequences at regular intervals, separated by spacer sequences of similar size. Most of the cas gene groups flanking a CRISPR locus contain homologous genes that were also found at other CRISPR loci. The cas genes could be grouped by gene location and gene order. Mostly, in each group they were head-to-tail arranged implying a functional relation. The operons of the cas genes sso1996-2002, sso1438-1443 and sso1398-1403 could be shown to contain Transcription Factor B recognition element (BRE), TATA-box, Shine-Dalgarno and terminator sequences specific for Sulfolobus. Most cas genes could not be expressed in a soluble form in E.coli, even when the expression conditions were widely varied. Refolding of the insoluble proteins was then undertaken. sso1442, sso1996 and sso1997 could be expressed in partially soluble form in E.coli, however catalytical activities could not be identified for these proteins. Refolding of Sso1999, a putative helicase, yielded a soluble protein. However no helicase and ATPase activity could be detected in the renatured Sso1999. Defined biochemical activities could be only assigned to the proteins Sso1450 and Sso2001. In the latter case, the sso2001 gene was fused with an esterase gene from Alicyclobacillus acidocaldarius, and was co-expressed in a soluble form. The enzymatic screening indicated that Sso2001 harbored a nuclease activity. Further experiments showed that Sso2001 was an endonuclease with specificity for cleavage near G residues. The nuclease activity was optimal at the neutral pH range with another activity peak at pH 3. Specific point mutations introduced in Sso2001 indicate that this protein was not a HD-family nuclease as previously predicted. The protein Sso1450 (COG1518), which is considered to be a marker protein of the CRISPR and Cas system, bound nucleic acids, including ssDNA, dsDNA and RNA, with high affinity. The dissociation constant of binding to DNA oligonucleotides was in the nanomolar range. EMSA experiments indicated an aggregation of Sso1450 on the DNA substrates. Interestingly, Sso1450 promoted the annealing of complementary ssDNAs. This finding supported a role of Sso1450 in the recombination of repeat sequences of the CRISPR system as suggested by Koonin’s group (Makarova et al., 2006). The CRISPRs were thought to play a major role in a newly discovered genome immune system in prokaryotes.
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Die Regulation der prokaryontischen Transkription auf molekularer Ebene
(2008)
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Stefan Josef Prasch
- In Escherichia coli wird die RNA-Synthese durch eine aus fünf Untereinheiten bestehende RNA Polymerase (RNAP) katalysiert. Für die Bildung der Phosphodiesterbindung in der RNA sind die beta- und beta’-Untereinheiten verantwortlich. Die aminoterminalen Domänen der beiden alpha-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau zuständig, während die durch einen flexiblen Linker verbundenen carboxyterminalen Domänen (alphaCTD) regulatorische Aufgaben erfüllen. Die zuletzt entdeckte omega-Untereinheit fördert ebenso den Aufbau, ist aber für das Überleben von Escherichia coli nicht notwendig. Der Ablauf der Transkription wird begrifflich in die Initiation, Elongation und Termination eingeteilt. Bei der Initiation bindet ein so genannter sigma-Faktor an die RNAP. Das so entstandene Holoenzym erkennt den Promotor und startet die RNA-Synthese. Der sigma-Faktor verlässt die RNAP, es bildet sich der Transkriptionselongationskomplex, der zu einer stark gesteigerten RNA-Syntheserate führt. Im letzten Schritt erfolgt der Kettenabbruch, woraufhin freigewordene RNAP erneut einen Transkriptionszyklus starten kann. Eine zentrale Rolle bei der Regulation der Elongation und Termination spielt das essentielle NusA Protein (N utilization substance A), das im Verbund mit NusB, NusE und NusG, vor allem die Geschwindigkeit der RNA-Synthese steuert. Der Aufbau von NusA aus sechs Domänen spiegelt die vielfältigen Aufgaben des Proteins. Die aminoterminale Domäne vermittelt die Interaktion mit der RNAP. Die RNA-Bindungsregion wird durch die S1-, KH1- und KH2-Domänen aufgebaut. Die beiden carboxyterminalen