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Thermodynamische Stabilisierung von Proteinen durch in vitro Evolution und biophysikalische Analyse ihrer molekularen Grundlagen
(2006)
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Michael Wunderlich
- Proteine sind zentrale Bausteine des Lebens und ihre dreidimensionale Struktur ist für die Funktion von entscheidender Bedeutung. Deswegen ist das Verständnis der konformationellen Stabilität von Proteinen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Selektionssystem Proside zur Stabilisierung von Proteinen genutzt. Proside basiert auf der phage display Technologie und verknüpft die thermodynamische Stabilität von Proteinen mit der Infektiosität von filamentösen Phagen. Die bakteriellen Kälteschockproteine werden sowohl von experimenteller, als auch theoretischer Seite als Modellproteine zur Untersuchung der Stabilität von Proteinen genützt. Es ist bekannt, dass elektrostatische Wechselwirkungen auf der Oberfläche von sehr großer Bedeutung für ihre Stabilität sind. Deswegen sollte versucht werden, alternative Ladungsnetzwerke auf der Oberfläche des Kälteschockproteins Bs-CspB aus B. subtilis unter Verwendung von in vitro Evolution zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden Reste anhand von Sequenz- und Strukturvergleichen mit homologen Proteinen ausgewählt und diese Positionen partiell randomisiert. In einem zweiten Ansatz wurden zufällig Mutationen in das Gen von Bs-CspB eingeführt. Nach erfolgter in vitro Evolution der jeweiligen Bibliotheken konnten an sechs oberflächenexponierten Positionen stabilisierende Mutationen identifiziert werden. Die Beiträge dieser Mutationen zur thermodynamischen Stabilität von Bs-CspB wurden analysiert. Die beste Kombination war, mit einem Schmelzpunkt von 83,7°C im Vergleich zu 53,8°C vom Wildtypprotein, sogar stabiler war als das hyperthermophile Homologe Tm-Csp aus T. maritima. Einen beachtlichen Beitrag zu dieser deutlichen Stabilisierung liefern dabei verbesserte Coulomb´sche Wechselwirkungen. Die Beiträge sind dabei jedoch sehr stark von der Umgebung abhängig. Vergleiche der experimentellen Daten mit vorhandenen theoretischen Betrachtungen offenbarten die Schwierigkeiten, Coulombsche Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche korrekt zu berechnen und deren Einfluss auf die thermodynamische Proteinstabilität zu bestimmen. Ein theoretischer Ansatz, welcher unter Verwendung eines quasi-elektrischen Dipolmomentes die Einflüsse von Veränderungen der Ladungsverteilung auf die Stabilität vorhersagte, konnte experimentell nicht verifiziert werden. Ebenso konnten keine Korrelationen zwischen Veränderungen der Stabilität und der Nettoladung des Proteins festgestellt werden und auch keine Korrelation mit der Bildung von Ionenpaaren hergestellt werden. Ebenso wie Bs-CspB stellt auch die b1 Domäne des Streptokokkenproteins G ein Modellprotein zur Untersuchung von thermodynamischer Stabilität dar. In der Gruppe von S. Mayo wurde dieses Protein unter Verwendung von computational design untersucht. Dabei zeigte sich, dass die vier teilweise exponierten Reste ein sehr großes Stabilisierungspotential besitzen. Eine in vitro Evolution dieser vier Positionen durch das Selektionssystem Proside bot somit die Möglichkeit, die Leistungsfähigkeit der beiden Methoden direkt zu vergleichen. Die Selektionen lieferten eine Vielzahl von deutlich stabilisierten Proteinvarianten. Für die stabilste Variante war der Mittelpunkt des thermischen Überganges um 24,7°C erhöht. Die beste Variante aus dem computational design lag von allen untersuchten Varianten auf dem dritten Platz. Sieben der zehn berechneten Varianten, welche in den Kalkulationen alle annähernd gleich stabil waren, enthielten einzeln oder in Kombination die Aminosäurereste L18 und K29. Diese beiden Reste erwiesen sich bei der experimentellen Charakterisierung als sehr ungünstig. Um die Ursachen für diese Unterschiede zu ergründen, wurde von zwei Varianten die dreidimensionale Struktur bestimmt. Zusätzlich wurden die enthaltenen Mutationen einzeln und in unterschiedlicher Kombination thermodynamisch charakterisiert. Dabei zeigten sich bei der Analyse die Schwierigkeiten, strukturelles Verhalten in experimentelle energetische Terme zu übersetzen, was der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse bei der Stabilisierung durch in vitro Evolution und computational design sein dürfte. Im Folgenden sollten für beide Schritte auf dem Weg zur Stabilisierung, der Auswahl von Positionen und dem Finden der besten Aminosäurereste, ein experimentelles Herangehen genützt werden. Durch Selektion von Bibliotheken mit zufälligen Mutationen, erstellt mittels fehlerhafter PCR, konnten viel versprechende Positionen identifiziert werden. Diese wurden dann einer Sättigungmutagenese mit anschließender Selektion unterworfen und die gefundenen Mutationen der beiden stabilsten Varianten wurden abschließend manuell kombiniert. Die erhaltene Variante besaß einen um 35,1°C erhöhten Übergangsmittelpunkt. Bei der Analyse der Ursachen zeigte sich, dass in diesem Fall starke hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den durch diese Mutationen eingeführten Seitenketten wirken. Dies zeigt, dass zur Stabilisierung von Proteinen vielfältige Wege beschritten werden können.
