OPUS 4 | Chemie

Esterase 2-oligodeoxynucleotide conjugates as enzyme reporter for electrochemical detection of DNA and identification of bacterial species (2007)

Yiran Wang

Electrical Chip (E-Chip) system offers a fast, sensitive and cost-effective way to detect analyte. To improve its application of nucleic acids detection, a suitable enzyme reporter is expected. Esterase 2 (EST2) from Alicyclobacillus acidocaldarius was introduced and mutated to have an accessible cysteine residue at 118th codon. This esterase was purified by a single-step affinity chromatography with trifluoromethyl ketone as a ligand and covalently conjugated to a 5’-amino modified oligodeoxynucleotide. The purified conjugate served as a reporter enzyme for electrochemical detection of nucleic acids. Being an optimal substrate, p-aminophenylbutyrate exerts maximal signal response to EST2 in E-Chip, as determined by comparison of p-aminophenyl esters with acyl chain length from two to eight carbons. An assay of 15 pM of soluble esterase 2 in 1 ml was obtained exploiting p-aminophenylbutyrate. E-Chip detection of nucleic acids requires three essential steps: immobilization of thiol-modified capture oligodeoxynucleotides onto electrode, recruiting EST2 to electrode vicinity by means of nucleic acids hybridization, and amperometric determination of p-aminophenol produced by EST2 catalytic hydrolysis of p-aminophenylbutyrate. Generally, EST2 reporter allows a detection of approximately one million molecules/0.6 mm2 electrode. EST2 covalently attached by an oligodeoxynucleotide significantly increased the ability of mismatch discrimination as compared to the streptavidin conjugated EST2. Moreover, single nucleotide mismatch in analyte could be reliably discriminated in the set-up, as demonstrated by single nucleotide mismatch in a 49-mer oligodeoxynucleotide as well as in a 510-nucleotide ssDNA. Application of E-Chip to bacterial species identification through 16S rRNA was demonstrated. Escherichia coli and Listeria innocua were easily identified as judged by signals given by rRNA hybridization with species-specific capture ODNs. This system allows a detection of 1,000 Escherichia coli cells. As a further optimization, a stem-loop structured molecular beacon with 5’-thiol and 3’-biotin modifications was synthesized and tested on the chip using EST2-streptavidin as reporter. The presence of target oligodeoxynucleotides complementary to the whole stem-loop sequence enhanced signal for a moderate 2-fold. The future work should focus on combination of continuous flow PCR with EST2-oligodeoxynucleotide conjugate reporter to do faster and more automatic disease related DNA analysis, as well as construction of EST2 based biosensor for toxic agents detection.

Untersuchungen zur Ausbildung hochgeordneter Strukturen in lamellaren Tensidphasen (2007)