acidic repeats AR1 und AR2 erfüllen jeweils unterschiedliche Aufgaben, die bisher nur zum Teil aufgeklärt sind und im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Eine weitere Rolle spielt NusA bei der Antitermination. Dieser zuerst im Phagen lambda entdeckte Mechanismus bewirkt, dass die Transkription nicht an einem Terminationssignal abbricht. Das dafür notwendige Antiterminationssignal besteht aus zwei bestimmten RNA-Sequenzabschnitten, boxA und boxB, die durch eine Trennsequenz miteinander verbunden sind. Während die boxA sowohl im Phagen lambda als auch in den für die ribosomale RNA codierenden Operons stark konserviert ist, weist die boxB in den beiden genannten Fällen nur geringe Gemeinsamkeiten auf. Das NusA Protein bindet an das Antiterminationssignal und an die RNAP. Die so veränderte RNAP ist nun in der Lage, stromabwärts gelegene Terminationssignale zu überlesen. In dieser Arbeit wurde zuerst die Rolle der AR1 Domäne untersucht. Eine bereits bekannte Kristallstruktur zeigt AR1 in Komplex mit lambda N. Jedoch fehlt in dieser Struktur die zweite Hälfte des lambda N Bindungsmotives (Aminosäurereste 42 bis 47), ebenso wie AR2, was zur Vermutung führte, dass diese Domäne lambda N(42-47) binden könne. Zur Klärung dieser Frage wurden die beiden Domänen AR1 und AR2 jeweils einzeln kloniert und im Hinblick auf ihre Bindung an das lambda N Protein getestet. In dieser Arbeit wurde eine ausschließliche Bindung von AR1 an lambda N gefunden, inklusive der in der Kristallstruktur fehlenden Aminosäurereste. Zusätzlich induziert AR1 bei der Bindung eine helikale Konformation im Bereich des Arginin-reichen Motives von lambda N (Aminosäurereste 1 bis 22), wodurch ein theoretisches Modell der lambda N Funktionsweise bestätigt wurde. Zudem wurde die Interaktion von NusA-AR2 charakterisiert. Biochemische Daten ließen auf eine Wechselwirkung von NusA mit alphaCTD schließen. Basierend darauf wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass in diesem Fall ausschließlich AR2 für die Wechselwirkung mit alphaCTD verantwortlich ist. Mit Hilfe von NMR-Experimenten wurde im Anschluss daran die Komplexstruktur berechnet. Die resultierende Bindungsfläche seitens alphaCTD lieferte dabei Rückschlüsse, wie NusA möglicherweise die RNAP von der Initiations- in die Elongationsphase überführt. Ebenso erlaubten die neu gewonnenen Ergebnisse einen Vergleich der Bindungseigenschaften von AR1 und AR2. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Wechselwirkung von NusA mit dem Antiterminationssignal studiert. Dazu wurde eine NusA Deletionsmutante kloniert und gereinigt, die ausschließlich aus den bisher vermuteten RNA-Bindungsdomänen S1, KH1 und KH2 bestand. Anhand der gemessenen Fluoreszenzanisotropie-Daten wurde die Bindung im Bereich der Trennsequenz lokalisiert. Die schwächere Affinität des Phagen lambda Signals nutL und nutR im Vergleich zur ribosomalen RNA erklärt die Notwendigkeit des zusätzlichen Faktors lambda N im Phagen System.
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Early Transition Metal Complexes Stabilized by Bulky Aminopyridinato Ligands
(2008)
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Awal Noor
- A series of early transition metal complexes stabilized by aminopyridinato ligands have been synthesized. Many of these complexes have been studied in terms of their structure and have been evaluated in terms of applications in catalysis. The overall evaluation tells about the importance of electrophilicity of the metal centre, the steric bulk of the applied ligands, and the route of syntheses. Trialkyltantalum complexes were synthesized by salt elimination or toluene elimination by reacting the corresponding lithiated ligand with trialkyltantalum dichloride or the corresponding ligand with pentabenzyltantalum, respectively. These trialkyltantalum complexes are unusually thermally stable towards alpha-H elimination and form rather unstable organocations. Bis(aminopyridinato) complexes of zirconium were prepared using salt elimination route. The steric bulk of the ligands prevented the redistribution to tris- or tetrakis(aminopyridinato) zirconium complexes. These zirconium complexes are thermally robust, highly