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Immobilisation von Enzymen auf sphärischen Polyelektrolytbürsten
(2006)
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Björn Haupt
- In dieser Arbeit wurde die adsorptive Immobilisation von Enzymen auf kolloidalen Partikeln untersucht. Diese Partikel bestehen aus Polystyrolkernen auf denen Polymerketten durch eine grafting from-Technik angeknüpft wurden. Sie werden als sphärische Polyelektrolytbürsten bezeichnet. Die Parameter dieser Partikel lassen sich gezielt über die Synthese einstellen. Durch die hohe Oberflächendichte wird ein so genannter brush erhalten, d.h. eine Schicht von Polymerketten, die fest an eine Oberfläche geknüpft sind und deren benachbarten Ketten sich deutlich überlappen. Der Dissoziationsgrad der geladenen Gruppen ist für annealed brushes, die aus schwachen Polyelektrolyten aufgebaut sind, vom pH-Wert abhängig. Für quenched brushes, deren Ketten aus starken Elektrolyten aufgebaut sind, ist der Dissoziationsgrad unabhängig vom pH-Wert. In Abwesenheit von Fremdsalzionen sind die Gegenionen der Polyelektrolytketten innerhalb des brush gefangen und die Ketten werden durch den resultierenden hohen osmotischen Druck bis fast an ihre Konturlänge gestreckt. Es wird hier von einem osmotic brush gesprochen. Für die hier durchgeführten Adsorptionsexperimente wurden drei verschiedene Enzyme verwendet: Glucoamylase, alpha-D-Glucosidase und beta-D-Glucosidase. Als Triebkraft der Adsorption trotz gleichnamiger Ladung der Trägerpartikel und der Enzyme wurde die counterion release force diskutiert: Die positiv geladenen Bereiche eines überwiegend negativ geladenen Enzyms wechselwirken mit negativ geladenen Ketten eines brush. Das zu adsorbierende Protein besitzt N+ positive und N- negative Ladungen. Durch die Adsorption werden nun je N+ Gegenionen des Enzyms und der Polymerketten frei gesetzt und N- Gegenionen in den brush aufgenommen. Somit werden 2 N+ - N- Gegenionen frei gesetzt und erhöhen die Entropie. Für die Beschreibung der Adsorptionskurven wurde ein Modell entwickelt, das als Grenzfälle die Langmuir-, Langmuir-Freundlich- und Brunnauer-Emmet-Teller-Theorie enthält. Allerdings wurde hier nicht von reversiblen Gleichgewichtszuständen ausgegangen. Die Adsorption von flexiblen Enzymen folgte einem BET-Verlauf. Ein Langmuir-Freundlich Verlauf wurde für globuläre Proteine beobachtet. Die Immobilisation von Glucoamylase lieferte sowohl für ein annealed- als auch für ein quenched brush-System übereinstimmende Ergebnisse. Dies kann mit der im Vergleich zur Adsorption von BSA geringeren Wechselwirkung zwischen Glucoamylase und brush erklärt werden. Die Aktivität der adsorbierten Enzyme wurde untersucht und die Ergebnisse mittels Michaelis-Menten-Kinetik ausgewertet. Diese liefert die Parameter Michaelis-Konstante KM und die Wechselzahl kcat. Als Untersuchungsmethoden standen UV/VIS-Spektroskopie und isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) zur Verfügung. Aktivitätsuntersuchungen von gelösten Enzymen unter gleichen Bedingungen dienten als Vergleich für die immobilisierten Enzyme. Für ein annealed und ein quenched brush-System konnte durch Untersuchungen von adsorbierter Glucoamylase gezeigt werden, dass die KM-Werte der immobiliserten Enzyme sich nicht signifikant im Vergleich zur Michaelis-Konstante des nativen Enzyms ändern. Untersuchungen von alpha- und beta-D-Glucosidase wurden mittels UV/VIS-Spektroskopie und ITC durchgeführt. Es wurde hier ebenfalls ein Erhalt der enzymatischen Aktivität gefunden. Für beta-D-Glucosidase konnte beobachtet werden, dass die KM-Werte mit steigender Beladung sich dem des nativen Enzyms annähern und für höchste Beladungen identisch sind. UV/VIS-Spektroskopie und ITC liefern vergleichbare Daten. ITC eignet sich somit als Untersuchungsmethode für die Enzymaktivität. Die Wechselzahl der immobilisierten Enzyme war in allen Messungen herabgesetzt. Besonders ausgeprägt war dieser Abfall für alpha-D-Glucosidase. Da KM erhalten bleibt und Konformationsuntersuchungen anderer adsorbierter Proteine zeigten, dass Adsorption nicht zu starken Konformationsänderungen führt, kann dieser Aktivitätsverlust nicht durch Störung der Konformation auftreten. Die verringerte Aktivität ist auf zur Vergleichsmessung unterschiedliche Bedingungen zurückzuführen. So ist der pH-Wert innerhalb des brush abgesenkt und die Ionenstärke erhöht. Es herrschen für innerhalb des brush adsorbierte Enzyme veränderte Bedingungen, die sich nach außen hin denen in Lösung angleichen. Enzyme, deren Aktivität für niedrige pH-Werte abgesenkt ist, erniedrigen somit kcat. Alpha-D-Glucosidase ist für pH-Werte kleiner als fünf nicht mehr im verwendeten Test aktiv. Zudem zeigten Untersuchungen, dass kcat abhängig von der Vorbehandlung des Enzyms ist. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Adsorption von Enzymen eine hohe Beladung sphärischer Polyelektrolytbürsten möglich ist. Durch diese einfache Vorgehensweise konnten mit Enzym beladene Trägerpartikel erhalten werden, die unter Erhalt der KM-Werte enzymatisch aktiv waren. Somit eignen sich sphärische Polyelektrolytbürsten ideal als Trägerpartikel für die Immobilisation von Enzymen.
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Synthese von 9,11-Drimenylchinonen und -hydrochinonen
(2006)
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Andreas Bernet
- Die vorliegende Arbeit beschreibt die Totalsynthesen des Sesquiterpenchinons Spongiachinon (1) und der Sesquiterpenhydrochinone (±)-Siphonodictyal B Derivat (±)-55 und (±)-Wiedendiol B ((±)-2). Spongiachinon (1) Schlüsselverbindungen bei der Synthese des Spongiachinons (1) waren die diastereomeren Benzylalkohole 5a,b. Ausgehend von (-)-Albicansäure ((-)-7) wurde über den (-)-Albicansäuremethylester ((-)-6) durch Reduktion mit DIBAL (+)-Albicanol ((+)-11) erhalten. PCC-Oxidation von (+)-11 lieferte (-)-Albicanal ((-)-3), das mit lithiiertem Tetramethoxybenzol zu den diastereomeren Benzylalkoholen 12a,b gekuppelt wurde. Katalytische Hydrierung von 12a,b an Palladium auf Kohlenstoff ergab die gewünschte Zwischenstufe 5a,b. Acetylierung von 5a,b zu 17a,b und anschließende CAN-Oxidation führte zu dem o-Dimethoxybenzochinon 19a,b. Durch Umsetzung des o-Dimethoxychinons 19a,b mit p-Toluolsulfonsäure konnte Spongiachinon (1) erhalten werden. Die Gesamtausbeute der ersten Totalsynthese von Spongiachinon betrug ausgehend von (-)-Albicansäure ((-)-7) 21 % über acht Stufen. Die Umsetzung der diastereomeren Benzylalkohole (±)-5a,b mit Trichlortrifluoraceton in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure führte zum 5,10-Drimenylaren (±)-15, das durch eine interessante Umlagerungsreaktion entstand. CAN-Oxidation von (±)-15 ergab das o-Dimethoxybenzochinon (±)-22, das durch Behandlung mit Perchlorsäure (±)-Isomamanuthachinon ((±)-20) lieferte. Siphonodictyal B Derivat (±)-55 Für die Synthese des Siphonodictyal B Derivates (±)-55 wurde ein neues Kupplungsverfahren eingesetzt. Dazu wurde (±)-Drimansäurechlorid ((±)-28) mit entsprechend geschützten lithiierten Aromaten umgesetzt, die aus den Bromiden 32, 37, 45, 56 und 13 durch Brom-Lithiumaustausch mit n-BuLi gebildet wurden. Die Darstellung der Aromatenbausteine gelang häufig über deutlich effektivere und kürzere Synthesewege im Vergleich zu Literaturverfahren. (±)-Drimansäurechlorid ((±)-28) wurde aus (±)-Drimansäure ((±)-29) durch Reaktion mit Oxalylchlorid / DMF in quantitativer Ausbeute erhalten. Die durch die Kupplung entstandenen Ketone konnten alle mit LiBHEt3 in Ausbeuten von 100 % zu den diastereomeren Benzylalkoholen reduziert werden. Die Einführung der Formylgruppe in Position 3' durch Lithiierung und Umsetzung mit DMF gelang nur bei Styren (±)-53, das aus Keton (±)-51 durch Reduktion zu den Benzylalkoholen (±)-52a,b und anschließende Eliminierungsreaktion gebildet wurde (Abb. 5.4). Demethylierung von Aldehyd (±)-54 mit Bortrichlorid / Tetrabutylammoniumiodid ergab das Siphonodictyal B Derivat (±)-55, das bisher nicht zu Siphonodictyal B entschützt werden konnte. (±)-Wiedendiol B ((±)-2) Zur Darstellung von (±)-Wiedendiol B ((±)-2) wurde der Aromat 57 mit t-BuLi lithiiert und anschließend mit (±)-Drimansäurechlorid ((±)-28) zum Keton (±)-63 gekuppelt. Reduktion der Ketofunktion mit Lithiumtriethylborhydrid lieferte die diastereomeren Benzylalkohole (±)-64a,b. Für die Eliminierung von Wasser aus den Benzylalkoholen (±)-64a,b wurden zwei neue Verfahren entwickelt, die mit Chloral / p-Toluolsulfonsäure und dem Pyridin*SO3-Komplex arbeiten und sehr gute Ausbeuten liefern. Für die Umsetzung von temperaturempfindlichen Substraten ist besonders die Methode mit Chloral / p-Toluolsulfon-säure geeignet. Anschließende Entschützung der Isopropylidenverbindung (±)-65 mit HCl / EtOH führte zu (±)-Wiedendiol B ((±)-2) und dem durch Gerüstumlagerung entstandenen (±)-Isowiedendiol B ((±)-66) (Abb. 5.5). Die Gesamtausbeute für (±)-Wiedendiol B ausgehend von (±)-Albicansäure ((±)-7) betrug 40 % über acht Stufen.