Christian Wolf

Komplex aufgebaute äquidistante Lamellenflächen bilden in Systemen mit parabolischen Fokalkegeln hochsymmetrische Muster. Am Beispiel des Systems Natriumdodecylsulfat / Wasser / Hexanol / Dekan wurde dieses Verhalten im Bereich von L3- und lamellarer Phase gefunden und untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollten die Ursachen und Wege bei der Ausbildung solcher Strukturen genau aufgeklärt und qualitativ untersucht werden. Es ist bekannt, dass geordnete lamellare oder smektische Phasen bei erzwungener Dilatation parabolische Fokalkegel bilden können, die zu regelmäßiger Musterbildung neigen. Bei den hier untersuchten Tensidsystemen waren die Probengefäße jedoch starr und keinem mechanischen Stress unterworfen. Trotzdem wurden hier besonders gut ausgeprägte Muster von parabolischen Fokalkegeln nachgewiesen. Es stellte sich deshalb die Aufgabe, alle auftretenden dynamischen Prozesse von der Probenpräparation an bis zur Ausbildung des Musters und dessen Zerstörung zu dokumentieren und zu beschreiben. Im lamellaren Einphasengebiet wurde in keinem Fall die Ausbildung von geordneten Lamellen beobachtet. Alle Proben blieben ungeordnet und zeigten starke Doppelbrechung. Bei Entnahme der lamellaren Phase aus dem koexistierenden lamellar / L3-Gebiet entstand dagegen in allen Fällen in kurzer Zeit Pseudoisotropie. Von den verschlossenen Rändern des Microslides aus begann in den pseudoisotropen Proben eine nebelartige Fahne in das Kapillarinnere hinein zu wachsen. Bei starker Vergrößerung des Nebels konnte nachgewiesen werden, wie zunächst aus diffusen Strukturen Muster entwickelt wurden. Mustergröße, Kontrast und Ordnung nahmen dabei stark zu, bis schließlich große Bereiche mit nahezu perfekten Quadraten entstanden. Es ist mit der gewählten Methode reproduzierbar gelungen, solche hochgeordneten Bereiche in perfekter quadratischer Orientierung über das gesamte Gesichtsfeld des Mikroskops zu erzeugen. SDS-Konzentration, Hexanol- und Dekangehalt, Kotensid und Temperatur wurden variiert, um bestmögliche Bedingungen für solche optimalen Ordnungen zu finden. Die hohe Gleichmäßigkeit der Gitter ermöglichte die quantitative Untersuchung der Mustergeometrie. Es konnte gezeigt werden, dass die Muster immer exakt in der Mitte zwischen unterer und oberer Fläche des Probengefäßes positioniert waren. In der mittleren Fokalebene ist die Symmetrie außerordentlich hoch, weil die sowohl nach oben und nach unten verlaufenden Parabeln identisch abgebildet werden. Bei Verschiebung des Fokus fand man eine obere und untere ganz scharf abgebildete Fokalebene, in der nur jeweils die vier oberen oder unteren der zusammenfallenden Parabeln scharf abgebildet werden. Wenn man die Dicke der Microslides veränderte, entstanden die Muster zunächst in gleicher Größe. Sie wuchsen dann aber unter Kontrastverstärkung bis zu einem maximalen Wert an, der proportional mit der Dicke der Microslides zunimmt. Besonders war der Vergleich zwischen oberer und unterer Fokalebene mit der Größe der Elementarzelle. Die Messwerte für alle Proben und für alle Microslidedicken lagen auf einer Geraden durch den Nullpunkt. Hieraus ist zu schließen, dass die Mustergestalt der parabolischen Fokalkegel von einem einzigen Parameter, der Zellgröße, bestimmt wird, das heißt, alle Muster sind einander ähnlich. Um die Triebkraft für die Bildung der parabolischen Fokalkegel zu ermitteln wurden Proben angesetzt, abgedichtet und in bestimmten Zeitintervallen gewogen. Dabei wurde nachgewiesen, dass Wasser, Hexanol und vor allem Dekan durch den Kitverschluss diffundieren können. Das Phasendiagramm zeigt, dass bei Dekanverlust die lamellare Phase erhalten bleibt, dass aber dabei der interlamellare Abstand abnehmen muss. Für die geordnete Probe im Microslide wirkt dieser Vorgang aber wie eine erzwungene Dilatation, die zur Bildung der parabolischen Fokalkegel führt, um diesen Zwang auszuweichen. Hierdurch wird auch verständlich, dass sich die Proben nach Ausbildung des Musters nach einiger Zeit weiter verändern. Dabei treten Fließbewegungen des gesamten Musters auf. Dadurch werden Verzerrungen im Muster erzwungen. Es konnte dabei nachgewiesen werden, dass solche Verzerrungen nach Änderung des 90° Winkels vom Quadrat zu einem 60° Winkel wieder ein neues stabiles Rautengitter mit neuer Symmetrie ausbildeten. Dieses Gitter ist der Grenzfall der maximal möglichen Verzerrung eines regulären Musters parabolischer Fokalkegel zu einem Ellipsen-Hyperbel-Gitter. In Proben mit wenig lamellarer Phase entstanden in starker Dynamik aus hochgeordneten Bereichen der lamellaren Phase exakt hexagonal angeordneter Strukturen, die sich unter dem Polarisationsmikroskop wie Maltesertröpfchen verhielten. Die Eigenschaften von parabolischen Fokalkegeln sind hierbei völlig verschwunden. Es ist deshalb anzunehmen, dass bei diesem Gitter die Fokalkegel unter Ausbildung lamellar ähnlicher Tröpfchenstrukturen zunehmend zerstört werden.