active and selective ethylene polymerization catalysts. Ethylene is polymerized highly selectively out of a mixture of ethylene and propylene. Slight changes in the steric demand of the bulky ligand periphery can be used to tune the nature of the formed polymers by maintaining the selectivity issue. The Zr alkyl cations of the sterically more demanding version of the ligands are able to polymerize ethylene in a living fashion at 50 °C. We also became interested in toluene elimination chemistry and observed that the bulky aminopyridinates that give selectively bis(aminopyridinato) complexes via salt metathesis chemistry lead selectively to mono(aminopyridinato) tribenzyl Zr/Hf complexes. In the solid state, one of the three benzyls is eta -2-coordinated and rest are eta-1-coordinated to the electron deficient metal centres. One of the three benzyls has been partially abstracted using B(C6F5)3. The phenyl ring of B-bounded benzyl in these complexes shows an eta-6-coordination and essentially blocks the vacant site of the metal centre, consequently, preventing it to polymerize ethylene at room temperature. At elevated temperature a moderate single site polymerization activity with the formation of high molecular weight polyethylene was observed for these zwitterionic complexes. The attempted abstraction of the second benzyl group failed when the zwitterionic complexes were reacted with an additional equivalent of B(C6F5)3. However using one equivalent of [R2(Me)NH][B(C6F5)4] (R = C16H33–C18H37) instead of B(C6F5)3 give catalysts which show moderate activities in ethylene polymerization. Treatment of the aminopyridinato metal tribenzyls with [R2(Me)NH][B(C6F5)4] (R = C16H33–C18H37) give active ethylene polymerization catalysts, which produce low molecular weight polyethylene for the zirconium complexes and high molecular weight for the hafnium ones. Propylene polymerization under the same conditions failed, whereas during copolymerization ethylene-propylene copolymers with separated propene units and alternating sequences were observed. The versatility of these ligands was flourished by synthesizing a titanium alkyne complex stabilized by aminopyridinato ligands which may show a very multifaceted chemistry. The reactivity of this complex was studied by the insertion of acetone into titanium carbon bond. The complex is not only quite stable at room temperature but also in solution at high temperatures under argon atmosphere despite a weakly bonded acetylene ligand. The chemistry of low valent chromium stabilized by sterically demanding aminopyridinato ligands has been explored and first non-bridging η2-coordinated chromiumII complexes were synthesized using such ligands. It was foud that reacting deprotonated ligands of the same steric bulk with the corresponding salts of the low valent chromium II/III can lead to mono(aminopyridinato) dimeric chromiumII or monomeric chromiumIII complexes, respectively. It is worth to note that gradual decrease in the steric bulk leads to bis(aminopyridinato) mononuclear chromium complexes. The ability of aminopyridinato ligands to stabilize transition metals in low oxidation state has been highlighted by the synthesis of a dimeric chromiumI complex. The X-ray crystal structure analysis revealed an exceptionally short chromium-chromium distance of 1.7488(18) Å, the shortest metal-metal bond reported so far for a stable compound. The homobimetallic chromium complex was synthesized by the reduction of aminopyridinato ligand stabilized chromiumII/III chloride precursor with KC8. Anaylsis of its electronic structure indicates quintuple bonding.
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Silika-Hybridmaterialien für Antifogging-Beschichtungen
(2008)
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Ingo Zeitler