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Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der RNA-Helikase YxiN - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer in einzelnen Molekülen
(2006)
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Bettina Theißen
- Die Aufhebung von RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein-Wechselwirkungen durch RNA-Helikasen ist für viele zelluläre Prozesse von grundlegender Bedeutung. Die RNA-Helikase YxiN aus Bacillus subtilis ist an der Biogenese der Ribosomen beteiligt. YxiN besitzt neben den beiden konservierten Helikasedomänen eine dritte, RNA-bindenden Domäne, die für die Sequenzspezifität verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus von YxiN mittels Einzelmolekül-FRET-Experimenten untersucht, um Einblick in den Mechanismus der RNA-Entwindung zu erhalten. Rekombinantes YxiN konnte in nativer Form aus Escherichia coli gereinigt werden. YxiN bindet Adeninnukleotide und zeigt eine feste Bindung von RNA. In gekoppelten spektroskopischen Tests wurde die RNA-abhängige ATP-Hydrolyse beobachtet. Die ATP-abhängige RNA-Entwindung wurde in einem dafür entwickelten fluoreszenzbasierten Test in Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Für Einzelmolekül-FRET-Experimente wurde YxiN mit zwei Fluorophoren markiert. Dazu mussten zunächst die zugänglichen Cysteine des Wildtyps durch Serin ersetzt werden. Anschließend wurden Cysteine an potentiell lösungsmittelzugänglichen Positionen eingeführt und durch Reaktion mit Dithionitrobenzoat (DTNB) und Tetramethylrhodamin-Maleimid auf ihre Zugänglichkeit getestet. Die Reaktivität der Cysteine mit farbstoffgekoppeltem Maleimid unterschied sich dabei deutlich von der Reaktivität mit DTNB. Die YxiN-Mutanten mit zugänglichen Cysteinen zeigten ähnliche Stabilität und Aktivität wie der Wildtyp. YxiN-Mutanten mit je einem zugänglichen Cystein in beiden Helikasedomänen wurden mit Alexa488 als Fluoreszenzdonor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor markiert. Mit limitierter Proteolyse und anschließender Detektion der Fluoreszenz der Fragmente in Polyacrylamidgelen konnte die Orientierung der Fluorophore in YxiN überprüft werden. In Ensemble-Fluoreszenzspektren von doppelt markiertem YxiN konnten keine Änderungen der FRET-Effizienz bei der Substratbindung detektiert werden. In Einzelmolekül-FRET-Experimenten hingegen konnten zwei verschiedene Zustände mit unterschiedlicher FRET-Effizienz identifiziert werden, die zwei verschiedenen Konformationen entsprechen. Die offene Konformation des freien YxiN bleibt auch in Gegenwart von Nukleotiden erhalten. Die zweite, geschlossene Konformation tritt erst in Gegenwart von RNA auf und wird bei der Bindung von ATP stärker populiert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ein erweitertes Destabilisierungsmodell vorgeschlagen. Die C-terminale RNA-Bindungsdomäne positioniert dabei die Helikase sequenzspezifisch auf der RNA. Die beiden Helikasedomänen binden unspezifisch an einzelsträngige RNA oder den Übergang von Einzelstrang zu Doppelstrang in der Umgebung. Dabei schließt sich der Spalt zwischen den Domänen. Die Hydrolyse von ATP oder die anschließende Freisetzung von ADP führt zu der Destabilisierung einiger Basenpaare des RNA-Doppelstranges, so dass ein kurzer RNA-Doppelstrang dissoziieren kann. Einzelmolekül-FRET-Experimente eignen sich also zur Beobachtung von Konformationsänderungen in YxiN und liefern damit Einblick in den Mechanismus der RNA-Helikase. Weiterführende Experimente werden ein detailliertes Verständnis für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ermöglichen.