Single Molecule Study of Polymer-Surfactant Interactions (2007)

John Bosco Stanislaus

The interactions between the anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) and a hydrophobically modified non ionic polymer, methylcellulose (MC), have been investigated in aqueous solution by fluorescence correlation spectroscopy (FCS), cryo-TEM, turbidity and rheology. The micelle formation of SDS is followed with cationic Cresyl Violet perchlorate dye via diffusion time. The opposite polarity of dye is suitable to aggregate with micelles and act as a labeled dye. Two major studies focused in the research work are concentration dependent and temperature measurements to understand the interactions of MC/SDS aggregates. The concentration of SDS is varied to a wide range in the mixture by fixing the concentration of MC. By this approach, the changes in the aggregation and the conformations of MC chains are being studied. Similar studies have been repeated at various temperatures in the range of 25-60 °C to understand the changes in gelation properties of MC. To understand the results of the above mentioned studies of MC/SDS, the behavior of MC and SDS is analyzed individually. In this line, the critical micelle concentration (CMC) of SDS has found with FCS measurements is in good agreement with literature value obtained from ‘classical methods’. The hydrodynamic radius of SDS micelle around CMC is found to be ~ 2.0 nm. The shape of the autocorrelation curves and number of dye particles in the focal volume also supports to follow the SDS micelle. When varying the concentration of MC, slight changes in the diffusion time of dye are observed. The MC/SDS mixtures show huge increase in the diffusion time compared to the individual components MC and SDS. At constant MC concentration the diffusion time of single aggregates increases gradually up to a certain SDS concentration and decreases to a minimum when the SDS concentration is further increased. This behavior coincides with the behavior of the zero shear viscosity. Two different fractions viz fast diffusing fraction of dye molecule along with the larger aggregates are observed in between the critical aggregation concentration (CAC) and end of aggregation (EOA). FCS is used to follow the dynamics of single aggregates of the different populations. At very high concentration of SDS, MC/SDS mixtures show the worm like structure in cryoTEM measurements. A model is proposed based on FCS, cryoTEM and rheology measurements to explain the effect of surfactant concentration on polymer conformation and aggregation size. While varying the temperature, MC/SDS mixtures show changes in the diffusion time only at room temperature. MC has the tendency to form thermoreversible gel upon heated above 50 °C. The presence of SDS alter the intensity of MC gelation. Before CAC, the addition of SDS promotes the MC gelation. The MC-SDS mixture giving maximum aggregation at room temperature shows decreasing tendency in its diffusion time upon increasing the temperaure. We have shown that a single molecule technique like FCS can be successfully used to follow the dynamics of single aggregates in polymer/surfactant systems. We can identify single inter-chain aggregates, the hydrodynamic size of which changes in a characteristic way as a function of surfactant concentration. These changes are reflected in the behavior of the macroscopic viscosity. The present results show the large potential of single molecule experiments as a complement to the classical macroscopic techniques for a characterization of polymer solutions and polymer/surfactant mixtures. In addition to the large aggregates dominating the macroscopic rheology of the system, the single molecule approach can identify considerably faster aggregates as well, which are not accessible by conventional techniques. Thereby the single molecule approach is able to monitor what may be called a micro viscosity of the solution, i.e. the potential of small aggregates to diffuse rather fast through a network of slowly diffusing chains. This study also shows that the diffusion behavior of polymer-surfactant systems can be followed by FCS without covalent labeling with dye molecules. Moreover, FCS is only sensitive to the dye concentration; therefore these investigations can be applied over a wide range of polymer concentrations.