- Ausgehend von einem wasserlöslichen Silica-Precursor wurden zunächst die Eigenschaften der reinen Silicagele näher untersucht. Von Interesse war hierbei der Einfluss von Salzen, die Bestimmung der Schrumpfung der Gele während der Trocknung (bis zu 70%), die Ermittlung der spezifischen Oberfläche der Aerogele mittels BET (300 – 1200m²/g), die Netzwerkstrukturen, die mittels Rasterelektronenmikroskop abgebildet wurden, das Verhalten der Gele bei Temperaturerhöhung, sowie die Wasserdampf-Adsorptionseigenschaften der Aerogele. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zusätzliche Precursormoleküle in die Gele eingebaut, die eine nicht hydrolysierbare, hydrophile Seitenkette besitzen. Auf diese Weise konnte die Schrumpfung der nassen Gele während der Alterung unterdrückt werden, nicht jedoch während der Trocknung, bei der die Schrumpfung zwar auf nur noch ca. 3 vol% deutlich abnimmt, aber nicht gänzlich ausbleibt. An den REM-Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Netzwerkstruktur aus 1-2 nm kleinen SiO2-Clustern besteht, die sich zunächst zu 10-20 nm großen Partikeln zusammenlagern, welche wiederum das 3D-Netzwerk bilden. Die Erhöhung der Hydrophilie der Aerogele durch die hydrophilen Seitenketten hat jedoch keinen Einfluss auf die absolute Wasseradsorption der Aerogele. Diese Additive können auch die Schrumpfung der Aerogele während der Wasserdampf-Absorption nicht verringern. Im dritten Teil der Arbeit wurde der Einbau von Polymerpartikeln aus PE bzw. PTFE in die Silicagele durchgeführt. Auf diese Weise wurden neuartige Hybridmaterialien synthetisiert, die aus organischen Polymeren in einer festen anorganischen Matrix bestehen. Durch Tempern der Materialien konnten die organischen Partikeln miteinander verschmolzen werden, was zu verbesserten mechanischen Eigenschaften der Aerogele führt. In REM-Aufnahmen wurde gezeigt, dass dieses Hybridmaterial aus „Interpenetrierenden Netzwerken – IPN´s“, einer Koexistenz eines organischen in einem anorganischen Netzwerk, besteht. Die Hydrophilie und die Adsorptionseigenschaften des SiO2-Netzwerks bleiben dadurch nahezu unverändert. Im vierten Teil der Arbeit gelang es Hybridmaterialien aus SiO2 und hydrophilen organischen Polymeren wie z.B. Polyacrylsäure oder Polydiallydimethylammoniumchlorid als monolitische Gelkörper mittels Sol-Gel-Prozess herzustellen. So konnten neuartige hydrophile Systeme entwickelt werden. Aufgrund der Wasserlöslichkeit des verwendeten Precursors und der Tatsache, dass dieser kein Ethanol oder Methanol während der Hydrolyse freisetzt, konnten nun neben neutralen Polymeren auch Polyelektrolyte eingebaut werden, ohne dass es zu Ausfallerscheinungen des Polyelektrolyten kommt. Die Porosität des Aerogels geht dabei mit steigendem Polymeranteil verloren, wohingegen die Wasserdampf-Absorptionsleistung gegenüber den reinen SiO2-Aerogelen deutlich gesteigert wird. Durch kovalente oder ionische Bindung können die Polymere an das SiO2-Gerüst gebunden werden, wodurch eine Auswaschung der Polymere bei Wasserkontakt effektiv verhindert wird. Im letzten Teil der Arbeit wurden aus den Silica-Solen mit hydrophilen Polymeren neuartige Antifogging-Beschichtungen auf Wasserbasis entwickelt. Die Beschichtungen können an Luft getrocknet werden, wobei sie auf ca. 1/100 ihrer Nassfilmdicke schrumpfen. Die Trockenfilmdicken betragen zwischen 0,5 und 10 µm. Die Beschichtungen zeigen einen sehr guten Antifogging-Effekt und sind nach dem Trocknen nicht mehr aus- bzw. abwaschbar. Die Universalhärte HU der Filme liegt bei ca. 1500 – 2400 N/mm². Diese ist zwar etwas geringer als die von reinem Glas (ca. 4000 N/mm²), übersteigt jedoch die von organischen Gläsern wie z.B. Plexiglas oder Polycarbonat (300 – 400 N/mm²) um ein Vielfaches. Die Kratzfestigkeit der Filme ist dadurch sehr gut. Im Gegensatz zu Filmen aus den reinen Polymeren sind die Hybridfilme sowohl im trockenen als auch im nassen Zustand nicht klebrig. Während der Adsorption nimmt der Film Wasser aus der umgebenden Atmosphäre auf und quillt dadurch um bis zu 100 % seiner Filmdicke. Beim Übergang der Beschichtungen von einer trockenen, kalten Atmossphäre in eine Atmosphähre mit Raumtemperatur bei 60% rel. Luftfeuchte – eine für Brillenträger im Winter typische Situation - bleibt bis zu einer Ausgangstemperatur von -7 °C eine Antifogging Wirkung erhalten. Es kommt im Gegensatz zu anderen aus der Literatur bekannten Antifogging-Filmen zu keiner Wasserfilmbildung auf der Beschichtung. Die hergestellten Antifogging Filme erfüllen demnach einen Großteil der bereits genannten gewünschten Eigenschaften.