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Donor-Acceptor Block Copolymers for Charge Separation at Nanostructured Interfaces
(2006)
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Stefan Lindner
- The motivation for this thesis was the synthesis and characterization of novel materials exhibiting nanostructured interfaces for electro-optical studies. Therefore a series of functionalized block copolymers, acceptor labeled polymers and low molecular weight model compounds were synthesized in which hole transport (donor), electron transport (acceptor) and light absorbing functionalities were incorporated. My approach was to use functionalized block copolymers. Block copolymers exhibit microphase separation with domain sizes on a nanometer scale by the interplay between immiscibility and molecular connectivity. I used a controlled radical polymerization technique, the nitroxide mediated radical polymerization (NMRP), to get block copolymers with one block consisting of an electron transport material and the other one of a hole transport material. Triphenylamine was used as hole conductor in combination with perylene bisimide as dye and electron conductor. First, a soluble perylene bisimide monomer had to be synthesized. This was achieved by an unsymmetrical synthesis starting from the perylene-3,4:9,10-tetracarboxylic bisanhydride. For the solubility a swallow-tail substituent was introduced and the other imide group was functionalized with an acrylate to get the monomer. Starting the polymerization with 4-vinyltriphenylamine, different PvTPA 23 macroinitiators were synthesized. A series of block copolymers 24C-24F were prepared using the same PvTPA macroinitiator 23C, thus only varying the perylene bisimide block. Furthermore, a series of block copolymers 24A-24C were synthesized using different PvTPA macroinitiators 23A-23C. Thus block copolymers with different molecular weights, but similar ratios of the blocks could be prepared. The controlled nature of NMRP allowed the architecture of these block copolymers with low polydispersities and controlled molecular weight. The block copolymers exhibited microphase separation, revealing elongated nanowire like structures for those with high perylene bisimide content. Most of these block copolymers exhibit a constant width of 13 nm for the nanowire like structure of the perylene bisimides. This was the first examples of microphase separation of block copolymers carrying electron transport and hole transport blocks. The electrochemical properties of the block copolymers were studied using cyclic voltammetry. The LUMO of the perylene bisimide block is -3.65 eV and the HOMO of the triphenylamine block is -5.23 eV. Therefore the maximum built-in potential and theoretically achievable photovoltage Voc is 1.58V. The efficiency of the block copolymer solar cells is one order of magnitude higher than that of the comparable blend device. It could also be shown that the block copolymer in the solar cell is microphase separated, revealing domain sizes from 10 to 50 nm, whereas the blend on the other hand is macrophase separated. This is the first report of charge separation at a nanostructured bulk interface in a block copolymer consisting of an electron transport and a hole transport material exhibiting microphase separation. These results are thus proof-of-principle for the nanostructured bulk heterojunction solar cells using block copolymers. Furthermore, fluorescent acceptor labeled polymers were synthesized using a series of monomers in order to obtain a single dye unit attached to various polymer chains. These polymers were prepared by nitroxide mediated radical polymerization with an alkoxyamine initiator that is covalently bound to a perylene bisimide moiety. It could be shown with MALDI-TOF mass spectrometry that a single perylene bisimide unit is incorporated in each polymer chain. By using 4-vinyltriphenylamine monomers bifunctional polymers (8) containing electron donating moieties and a single electron acceptor unit were obtained. The polymerization of standard monomers such as styrene and acrylates, gave polymers (9-12) with only a single electron acceptor unit. Also novel electron acceptors consisting of perylene bisimide and fullerene moieties 15 and 17 were prepared and characterized. Although these dyads do not exhibit any ground state electronic coupling between the individual moieties, the emissive properties of the perylene bisimide units are strongly influenced by the covalently bound fullerene. The fluorescence of the perylene bisimide moiety is quenched by 99 % due to energy and electron transfer between the fullerene and the perylene bisimide. Beside the use as a model system these dyads are also capable of being used in organic solar cells. PCBM, the fullerene derivative which is usually used in polymer solar cells, is barely absorbing light and therefore perylene bisimide functionalized fullerenes may be an alternative as they strongly absorb light in the visible region.