Entwicklung eines Sulfolobus-E. coli Shuttle-Vektors basierend auf dem Plasmid pRN1 (2007)

Silvia Berkner

Sulfolobus spp., ein Vertreter der thermoacidophilen Crenarchaeota, ist auf dem Weg sich als wichtiger archaealer Modellorganismus zu etablieren. Aufgrund seiner Wachstumsbedingungen von 75-80 °C bei pH 3-3,5 ist Sulfolobus biotechnologisch ebenfalls von hoher Bedeutung, da seine Enzyme thermostabil und, im Fall von sekretierten Enzymen, auch säurestabil sind. Bisher waren jedoch in vivo-Experimente in Sulfolobus nur schwierig durchzuführen, da trotz jahrelanger Bemühungen nur wenige genetische Systeme zur Verfügung standen, die außerdem Probleme hinsichtlich ihrer reproduzierbaren Anwendbarkeit aufwiesen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, einen kleinen, episomalen, einfach zu handhabenden Sulfolobus-Escherichia coli Shuttle-Vektor zu entwickeln. Zur Konstruktion eines Sulfolobus-E. coli Shuttle-Vektors wird ein E. coli-Replikon mit selektivem Marker, ein Sulfolobus-Replikon und ein selektiver Marker für Sulfolobus benötigt. Zu Beginn der Arbeiten unklar war, welcher Faktor entscheidend für die Etablierung verlässlicher Vektoren sein würde. Daher wurden, ausgehend von einer breiten, gut charakterisierten Auswahl verschiedener Shuttle-Konstrukte, möglicher selektiver Marker und potentieller Rezipientenstämme, optimale Kombinationen identifiziert. Als Sulfolobus-Replikon wurde das kryptische Plasmid pRN1 aus Sulfolobus islandicus REN1H1 gewählt, da es eine geringe Größe von 5,4 kb und eine geeignete Kopienzahl von 2-23 Plasmiden pro Zelle aufweist, sowie das am besten untersuchte crenarchaeale Plasmid ist. Auf dem Plasmid befinden sich drei konservierte offene Leseraster, die für das multifunktionelle Replikationsprotein Orf904 und die zwei sequenzspezifisch DNA-bindenden Proteine Orf56 und Orf80 codieren. Über den Replikationsmechanismus oder den Replikationsursprung des Plasmides ist jedoch nichts bekannt. Um die Funktionsweise des Plasmides pRN1 besser zu verstehen, wurde die Transkription des Plasmides untersucht. Dadurch sollten auch Hinweise auf essentielle Regionen bzw. mögliche Unterbrechungsstellen zur Shuttle-Vektorkonstruktion gewonnen werden. Es wurden fünf Transkripte im Bereich der offenen Leseraster kartiert. Erste Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen zur Kopienzahlkontrolle von pRN1 wurden durch die quantitative Bestimmung des Verlaufs der Transkriptanzahlen pro Zelle während verschiedener Wachstumsphasen und die Untersuchung der Stabilität der Transkripte gewonnen. In in vivo-Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Protein Orf56 als Transkriptionsrepressor wirkt und somit die Transkription des Replikationsoperons reguliert. Das Replikationsoperon orf56/orf904 wurde als essentiell zur Shuttle-Vektorkonstruktion eingestuft. Um möglichst viele gleichmäßig über den restlichen Teil des Plasmides verteilte Unterbrechungsstellen zur Vektorkonstruktion zu erhalten, wurde eine Transposon-basierte Bibliothek erstellt, aus der 13 Konstrukte ausgewählt wurden. Eine effiziente Selektion wurde durch die Verwendung uracilauxotropher, pyrEF-defizienter Mutanten erreicht. Daher wurden uracilauxotrophe Mutanten als potentielle Rezipientenstämme isoliert und phänotypisch, genotypisch und hinsichtlich ihrer Reversionsfrequenzen untersucht. Die funktionsfähigen pyrEF-Gene aus Sulfolobus solfataricus P2, codierend für Enzyme des Uridinmonophosphat-Syntheseweges, wurden als selektiver Marker zur Uracil-Selektion in die 13 verschiedenen pRN1-Unterbrechungskonstrukte integriert. Die verschiedenen potentiellen Shuttle-Vektorkonstrukte wurden in die sechs zur Verfügung stehenden uracilauxotrophen Rezipienten transformiert. 11 der 13 Vektorkonstrukte replizierten stabil in der Sulfolobus acidocaldarius pyrE-Deletionsmutante MR31 unter Uracil-Selektion. Die Vektoren zeigten Kopienzahlen von 2-8 Plasmiden pro Zelle in Sulfolobus, rekombinierten nicht und integrierten auch nicht in das Wirtschromosom. Sie waren in E. coli stabil und erlaubten eine einfache Klonierung zusätzlicher DNA-Sequenzen. Mit Hilfe der verschiedenen Unterbrechungskonstrukte und weiterer Deletionskonstrukte konnten erste Informationen zur Funktion des konservierten Leserasters orf80 erhalten und das minimale Replikon von pRN1 eingegrenzt werden. Außerdem wurde die Eignung der Shuttle-Konstrukte für Reportergenexperimente und zur Expression von Proteinen in Sulfolobus demonstriert. Weiterhin konnte mittels Lactose-Selektion das Wirtsspektrum der Shuttle-Konstrukte auf S. solfataricus ausgedehnt werden. Als Schlüsselfaktor zur erfolgreichen Etablierung der Shuttle-Vektoren konnte hoher Selektionsdruck, der nur mittels Deletionsmutanten erreicht werden kann, identifiziert werden. Die Identifizierung dieses kritischen Faktors wird die Entwicklung weiterer genetischer Systeme für Sulfolobus erleichtern.