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Electrostatic and quantum chemical investigation of the proton pumping mechanism of cytochrome c oxidase
(2008)
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Munusami Punnagai
- Cytochrome c oxidase is a crucial enzyme in the respiratory chain. It catalyzes the reduction of oxygen to water and utilizes the free energy of the reduction reaction for proton pumping across the inner-mitochondrial membrane, a process which results in a membrane electrochemical proton gradient. For each oxygen molecule, eight protons are taken up from the matrix of the mitochondria. Four protons together with four electrons are required to reduce oxygen to water at the Fea3 -CuB binuclear center and another four protons are translocated across the membrane. Although several high resolution structures have been solved for this enzyme, the molecular mechanism of the proton pumping and electron transfer is not understood. Recent studies on the cytochrome c oxidase CuB center suggested deprotonation of the CuB bound imidazole ring of histidine (His291 in mammalian cytochrome c oxidase or His334 in Rhodobacter sphaeroides cytochrome c oxidase) as a key element in the proton pumping mechanism. The central feature of this proposed mechanism is that the pKa value of the imidazole significantly lowered depending on the redox state of the metals in the binuclear center. The energetic feasibility of this mechanism is tested in this work. To comprehend the role of the CuB bound histidines in the reaction mechanism of cytochrome c oxidase, density functional theory is used in combination with continuum electrostatics to calculate the pKa values of these imidazole rings in the aqueous solution as well as in the protein. The pKa values of His334, His333 and H2 O molecule are calculated both in oxidized and reduced state of CuB center. The Finite Difference Poisson Boltzmann (FDPB) method and the conductor-like polarizable continuum model (C-PCM) are used to determine the solvation free energies in aqueous solution. All possible protonation equilibrium reactions in the CuB center are studied to understand the deprotonation reactions of the bound H2 O molecule, His333 and His334. In aqueous solution, pKa values of 15.2, 15.9 and 7.4 were obtained for deprotonation of His334, His333 and H2O respectively. These pKa values in aqueous solution show that His334 and His333 are likely to be protonated at physiological pH. The protein environment shifts the pKa values of the CuB ligands to even higher values in the range between 15 to 60. These pKa values of CuB ligands are significantly higher compared to aqueous solution. The high pKa values show that His334 is protonated during all steps of the catalytic cycle and demonstrate that the Fe and Cu ion oxidation states do not lower the pKa values of CuB ligands and involved in shifting the pKa values of CuB ligands to higher values. These results are incompatible with the proposed role of His334 as a key element in the pumping mechanism. According to the pKa values, the proton pumping model as suggested by Stuchebrukhov might not be possible with the involvement of His334. The pKa values of the His333 in the CuB center are always shifted to higher values both in the reduced and in the oxidized state of the CuB center. The pKa values of His333 show that this residue is likely to be protonated in the protein and an involvement in the reaction mechanism of cytochrome c oxidase can therefore be ruled out.
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Structural insights into RNA binding by NusA and interaction studies of Nun with E. coli Nus factors.
(2008)
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Sujatha Pagadala Santhanam
- In phage lambda, antitermination is initiated by the lambda-encoded N protein which recruits a number of host proteins called Nus factors. Several of these host proteins which are essential for effective transcription termination and antitermination have been identified, these includes NusA, NusB, NusE and NusG. The subject of this work is mainly focused on characterization of interactions between various Nus host factors in the termination and antitermination system by NMR spectroscopy. Like N protein, Nun also requires additional host factors for efficient termination. It has been reported already that NusA interacts with C-terminal region of Nun and also that Nun binding to NusA requires NusA ar1 region. On the basis of these results, 1H,15N-HSQC spectra were recorded to monitor the interaction between HK022-Nun and NusA ar1. NMR titration experiments between Nun and NusA clearly showed a lack of chemical shift perturbations. Therefore, it can be concluded that there is no intermolecular interaction between Nun and NusA ar1. Up to date, no information about the interaction between Nun and NusG as well as Nun and NusB are known. Titration experiments between Nun and both Nus factors, have also revealed no direct interaction. Altogether, it can be deduced that there might be no direct interaction between Nun and NusA ar1, and NusG, and NusB. The NusA transcription elongation protein, which binds nut site RNA, contains sequences corresponding to the S1 and KH classes of identified RNA binding domains. To gain comprehensive insights into binding surface on SKK domain upon nut RNA binding, backbone resonances of SKK domain was assigned using sequential C-alpha, C-beta and CO chemical shift information derived from an array of TROSY based triple-resonance experiments. With virtually complete backbone assignment (80.5 %) of the SKK domain it was possible to characterize the interaction between SKK domain and lambda nutL RNA by NMR titration experiments. Significant chemical shift changes observed on SKK domain upon addition of unlabeled lambda nutL RNA, had reflected a direct interaction. Mapping of chemical shift perturbations on SKK domain revealed that the RNA binding interface is mainly located in the KH domains. The results implied a sequence-specific RNA binding. In the free state, NusA cannot bind to RNA. Once alpha-CTD of RNA polymerase is bound to NusA the RNA binding inhibition is released. Direct interactions between alpha-CTD and NusA ar2 have been reported and therefore NusA ar2 could be a prime candidate for inhibiting the RNA binding of NusA. To further evaluate the autoinhibition effect of NusA ar2 on SKK domain, titrations between NusA ar2 and SKK domain have been performed. Upon NusA ar2 binding, notable chemical shift changes were observed in the KH1 region of SKK domain. The residues which were affected on binding to NusA ar2 were also affected during the SKK and lambda nutL titration experiments. The results are in good agreement with the proposed idea that NusA ar2 possibly occludes the RNA binding domains of NusA. To investigate the effect of alpha-CTD on RNA binding by NusA, titration of the complex containing SKK domain and NusA ar2 by gradually adding an increased molar ratio of alpha-CTD have been carried out. On addition of alpha-CTD, it was clearly observed that alpha-CTD displaced NusA ar2 from the complex suggesting that the inhibition of RNA binding by NusA ar2 could be released by alpha-CTD.