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Oligosaccharid-gerichtete RNA-Aptamere
(2006)
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Maria Milovnikova
- Im Rahmen dieser Arbeit sollte die SELEX Methode, zur Gewinnung von RNA-Aptameren, die ausgewählte an der Membranoberfläche eukaryotischer Zellen häufig vorhandene Oligosaccharide spezifisch erkennen, etabliert werden. Zum Erreichen dieser Ziele wurden vier Oligosaccharide Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man-OR; a-Neu5Ac-2,3-b-Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man-OR; 2,4-(b-Gal-1,4-b-GlcNAc)2-a-Man-OR und 2,4-(a-Neu5Ac-2,3-b-Gal-1,4-b-GlcNAc)2-a-Man-OR mittels chemisch-enzymatischer Verfahren mit zwei unterschiedlichen Spacern synthetisiert. Die Spacer ermöglichten eine kovalente Immobilisierung der Oligosaccharide an verschiedenen Oberflächen durch eine Amino- oder Thiolgruppe. Es wurde der Einfluss der Zusammensetzung, der Größe, der Verzweigung und der Ladung der Oligosaccharide auf die Ergebnisse der in vitro Selektion unter verschiedenen Selektionsbedingungen untersucht. Die biochemischen Eigenschaften und die Bindungsspezifität von drei selektierten RNA-Aptameren 5G, 9G und 10G, die bei mehreren unabhängigen Selektionen isoliert wurden, wurden analysiert. Zur qualitativen Analyse der RNA/Oligosacharid-Interaktion wurde auch die Oberflächen-Plasmon-Resonanz- Spektroskopie benutzt. Gleichzeitig wurden die Bindungskonstanten für RNA Aptamere 5G, 9G, 10G und das Trisaccharid Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man bestimmt. Um auswertbare Resultate aus den Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie-Experimenten zu erhalten, mussten diese für die spezifischen Eigenschaften der Bindungspartner optimiert werden. Wahrscheinlich auch wegen der Tendenz der Aptamere zur Oligomerisierung konnte nicht eindeutig gezeigt werden, ob die selektierten Aptamere die Oligosaccharide, die auf Sepharose 6B-basierende Festphase oder beides erkennen. Dies führte zu weiteren Selektionen mit modifizierten und optimierten Bedingungen. Es hat sich gezeigt, dass man durch gezielte Variationen des Selektionsprozesses die Selektion von RNA-Aptameren gegen Oligosaccharide lenken kann. Die Selektionen lieferten neue Oligosaccharid-bindende RNA-Aptamere. Es zeigt sich, dass die Optimierung der Selektionsbedingungen für eine erfolgreiche in vitro Selektion und Gewinnung von spezifisch bindenden Aptameren wesentlich ist. Den größten Einfluss auf die Ergebnisse der Selektion hatten die Eigenschaften der Festphase, die zu der Immobilisierung der Oligosaccharide benutzt wurde.
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Biochemical analysis of the interaction between transfer ribonucleic acid and exportin-t
(2006)
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Sheng Li
- In this thesis the ternary complex of tRNA•exportin-t•Ran•GTP was studied by biochemical and biophysical methods. Firstly, photocrosslinking was used to determine the contact sites between tRNA and exportin-t. 4-Thiouridine (s4U) was introduced into tRNAPheT.th by in vitro transcription with T7 RNA polymerase and crosslinked to exportin-t by irradiation at 312 nm. The crosslinking was Ran•GTP dependent and could be competitively inhibited by other tRNA species, showing that the crosslinking was the consequence of the formation of a tRNA•exportin-t•Ran•GTP complex. The crosslinked complex of (s4U)tRNAPheT.th-exportin-t after proteinase K digestion was incubated with a primer complementary to the 3'end of the tRNAPheT.th in the primer extension reaction. The elongation of the reverse transcriptase was forced to halt at s4Us crosslinked to peptides, namely, U55, U47, U33, U20. Among them, U47 and U55 were shown to be the major crosslinking sites. U47A mutation was introduced into tRNAPheT.th to test the role of U47. The mutant tRNAPheT.th transcript was still able to bind exportin-t, though a little weaker than normal tRNAPheT.th transcript. In contrast, s4U containing mutant tRNAPheT.th U47A exhibited a much poorer capability to crosslink exportin-t. It is concluded that U47 may be a major contact site between tRNAPheT.th and exportin-t. Secondly, the binding abilities of different tRNA species in calf liver tRNABulk to exportin-t was examined by affinity chromatography on immobilized exportin-t. With a stepwise elution of 250 mM and 500 mM KCl, tRNABulk was fractionated into 2 peaks. Therefore, Different tRNAs bound to exportin-t with different affinity. Among 7 tRNAs tested, the relative affinity to exportin-t ranked as tRNALeuCAG > tRNASerGCU, tRNALeuCAA, tRNASerUGA > tRNASerAGA, tRNALeuAAG > tRNAArgACG. To interpret the different affinity of tRNAs to exportin-t, it is proposed that exportin-t preferentially exports tRNAs that are required the stronger by the protein synthesis machine. The extent of requirement of a specific tRNA by cells is supposed as the ratio between the tRNA concentration in a cell and its codon frequency in the genome, if all tRNAs are supposed to be aminoacylated and transported to ribosome equally. It was found that among 7 tRNAs identified on the 2D urea PAGE, the theoretical estimation of 5 tRNA species upon their requirement by cell ranked the same as their relative affinity to exportin-t. Finally, atomic force microscopy was used to observe exportin-t and its interaction with tRNA in a native and undisturbed state directly. Exportin-t-esterase, immobilized to trifluoromethyl ketone (TFK) modified mica surface, showed a diameter of 15 ± 2 nm. After binding tRNA and Ran•GppNHp, the diameter of the complex somewhat increased to 16 ± 2 nm.