Stabilisierung von Proteinen durch in vitro-Evolution - Selektion und biophysikalische Charakterisierung (2007)

Insa Kather

Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, große Proteine bzw. Enzyme durch Proside zu stabilisieren und die selektierten Varianten biophysikalisch zu charakterisieren. Proside ist eine auf dem phage display basierende in vitro-Evolutions-Methode zur Selektion stabilisierter Proteinvarianten, wobei eine erhöhte Proteaseresistenz stabilisierter Proteinvarianten mit der Infektiosität filamentöser Phagen verknüpft wird. Die evolutive Stabilisierung großer Proteine bzw. Enzyme ist besonders wichtig, weil deren Optimierung mittels rationalen Designs aufgrund der fehlenden Kenntnis der Struktur-Stabilitäts-Zusammenhänge fast unmöglich ist. Zum einen sind stabilisierte Enzyme in der industriellen Anwendung von großem Interesse, zum anderen ermöglicht die Analyse der stabilisierenden Effekte, vor allem auch im strukturellen Zusammenhang, Einblicke in die Prinzipien der Stabilität von Mehr-Domänen-Proteinen. Im Proside-System wird das zu stabilisierende Gastprotein zwischen die N2- und die CT-Domäne des G3P filamentöser Phagen eingebaut. Proside ist ein sehr effektives Selektionssystem, die Stabilisierung größerer Gastproteine ist jedoch schwierig. Cysteinhaltige Gastproteine können mit den Disulfidbrücken des G3P inkorrekte Disulfidbrücken bilden, wodurch die Infektiosität der Phagen verlorengeht. Außerdem nimmt die Infektiosität der Phagen mit der zunehmenden Größe des Gastproteins ab. Dieses Phänomen tritt besonders in Kombination mit dem Problem des Verlusts von Gastproteinen durch homologe Rekombination in Erscheinung. Phagen, die durch Rekombination das Gastprotein verlieren, sind in der in vitro-Proteolyse stark begünstigt und zusätzlich auch infektiöser als Phagen mit dem vollständigen Gastproteininsert. Ziel der Arbeit war deshalb zunächst, das Selektionssystem so zu modifizieren, dass es auf größere Proteine angewendet werden kann. Um das Problem der inkorrekten Disulfidverbrückung zu eliminieren, wurden die drei Disulfidbrücken im N1N2-Fragment des G3P durch Proside-Selektion substituiert und damit ein infektiöser Phage mit disulfidfreiem G3P konstruiert. Das selektierte 0SS-G3P* ist stabiler als das disulfidverbrückte Wildtyp-Protein. Kombination aller selektierten Mutationen in einer Variante ergibt ein im Vergleich zum Wildtyp-Protein um 19,0 °C stabilisiertes disulfidfreies G3P*. Die 14 second-site Muationen konnten so den Verlust von drei Disulfidbrücken überkompensieren. Die Einzelbeiträge zur Stabilisierung wurden mit Hilfe vieler Einzel- und Mehrfachmutanten charakterisiert und auf der Basis der Kristallstruktur des stabilisierten 0SS-G3P* analysiert. Dies ergab, dass verbesserte Domäneninteraktionen einen enormen Beitrag zur Stabilität leisten. Das G3P besitzt neben den Domänen N1 und N2 eine C-terminale Domäne CT, die auch für den Infektionsprozeß von Bedeutung ist. Diese Domäne wurde allein oder in Fusion mit N2 bzw. N1 und N2 exprimiert. Die isolierte CT-Domäne ist bis auf eine hydrophobe Helix entfaltet. Lediglich in Gegenwart von N1 und N2 besitzt sie eine marginale konformationelle Stabilität. Die Funktion der CT-Domäne bei Infektion und Phagenaustritt aus der Wirtszelle beruht auf der Exponierung hydrophober Oberflächen für die Interaktion mit der Wirtszellmembran, so dass eine flexible bzw. nur marginal stabile Domäne hierfür sehr geeignet scheint. Als Modellprotein für große Enzyme wurde die TEM-1 Beta-Lactamase aus E. coli durch Zufallsmutagenese und Proside-Selektion stabilisiert. Ebenso wie im Fall des G3P wurde eine große Stabilisierung des Enzyms um 18,4 °C durch eine stufenweise Selektion und anschließende Kombination der stabilisierenden Mutationen erreicht. Die stabilisierte Kombinationsvariante ist bei niedriger Temperatur etwa doppelt so aktiv wie das Wildtyp-Protein, und das Optimum der Aktivität ist zu höheren Temperaturen verschoben. Die Selektion stabilisierter Varianten war nur bei gleichzeitiger Selektion auf Ampicillin-Resistenz der infizierten Zellen möglich. Da der Phagentiter niedrig war, dominierten in Abwesenheit von Ampicillin rekombinante Phagen ohne Gastprotein die in vitro- und in vivo-Selektion. Um dieses Problem bei großen Gastproteinen ausschließen zu können, wurde ein alternatives Selektionssystem etabliert, wobei das zu stabilisierende Gastprotein aus der ursprünglichen Position zwischen der N2- und der CT-Domäne an den Beginn des G3P verschoben und mit einem N-terminalen Cystein als Selektions-Tag versehen wird. Die Phagenbibliothek wird auch in diesem Fall einer Proteolyse unterworfen, die Selektion beruht jedoch nicht auf einer Kombination von Proteaseresistenz und Infektiosität des Phagen, sondern auf der Kombination Proteaseresistenz und Bindung an eine Affinitätsmatrix. Die Infektiosität der Phagen wird durch ein N-terminal angefügtes Gastprotein nicht beeinflußt, und in ersten Selektionsversuchen mit Beta-Lactamase konnten stabilisierte Varianten angereichert werden.