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Untersuchungen zum Verhalten von hochgequollenen lyotropen Phasen mit Calcium-, Magnesium- und Natriumdodecylsulfat
(2008)
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Amelie Sabine Zapf
- Calciumdodecylsulfat (CDS) besitzt einen Krafftpunkt von 50°C und ist deshalb bei Raumtemperatur in Wasser als Tensid völlig inaktiv. Mit Cotensiden wie Hexanol oder Oktanol wird aber die kritische Mizellbildungskonzentration unter die Löslichkeit von CDS gedrückt, so dass quellende lyotrope lamellare Phasen gebildet werden. Das Phasenverhalten der Systeme aus CDS/Wasser mit Hexanol bis Dekanol wurde im hochverdünnten Bereich bei 25°C ermittelt. Alle Mehrphasengebiete konnten nach der Phasenregel richtig eingeordnet werden. So wurde nachgewiesen, dass die als L3m bezeichnete isotrope Phase eine zweiphasige "stabile" Dispersion von lamellaren Fragmenten in der wässrigen L1-Phase ist. Genau untersucht wurden die mit Heptanol bis Dekanol erhältlichen Schillerphasen. Es wurde festgestellt, dass diese Phasen stark durch den Restgehalt von Elektrolyt im Tensid verschoben werden können. Der Weg zur optimalen Ermittlung der Schillerphasen wird aufgezeigt. Das Cotensidkonzentrationsfenster der Existenz von Schillerphasen wird mit steigender Kettenlänge des Cotensids drastisch enger. Beim Dekanolsystem ist dabei die Grenze mit einer Cotensidtoleranz von nur noch etwa 0,2% erreicht. Die Schillerphasen sind stark temperaturabhängig. Sie existieren beim Dekanolsystem nur zwischen 23 und 32-37°C, je nach Tensidgehalt. Nach Hitze-/Kälteschock erfolgt Rückbildung erst nach etwa einem Monat. Während bei Heptanol, Oktanol, Nonanol und Dekanol Farben gefunden werden, aus denen auf gewöhnliche Lamellendicken geschlossen werden kann, weisen die Farberscheinungen beim Dekanolsystem bei Salzzusatz scheinbar auf Lamellen doppelter Dicke hin. Der "ungewöhnliche Effekt" tritt hier erstmals auf. Beim Ersatz des CDS durch Magnesiumdodecylsulfat (MDS) wurde zwar ein analoges Phasenverhalten wie beim CDS-System erhalten. Mit Heptanol als Cotensid werden bei etwa der doppelten als aufgrund der Lamellendicken erwarteten Konzentration Schillerphasen mit leuchtend roten Farben gefunden, die allerdings nur kurze Zeit stabil bleiben. Wegen der schnellen Effekte wurde eine Methode entwickelt, mit der die UV-vis-Peakposition aus photographischen Aufnahmen über die RGB-Werte genau ermittelt werden kann. Durch Salzzusatz wird das Verschwinden der transienten Farben stark verlangsamt. Zwischen verdünnten und kondensierten La-Phasen liegt eine Mischungslücke, die sich mit sinkender Cotensidkettenlänge schließt. Bei Hexanol ist der Grenzfall erreicht: ein enger Einphasenkanal existiert bei 23-33°C. Die Mischungslücke entsteht im Wesentlichen durch die Wechselwirkung aus Undulationsabstoßung und van der Waals-Attraktion. Da L3-Phasen in ionischen Systemen ohne Öl nicht erwartet werden, wurden Neutronenstreumessungen und elektronenmikroskopische Untersuchungen durchgeführt, die die L3-Struktur klar bestätigten. Die Peakpositionen von lamellarer und benachbarter L3-Phase sind aber nur wenig gegeneinander verschoben. Aus den Neutronenstreudaten wurden für die L3-Phasen stets um 15-35% höhere Lamellendicken als für die entsprechenden lamellaren Phasen ermittelt. Es wird eine sichere Methode angegeben, die ungeeichte 16 m-Messung automatisch an die geeichte 4 m-Messung anzupassen. Zudem wird ein Verfahren beschrieben, mit dem Messungen bei verschiedenen Detektorweiten automatisch zweidimensional aufgetragen und ausgewertet werden können. Mit Dekanol wird bei 25°C keine L3-Phase mehr gefunden. Im Natriumdodecylsulfat (SDS)/Oktanol/Wasser-System kann die Coulombwechselwirkung durch NaCl-Zusatz verringert werden, so dass ebenfalls Schillerphasen entstehen. Die Farben passen wieder nur zu Lamellen doppelter Dicke, die Farben bleiben hier aber wochenlang erhalten, bis sich wieder die gewöhnliche lamellare Phase bildet. Das Quellungsverhalten der lamellaren und der transienten Phasen kann durch UV-vis-Spektroskopie untersucht werden. In Küvetten mit einer Schichtdicke unter 2 mm sind die Phasen so stark wandorientiert, dass Licht nahezu ausschließlich in Rückwärtsrichtung gestreut