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New Carbazole Based Materials for Optoelectronic Applications
(2006)
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Martin Sonntag
- The motivation for this thesis was the synthesis, characterization and the testing of new, environmentally stable materials based on aromatic amines for OFET and OLED applications. The preparation of high quality thin films from solution as well as from the gas phase was an another important issue. The first part of this thesis deals with star-shaped molecular glasses with triphenylamine as core molecule. Substituted fluorene and carbazole units were attached to the core molecule as side arms via a trifold Suzuki cross coupling reaction. The target compounds were highly purified by medium pressure liquid chromatography (MPLC) as purity is an important prerequisite for organic materials to be used for optoelectronic applications. Before the new materials were finally tested in transistor devices, a suitable surface treatment of the OFET substrates was developed. By introducing self-assembled monolayers, prepared from hexamethyldisilazane (HMDS), on top of the SiO2 insulator layer of the FET substrates, the field-effect mobility was increased by at least one order of magnitude. Furthermore it was possible to improve on/off-ratios as well as turn on voltages. In conclusion hole carrier mobilities up to 3 x10-4 cm2/Vs and on/off-ratios of 10000 were achieved from the new star-shaped compounds. The performance of the devices was not affected by a four month storage period in air and daylight. The second part of this thesis describes the synthesis and characterization of a new class of fused heterocycles based on carbazole units. For this issue a series of bisindenocarbazoles is introduced as a new class of fused heterocycles. A synthetical procedure was designed which allows to tailor the thermal properties of the target compounds by introducing different alkyl substituents in the very last step of the synthesis. Yields up to 50 % can be obtained after six synthetical steps including purification of the intermediates. CV measurements showed the electrochemical stability of the novel compounds. Altogether five bisindenocarbazoles with different alkyl substitution patterns have been prepared and characterized. Their morphology varies from highly crystalline materials with short alkyl side chains to amorphous molecular glasses if longer or branched alkyl groups are attached to the core. As the bisindenocarbazoles exhibit a bright blue fluorescence together with high quantum yields, they were tested as blue emitter for OLED applications. In typical setups for blue light emitting LEDs, the blue emitter is doped into a wide band gap host material in order to avoid quenching of the electroluminescence and to adjust the energy levels of the different materials used in the setup. For this issue CBP, mCP and TCTA were tested as matrix materials together with a bisindenocarbazole as emitter. A combinatorial evaporation setup was used for the preparation of the OLED devices in order to dope the different host systems by co-evaporation of the bisindenocarbazole dye. This deposition method also allows the variation of the film thicknesses of the charge transport layers in a single experiment. By using this device architecture a deep-blue emission from the bisindenocarbazole dye at CIE color coordinates of x = 0.19 and y = 0.17 was obtained at a hole blocking layer thickness of 40 nm. Luminance values up to 200 cd/m2 were achieved with this series of devices. The turn on of the light emission was observed at 5 V. These very first results show that the bisindenocarbazole is a promising new blue fluorescent emitter for organic LEDs. Due to the rigid rod-like core of the bisindenocarbazole it was possible to obtain a novel derivative exhibiting a broad nematic mesophase by extending the core with aromatic side groups. By using a suitable alignment method, it is possible to obtain well ordered LC monodomains from which increased charge carrier mobilities can be obtained. The nematic LC phase was characterized with polarizing microscopy (POM) and small angle X-ray scattering (SAXS).