Orientation and Phase Behavior of Block Copolymers in External Electric Fields (2007)

Kristin Schmidt

The influence of external electric fields on the microdomain structure of block copolymers has been studied. The results range from an analysis of the mechanism and kinetics of the reorientation process, via the discussion of the driving force, to first investigations on the influence of an electric field on the phase behavior. The electric field induced effects on concentrated block copolymer solutions were investigated by in-situ synchrotron small-angle x-ray scattering. The first part concerns the analysis of the mechanism and kinetics of the alignment of lamellar forming diblock copolymer solutions as well as a quantitative study of the reorientation kinetics of various block copolymers in order to clarify the driving force of reorientation in a DC electric field. The second part of this thesis describes the influence of an electric field on the phase behavior of block copolymers. It is shown that a gyroid phase (G) as well as a hexagonally perforated lamella phase (HPL) exposed to an electric field undergo a phase transition to cylinders (C) and lamellae (L), respectively. Furthermore, an anisotropic deformation of the chain conformation in various lamellar and cylindrical block copolymer solutions via electric fields is demonstrated.

Die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus des Gen-3-Proteins filamentöser Phagen für die Infektion von Escherichia coli (2007)

Barbara Eckert

Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus eines Proteins für dessen Funktionsweise in vivo zu untersuchen. Als Modellsystem diente der filamentöse Phage fd, der Gram-negative Bakterien infiziert. Das Gen-3-Protein (G3P) dieses Phagen ist für die initialen Schritte der Infektion essentiell. G3P ist aus drei Domänen aufgebaut, wobei die C-terminale Domäne das Protein in der Phagenhülle verankert. Die beiden N-terminalen Domänen N1 und N2 bilden eine strukturelle Einheit und wechselwirken mit den beiden zellulären Phagenrezeptoren, dem bakteriellen F-Pilus und TolA in der Zellmembran. Die Wechselwirkung der N2-Domäne mit der Pilusspitze führt zur Dissoziation der beiden Domänen und aktiviert so G3P für die anschließende Interaktion der N1-Domäne mit der C-terminalen Domäne von TolA. Die TolA-Bindungsstelle befindet sich auf N1 an der Domänengrenzfläche und ist deshalb im nativen Ruhezustand des Proteins durch N2 blockiert. Im Verlauf der Infektion muss nach der Pilusbindung die geöffnete, aktive Form des G3P so lange erhalten bleiben, bis N1 mit TolA wechselwirken kann. Die Analyse des Faltungsmechanismus des N1N2-Fragments in vitro zeigte, dass die beiden Domänen N1 und N2 sehr schnell falten, ihre Assoziation im letzten Rückfaltungsschritt jedoch außergewöhnlich langsam ist. Die Geschwindigkeit der Domänenassoziation wird durch die trans-nach-cis-Isomerisierung an Pro213 bestimmt, das in der Gelenkregion zwischen den beiden Domänen lokalisiert ist. Die Isomerisierung in den nativen cis-Zustand ist mit einer Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) sehr viel langsamer als Prolinisomerisierungen in anderen Proteinen und wird durch die lokale Sequenzumgebung um cis-Pro213 (Gln212-Pro213-Pro214) verursacht. Die Relevanz der langsamen Prolinisomerisierung für die Phageninfektiosität konnte in Kompetitionsexperimenten nachgewiesen werden. In diesen Experimenten konkurrierten jeweils zwei Phagenvarianten, die sich in ihrer Isomerisierungsrate und damit der Assoziationsrate der beiden Domänen unterschieden, um die Infektion einer E. coli-Kultur. Phagen, die eine langsame Prolinisomerisierung und damit eine lange Lebensdauer des aktiven, geöffneten Zustands mit dissoziierten Domänen aufweisen, setzten sich in den Kompetitionsexperimenten durch. Dass es sich bei der Inaktivierung der Phagen tatsächlich um einen prolinkontrollierten Mechanismus handelt, zeigte der Einfluss der Prolylisomerase Cyp18. Nach Dissoziation der Domänen kontrolliert also die langsame trans-nach-cis-Isomerisierung die Lebensdauer des infektiösen Zustands. Die Infektion von F--Zellen mit in vitro aktivierten Phagen ermöglichte es, die Lebensdauer des aktiven Zustands und die Kinetik der Inaktivierung der Phagen zu bestimmen. Die für verschiedene Phagenvarianten erhaltenen Zeitkonstanten spiegelten dabei die Isomerisierungskinetik des entsprechenden G3P-Proteins in vitro wider. Die langsame Prolinisomerisierung in der Gelenkregion steuert so die Funktion des G3P bei der Phageninfektion, indem Pro213 sowohl als Schalter als auch als Zeitgeber wirkt. In der nativen cis-Konformation steht dieser Schalter auf „aus“, die beiden Domänen N1 und N2 sind fest miteinander assoziiert und die Gelenksubdomäne liegt gefaltet vor. Entsprechend sind die Phagen in dieser Ruheform stabil, aber nicht infektiös. Die Bindung der N2-Domäne an den F-Pilus führt zur Dissoziation der beiden Domänen. Mit Hilfe CD-spektroskopischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in diesem offenen, aktivierten Zustand entfaltet vorliegt. Dies führt zu einer Destabilisierung der N2-Domäne. Ob N2 bei der Infektion ebenfalls entfaltet vorliegt, konnte jedoch nicht gezeigt werden. Als Folge der partiellen Entfaltung der Gelenkregion isomerisiert Pro213 aus dem sterisch anspruchsvollen cis- in den stabileren trans-Zustand, welcher der „an“-Stellung des Prolinschalters entspricht. Die sehr langsame Rückisomerisierung in die native cis-Konformation fungiert nun als Zeitgeber und gewährleistet, dass G3P lange genug geöffnet und partiell entfaltet bleibt, um eine Wechselwirkung zwischen der N1-Domäne und TolA in der Zellmembran zu ermöglichen. Neben dem Faltungsmechanismus beeinflusst auch die Stabilität des G3P die Infektiosität der Phagen. Mit Hilfe von Infektionsexperimenten von F+- und F--Zellen konnte gezeigt werden, dass die Infektiosität stark von der Stabilität des G3P, insbesondere von der Stärke der Domäneninteraktion, anhängt. Mit zunehmender Stabilität nimmt die Infektiosität ab, und stabilisierende Mutationen erschweren den Übergang in die aktive, partiell entfaltete Form mit dissoziierten Domänen. Die Stabilität des G3P ist daher so angepasst, dass einerseits eine Stabilität der Phagen im Ruhezustand garantiert ist, und es andererseits bei Bindung an den F-Pilus durch Domänendissoziation aktiviert werden kann.

The Ab Initio Calculation of the Chemical Shift Tensor and its Application for the Structure Determination in Ordered and Disordered Phases by Means of Solid-State Nuclear Magnetic Resonance (2007)