wird. Sowohl die gewöhnliche lamellare Phase als auch die neue transiente Phase zeigen in allen Fällen Quellungsverhalten proportional zum Volumenbruch des Tensids. Bei den Systemen CDS/Dekanol/NaCl/Wasser, MDS/SDS/Heptanol/Wasser und SDS/NaCl/Oktanol/Wasser sind sogar die Peaks beider Phasen gleichzeitig vorhanden. Der transiente Peak verschwindet, der kurzwellige stationäre Peak bleibt erhalten. Die transienten Farben können nach dem Verschwinden durch geeignete Scherung wiederhergestellt werden. Die elektrische Leitfähigkeit der transienten Phasen liegt deutlich über der der gewöhnlichen lamellaren Phasen. Daraus wird geschlossen, dass die transiente Phase aus einer hochgeordneten monodispersen Vesikeldispersion besteht. Die Ordnungsbildung erfolgt durch hydrodynamische Wechselwirkung unmittelbar nach dem Abschalten der Scherung. Geringe Coulomb- und Undulationskräfte können die Rückbildung der planaren lamellaren Phase verzögern.
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Anaerobic Carbon Monoxide Dehydrogenase: Mechanism of CO-Oxidation at the [NiFe4S4OHx] Cluster and Nickel-Processing by its ATPase CooC
(2008)
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Jae-Hun Jeoung
- Anaerobic CO dehydrogenases (CODH) catalyze the reversible oxidation of CO to CO2 at a complex metal center containing Ni, Fe and S called cluster C. In this work, a heterologous expression system of CODHII from Carboxydothermus hydrogenoformans in E. coli and the crystal structures of CODHII in different states are reported. CO2 bridging the Ni-Fe1 site is observed in a reduced state with exogeneously supplied CO2-source, and is reductively activated by binding to cluster C. The ligand CO2 completes the square-planar coordination of the Ni ion and replaces the H2O/OH- ligand at the Fe1 ion in the other two states. The H2O/OH- ligand is replenished by a neighboring network of water molecules. Protons produced from the reversible CO oxidation are expelled through a semi-conserved histidine channel. The mutation of His96, one of four semi-conserved histidines to Asp diminished CO-oxidation activity to 2.7% of wild-type, indicating its essential role in catalysis. The structure of H96D CODHII reveals that the abolished activity is not originated from protein misfolding and/or absence of metal centers in the protein. Another variant of CODHII devoid of cluster C, but containing clusters B and D, was structurally characterized. This cluster C-missing CODHII shows an identical protein scaffold to the structure of active enzyme, and the residues coordinating the metals of cluster C display the same location as the active wild-type enzyme. From all metals of cluster C, only the Fe1 ion displays an alternative position, which appears to be the reason for the obseved cluster C heterogeneity. The structures presented in this work define the mechanism of CO oxidation/CO2 reduction at the Ni-Fe site of cluster C and show the channels that facilitate the transport of substrate/product during catalysis. The ATPase CooC1 from C. hydrogenoformans belongs to the MinD family of the SIMIBI class NTPases containing a deviant walker A motif. The protein has been proposed to participate in the maturation of cluster C of CODH (Jeon et al, 2001). As-isolated CooC1 shows monomeric state in solution with a molecular weight of 32 kDa. The presence of Ni(II) induces dimerization of CooC1, and the protein binds one Ni(II) per dimer with nanomolar affinity. The crystal structure of Metal-bound CooC1 clearly identified the conserved CXC motif as the metal-binding site, which is responsible for the dimerization. In solution, CooC1 also undergoes nucleotide-dependent dimerization and forms a stable dimer in the presence of ATP. The K8A CooC1 mutant, where Ala replaced the signature Lys is incapable of both ATP hydrolysis and ATP-dependent stable dimer formation. Compared to other structural homologues of the MinD family, the ATP-induced dimer structure of CooC1 shows a different conformation than the Ni-induced dimeric state. On the basis of biochemical data and structures of CooC1 in combination with a model of ATP-driven dimerization, a reaction cycle of CooC1 in Ni-processing for the maturation of cluster C is presented.