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NMR Studies on Termination/- Antitermination Complexes of HIV-1 Transcription
(2006)
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Nageswara Rao Jampani
- After HIV enters the host cell the viral RNA is reverse transcribed into double stranded DNA and then integrated into the host genome. At this step, transcription of HIV RNA by Rpol II is tightly regulated by several cellular factors including NELF, DSIF, and pTEFb, and the virus encoded Tat protein. The work presented in this thesis is mainly focussed on understanding the mechanism of termination and antitermination of HIV-1 transcription. Some of the cysteines in the wild type HIV-1 Tat are required for the Zn2+ dependent interaction with pTEFb, but not needed for the binding of TAR RNA in vitro. These cysteines are readily oxidised and leading to the protein aggregation. Thus, a mutant, Tat-Cys-, lacking all cysteines was used for binding studies with TAR RNA. 1H-15N HSQC and 1H-1H TOCSY spectra were measured to monitor the interaction between Tat-Cys- and TAR RNA. The results presented indicate Tat-Cys- is binding to TAR RNA around the bulge region and is able to induce a conformational change in TAR RNA. This is further supported by observing a change in the CD signal at 265 nm upon addition of Tat-Cys- to TAR RNA. {1H}-15N steady state NOE experiments showed that the core region of Tat remains unstructured even in the complex with TAR RNA. Based on the NMR and CD spectroscopic data presented in this thesis, and data published by others it is tempting to speculate that the core and basic regions of Tat-Cys- remain unstructured upon binding to TAR RNA. Furthermore, the solution structure of the RNA binding domain of NELF-E, NELF-E RRM, was determined using multidimensional NMR spectroscopy. The data reveal that the structure of NELF-E RRM exhibits a babbab topology. The atomic coordinates were deposited in the protein data bank (pdb) under the accession code 2BZ2. RNA binding studies were performed with TAR RNA and various oligoribonucleotides. NMR studies with NELF-E RRM:TAR complexes indicate NELF-E RRM binds to various RNAs in a very similar manner but with different affinities. Mapping of chemical shift perturbations on the structure of NELF-E RRM indicate that the RNA binding interface is mainly located on the b-sheet surface. Large chemical shift perturbations are observed for the residues located in the flexible C-terminal region of NELF-E RRM and in the loop between b3 and a2. Among the various RNAs tested, TAR49-57 displayed the highest affinity to NELF-E RRM. Further structural characterisation of the NELF-E RRM:TAR49-57 complex revealed that the C-terminal region of NEFL-E RRM adopts a small 310 helix around the b3-a2 loop and is stabilised by several hydrophic interactions. The C-terminal region of NELF-E RRM in the RNA bound conformation is very close to the RNA binding interface and could be involved in the RNA binding. However, further structural characterisation of NELF-E RRM in the complex with RNA will be needed to fully understand the mechanism of RNA recognition.
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Fused and spiro furanones from tetronic acid synthons: Oxa and azacycles featuring the butenolide ring
(2006)
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Juan-Manuel Urbina-Gonzalez
- Diverse 4-O-allyl tetronates were obtained by reaction of allyl (alpha-hydroxy)carboxylates with keteneylidenetriphenylphosphorane (Ph3PCCO) in a domino reaction (addition – Wittig olefination) and by direct allylation of tetronic acid via Fischer esterification. 3-Allyl tetronic acids were generated by Claisen rearrangement of 4-O-allyl tetronates under microwave conditions; a subsequent Conia reaction produced the corresponding spiro cyclopropane furan-2,4-diones. Nucleophilic ring opening with diverse alcohols converted the spiro cyclopropane furan-2,4-diones to 3-beta-alkyloxypropyltetronic acids. When using O-benzyl isourea for the 4-O-alkylation of 3-allyl tetronic acids, the 3-benzyl derivatives were also formed (five examples were prepared). The Mitsunobu reaction proved to be a better way for the 4-O-alkylation of 3-allyl tetronic acids. 3,3-Diallyldihydrofuran-2,4-diones with two identical allyl residues were obtained by Tsuji-Trost-type Pd-catalysed allylation of either 4-O-allyltetronates or 3-allyltetronic acids. Pd assisted allylation of sodium 3-allyltetronate with a second allyl acetate gave mixed derivatives as did the Claisen rearrangement of 4-O-allyl 3-allyltetronates under microwave conditions. 3,3-Diallyldihydrofuran-2,4-diones were converted to butanolides with 3,3-spirocyclopentenyl or 3,4-cycloalkanyl annulation by ring closing methathesis with Grubbs’ catalysts. Natural product pesthetoxin was prepared via a double Ph3PCCO addition to alpha-hydroxy benzyl octanoate, thus demonstrating the utility of keteneylidenetriphenylphosphorane as a C2O building block. Finally, (-)-3-epi-blastmycinolactol was prepared enantioselectively via double hydrogenation of 3-but-2-enyl tetronic acid.