Jan Sehnert

The intention of this work was the application of modeling to condensed solid-state systems for the sake of the structure determination and prediction. Besides structural modelling this included the ab initio calculation of the chemical shift tensor which was taken for the simulation of various solid-state NMR experiments and the comparison to NMR measurements. In this context it was necessary to create a tool which could deal with the analysis of spin systems from arbitrary ab initio calculations. This was accomplished by the development of the Gau2Sim program library. The application of the included functions to a chemical shift tensor yields the isotropic chemical shift and the anisotropic information in its two established conventions, either expressed via the anisotropy and the asymmetry parameter or via the span and the skew. Additionally the tensor orientation as given by the three Euler angles can be extracted. On the base of this tool the combined approach of structural and NMR modeling was applied to the structure determination in a broad range of disordered, semi-ordered and fully crystalline phases. These systems varied from phases comprising of isolated molecules over hydrogen bonded molecular as well as polymeric phases to covalently bonded two-dimensional layered compounds. For the structural modeling in these environments the advantages of force field and semiempirical methods, density functional and perturbation theory calculations were combined with the description of the systems in the cluster or embedded cluster approach as well as with calculations under periodic boundary conditions. Such it was possible to directly validate structure proposals from diffraction measurements or to screen the structure of yet unknown phases on a broad range. In the latter case low level methods like force field or semiempirical calculations prove especially useful and could serve as a source for the extraction of unit cells from molecular clusters for purpose of calculations under periodic boundary conditions thereby interconnecting both techniques. The NMR properties of the phases were investigated in minimal structure models in this process testing all parts of the chemical shift tensor for their applicability for structure elucidation. Its easiest measurable parameter is the isotropic chemical shift which successfully was used for an interconnection between NMR experiments and structure models. It served well for the purpose of structure verification and in the case of extended 2D layered systems the impact of random local distortion on the chemical shift spectra could be predicted. However, in addition to that the anisotropic part of the NMR tensor could be used to distinguish between different molecular conformers and similar hydrogen bonding environments. Especially in polarizable moieties such as pi systems the anisotropy of the chemical shift is large enough to be evaluated. It proved to be sensitive to the local structural arrangement as well as the electronic environment of the spins. In a test case it could even be shown that the sensitivity of the carbonyl 13C tensor in a hydrogen bridge is large enough to predict the C=O...H-N arrangement through the analysis of theoretical calculated NMR hypersurfaces with the anisotropic parameters from NMR measurements. The most difficult information to analyze is the tensor orientation. This was was done by the measurement of 2D rf-driven spin-diffusion spectra for a 13C isotope labeled system. Through the simulation of 2D patterns on the base of theoretical structure models it was then possible to gain insight about the conformational arrangement of molecules in a disordered environment. Even though elaborate this methodological approach yielded highly detailed information about the local as well as intermediate structure of the solid state which was not available with any other method. An advantage of the method is that it can be applied to ordered and disordered phases alike. This work clearly shows the power of the combination of solid-state NMR measurements with theoretical modeling of the structure and the NMR chemical shift tensor. For future projects the presented Gau2Sim tools provide the basis for a routine analysis of theoretical NMR calculations and a subsequent simulation of spectra which can be compared to arbitrary NMR experiments.

Micelles and Interpolyelectrolyte Complexes formed by Polyisobutylene-block-Poly([meth]acrylic acid) - Synthesis of Polymers and Characterization in Aqueous Solutions (2007)

Markus Burkhardt

In this work PIB-b-PMAA copolymers with low PDI were studied, which self-assemble in aqueous solutions. A wide range of hydrophobic and hydrophilic block lengths were synthesized via combination of cationic an anionic polymerization. The data we have obtained by means of SANS and DLS point to an interesting dynamic behaviour of such micelles reacting on external stimulus of changes in pH from 10 to 7 and 5 respectively. The response is not only related to a change of the degree of neutralization of the PMAA block in the corona. Quantitative evaluation of SANS curves also shows a change of the size of the hydrophobic core formed by the PIB blocks, due to a change of the aggregation numbers. From cryo-TEM, a spherical shape of the micelles is clearly seen. This allows us to evaluate the SANS data using a model of a spherical particle with protruding arms. Evaluation of the SANS curves evidences about changes in Nagg with pH and with ionic strength. The higher the pH is, the more the arms of the micelle repel their neighbours and the higher the area at the core-corona interface of the micelle is. This leads to decreasing values of Nagg with rising pH. An increase in ionic strength has an opposite effect, resulting in higher Nagg upon improving screening of the charges of the PMAA. DLS measurements also show the response of the corona of the micelle on external stimuli. In principle, the PMAA block is more stretched the higher the number of charges on the arms of the micelles are. This also leads to an increasing Rh. Here the hydrophilic block dominates the response of the aggregate. For DLS, the influence of the PIB core and therefore the changes in Nagg can be neglected due to the longer PMAA block compared to the PIB block of the copolymers used in this work. Potentiometric titrations also show an effect of the ionic strength on the apparent pKa value, shifting it to lower values with increasing cNaCl, while the length of the hydrophilic block seems to play a minor role. For the evaluation of the cmc for different diblock copolymers the PIB block determines the properties of the micellar assemblies as well. The cmc clearly depends on the length of the hydrophobic PIB block. The longer the block is, the lower the cmc is found to be. Additionally a detailed investigation of IPECs formed by PIB-b-PMAA with P4VPQ is presented. The PIB-b-PMAA described above, are used to form water-soluble complexes with core-shell-corona structure. From cryo-TEM images, a spherical shape of the IPECs can be concluded. Slight differences in the overall shape of the complexed micelle give a hint on the proposed structure. The process of formation of complexes can be subdivided in a kinetically driven and a thermodynamically driven process. Upon addition of the polycation to the micellar PIB-b-PMAA solution, first an increase in turbidity of the solution can be observed. In this kinetically driven regime, large assemblies of micelles are formed. With time, these aggregates are equilibrating toward the thermodynamically more stable species of a single micelle with a complex species formed around the hydrophobic PIB core. The formation process can also be seen by means of SANS, leading to higher scattering intensity with increasing Z. SANS was used to follow the salt-induced dissociation of the complex as well. Increasing ionic strength of the IPEC solution leads to a release of the polycation, starting from about 0.2 M NaCl. Beyond 0.6 M NaCl, almost no difference in scattering behaviour of the IPEC solution compared to pure micelles can be stated. This suggests a total dissociation of the IPEC. By means of titration with a sodium selective electrode, the decrease of the activity of the Na ions can be explained by substitution of the polycation due to Manning condensation. Additionally the influence of point of time of addition of salt to an aqueous solution of a new diblock copolymer, PIB-b-PAA, is presented. By means of cryo-TEM, DLS and SANS an effect on the shape of the particles formed in solution could be obtained, whether the salt was added before dissolution (BD) or after dissolution of the polymer (PD). For the BD samples, a high PD of the particles can be seen from in cryo-TEM. Additionally sedimentation of a certain part of the polymer is another hint on larger aggregates. For the PD samples, spherical micelles with a core-corona structure are visible. According to cryo-TEM, their PDI is quite low. This suggests that interparticle exchange of unimers between the micelles is possible, at least before addition of the NaCl. Furthermore, it was shown, that changing the counterion to the "softer" Cs still allows the formation of equilibrium structures for BD samples, as seen from the spherical structure in cryo-TEM images. The influence of solvent for the SANS samples leads to a similar scattering behaviour for all measured samples.