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Soft Compartmentalized Polymer Colloids: Janus Particles, Multicompartment Structures, Inorganic-Organic Hybrids and Applications
(2008)
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Andreas Walther
- Compartmentalized polymer-based colloids with nanoscopic dimensions and different topologies were prepared based on various block copolymer architectures. The polymers were prepared via anionic polymerization or a controlled radical polymerization technique (RAFT). Self-assembly both in solution and in bulk were rigorously exploited to create the multicompartment architectures. Several new crosslinking strategies, in bulk and in solution, were thoroughly investigated to allow a controlled preservation and a high shape-persistence of the colloidal particles even when exposed to non-selective solvents. Cylindrical and disc-like Janus particles were investigated according to their self-assembly behavior into superstructures. The Janus discs undergo back-to-back stacking in organic solvent. In aqueous solution, a size-dependent aggregation was found. While the smaller Janus discs are unimolecularly dissolved with a significant polystyrene surface exposed to the water, the larger Janus sheets can shield the insoluble side by a large bending in an intramolecular fashion. Janus cylinders self-assemble on two hierarchical levels. Upon exposure to a selective solvent, they self-organize into fibers. The length of these fibers depends on the concentration and a critical aggregation concentration exists below which self-assembly is absent. Secondly, the Janus cylinders form fibrillar networks with tunable pore sizes when deposited from more concentrated solution. The surface-active properties of spherical Janus particle were exploited for the investigation of two possible applications of both academic and industrial relevance. In Pickering emulsion polymerization, extremely well-defined latexes with long-term stability could be prepared in a very facile fashion. A control of the particle size by changing the concentration of Janus particles could easily be achieved. Secondly, the nanostructuring of polymer blends was shown for a PS/PMMA model system. The system exhibits a control on two length scales. The first is the controlled decrease of the domains of the dispersed phase and the second is the controlled spacing between the particles at the interface. The particles are exclusively located at the interface and the nanostructuring can be obtained while matching macroscopic processing constraints, i.e. high-shear blending in a mini mixer. The self-assembly of bis-hydrophilic triblock terpolymers with two outer hydrophobic blocks was investigated for a variety of different hydrophilic end blocks. The overall architecture of the solution structures could be tailored by changing the hydrophobic-to-hydrophilic balance. Additionally, the interaction between the corona-forming blocks has an influence on the particle shapes as well. The micelles possess coronas with appealing and tunable properties, due to the presence of a hydrophobic core and hydrophilic biocompatible and stimuli-responsive segments. The self-assembly of miktoarm star terpolymers, bearing arms of polystyrene (PS), polybutadiene (PB) and poly(2-vinylpyridine) (P2VP), was analyzed both in solution as well as in the bulk state. In solution, the miktoarm star terpolymers form multicompartment micelles with a glassy (PS) and a soft compartment (PB), all rendered water-soluble by the P2VP corona. Strikingly, the soft PB compartments show hydrophobic bridges in aqueous medium which is of high interest as they can be used as a second motif for sensing, adhesion control or interaction with cellular membranes. The transfer of a hexagonally ordered cylindrical bulk phase via crosslinking of the PB domain of a bulk structure of a similar miktoarm star terpolymer allowed the preparation of novel multicompartment cylinders. The structures possess perfectly parallel aligned compartments. Two symmetric and opposing PS and P2VP compartments surround a central ribbon-like PB compartment. The P2VP compartments could be used to generate perfectly aligned bi-axial nanowires inside spatially separated compartments within close proximity. Due to the presence of an amphiphilic corona, the extent of the compartmentalization can be tuned from separated nanowires into one homogenous nanowire simply by exchanging the solvent. The complexity and high control of the structure of this multicompartment cylinder is unmatched and can most likely not be obtained by solution based self-assembly.