Star-shaped Polyelectrolytes (2007)

Felix Plamper

Star-shaped polyelectrolytes were prepared by means of atom transfer radical polymerization (ATRP) utilizing the core-first approach. Star-shaped poly(acrylic acid) (PAA) with 5, 8 and 21 arms and different arm lengths was prepared via the corresponding poly(tert-butyl acrylate) (PtBA) precursors having a glucose, saccharose or beta-cyclodextrin core. Adopting the attempt for preparation of PAA we used the same scaffolds for the preparation of star-shaped poly(dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA). It is a weak cationic polyelectrolyte and it can be easily transformed to a strong one by quantitative quaternization (with methyl iodide) leading to poly{[2-(methacryloyloxy)ethyl] trimethylammonium iodide}, PMETAI). In order to reach high arm number a novel, hybrid silsesquioxane initiator with 58 initiation sites was introduced. The solution behavior of the obtained PAA stars was analyzed. Potentiometric titrations indicate a decrease of PAA’s acidity when increasing the arm number whereas a slight increase of the acidity was observed when increasing the molecular weight by increasing the length of the arms at constant arm number. The results are explained by the higher segment density of samples with short arms and high arm numbers, leading to a pronounced osmotic pressure inside the stars due to the presence of counterions. The osmotic pressure opposes further deprotonation, resulting in a decreased acidity. The osmotic coefficient decreases with increasing arm number, indicating higher counterion confinement within structures with higher branching. The use of strong polyelectrolytes facilitates the determination of the osmotic coefficient. It was seen directly that increasing arm numbers and decreasing arm lengths lead to a decrease of the osmotic coefficient. The osmotic coefficients of the investigated stars are in the range from 0.03 to 0.13, indicating the strong counterion confinement. Theory and experiment meet in the same order of magnitude. However the concentration dependence predicted by theory is not rendered by the experiment. The size of PMETAI stars in solution was investigated by dynamic light scattering (DLS), showing the expected collapse of the stars with increasing ionic strength. Electrostatic and osmotic screening leads to a retraction of the originally stretched arms, when no additional salt is present. However ion-specific effects lead to a more pronounced shrinkage when sodium chloride was exchanged with sodium iodide. The considerable osmotic pressure inside the star helps to incorporate multivalent counterions. The ion exchange reduces the number of counterions within the star, simultaneously increasing the translatory entropy of all counterions, since a multiple number of monovalent counterions is released into bulk for one multivalent counterion, which has been incorporated. The ion exchange leads to a decrease in osmotic pressure inside the star, reducing the strong stretching of the polymer’s arms, as seen by DLS. The collapse is more pronounced for counterions of higher valency. The switching of the counterion’s charge can therefore lead to smart polyelectrolytes. This was seen for the trivalent, light-sensitive hexacyanocobaltate(III), which by UV illumination transforms to a divalent counterion. Simultanously the hydrodynamic radius increases upon irradiation. Finally the thermoresponsive properties of aqueous solutions of star-shaped PDMAEMA were investigated. PDMAEMA is both pH-sensitive as temperature-sensitive, showing a miscibility gap at higher temperatures (LCST behavior). PDMAEMA shows a typical Flory-Huggins behavior irrespective to polymers architecture at high pH (in buffer), where it is virtually uncharged. Charge density starts to account for the deviations from ideal Flory-Huggins behavior at intermediate pH. The presence of multivalent ions leads in buffered solutions of PDMAEMA to the appearance of a miscibility gap at low temperatures (UCST behavior). In salt-free solutions the electrostatic stabilization is especially pronounced for polymers with high arm numbers (having higher charge density). No macroscopic demixing was observed for polymers with more than 9 arms.

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