OPUS 4 | Chemie

Synthese und Charakterisierung neuer Pentamethylcyclopentadienyl-Halbsandwichkomplexe des Tantals mit N-haltigen Liganden (2003)

Achim Goller

Halbsandwichkomplexe mit Metallen der 5. Gruppe des Periodensystems (M = V, Nb, Ta) sind in großer Anzahl bekannt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Verbindungen sind Vanadiumkomplexe, es gibt wesentlich weniger Niobkomplexe und am kleinsten ist die Anzahl der Tantalverbindungen. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, ausgehend von Cp*TaCl4 (1) neue Pentamethylcyclopentadienyl-Halbsandwichkomplexe des Tantals zu synthetisieren und zu charakterisieren. Halbsandwich-Azidokomplexe Zur Darstellung neuer Halbsandwich-Azidokomplexe des Tantals wurde Cp*TaCl4 (1) mit Trimethylsilylazid, Me3SiN3, zur Reaktion gebracht. Dazu wurde 1 mit einem zunehmenden Überschuss an Trimethylsilylazid umgesetzt, um einen sukzessiven Austausch der Chloroliganden gegen Azidoliganden zu erreichen. Unter milden Bedingungen, d. h. bei der Reaktion von 1 mit einer stöchiometrischen Menge an Trimethylsilylazid entstand zunächst der zweikernige Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Monoazido-Trichloro-Tantal-Dimer (18). Durch Erhöhung der Reaktionstemperatur und Verlängerung der Reaktionszeiten konnten die restlichen Chloroliganden schrittweise weiter durch terminale Azidoliganden substituiert werden. So führte die Umsetzung von Cp*TaCl4 (1) mit einem zehnfachen Überschuss an Trimethylsilylazid bei Raumtemperatur nach 2-3 h zum disubustituierten Produkt Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Dichloro-Tantal-Dimer (19), der trisubstituierte Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Triazido-Monochloro-Tantal-Dimer (20) entstand bei gleichem Überschuss an Me3SiN3 nach 18 h in siedendem CH2Cl2. Der Tetra(azido)-Halbsandwichkomplex (21) wurde schließlich erhalten, als die Ausgangsverbindung Cp*TaCl4 (1) mit einem zwanzigfachen Überschuss an Trimethylsilylazid drei Tage lang in Toluol am Rückfluß (110°C) erhitzt wurde. Triazolato-Halbsandwichkomplexe Triazolato-Halbsandwichkomplexe des Tantals wurden erhalten, wenn Cp*TaCl4 (1) mit den beiden silylierten Vorstufen 4,5-Di(methoxycarbonyl)-1-trimethylsilyl-1,2,3-triazol (40) und 4,5-Di(ethoxycarbonyl)-trimethylsilyl-1,2,3-triazol (41) zur Reaktion gebracht wurde. Unter Freisetzung von Trimethylchlorsilan wurde ein Chloroligand von 1 durch einen Triazolato-Liganden substituiert. Interessant war die in diesem Fall auftretende Koordinierung der Alkoxysauerstoffatome der Estergruppen von 42 und 43 in Position 5 an das Metallzentrum, gefolgt von einer intramolekularen Wanderung der Alkylreste an die Lewis-basischen Stickstoffatome in Position 3, wodurch fünfgliedrige Aza-oxo-metallacyclen entstanden. Phosphoraniminato-Komplexe An den Azidoliganden des Halbsandwichkomplexes Pentametylcyclopentadienyl-Triazido-Monochloro-Tantal-Dimer (20) wurde die Staudinger-Reaktion mit Triphenylphosphan durchgeführt. Im Laufe von 3 Tagen entstand in siedendem Toluol bei Anwesenheit eines Überschusses an Triphenylphosphan der azidoverbrückte Di(azido)-phosphoraniminato-Halbsandwichkomplex Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Chloro-Triphenylphosphoraniminato-Tantal-Dimer (52) Nach zweistündiger Bestrahlung einer THF-Lösung von 20 in Anwesenheit des gleichen Überschusses an Triphenylphosphan wurde ebenfalls 52 isoliert. Eine Umsetzung an sämtlichen Azidoliganden von 20, die zum einkernigen Komplex Cp*TaCl(N=PPh3)3 (53) führte, konnte nach einer Reaktionszeit von 6 Tagen in siedendem Toluol erreicht werden. Schließlich wurde die thermische Staudinger-Reaktion an 20 noch mit Tris(1-cyclohepta-2,4,6-trienyl)phosphan durchgeführt; nach einer Reaktionszeit von 5 Tagen in siedendem Toluol wurde der zweikernige Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Chloro-Tricycloheptatrienylphosphoraniminato-Tantal-Dimer (54) erhalten. Bis(trimethylsilyl)amido-Trimethylsilylimido-Komplexe Die Umsetzung von Cp*TaCl4 (1) mit zwei Äquivalenten Lithium-bis(trimethylsilyl)-amid führte unter Abspaltung von zwei Äquivalenten LiCl und einem Äquivalent Trimethylchlorsilan zum Halbsandwichkomplex Pentamethylcyclopentadienyl-chloro-bis(trimethylsilylamido)-trimethylsilylimido-tantal(V) (88). Das entsprechende einkernige Azidoderivat 94 wurde durch Umsetzung von 88 mit einem Überschuss an Trimethylsilylazid erhalten Am Azidoderivat von 88, dem Halbsandwichkomplex Pentamethylcyclopentadienyl-bis-(trimethylsilyl)amido-azido-trimethylsilylimido-tantal(V) (94) wurde eine photoinduzierte Staudinger-Reaktion unter Verwendung eines Überschusses an Triphenylphosphan durchgeführt. Das Produkt war 95, ein einkerniger Komplex, der sowohl Nitridobrücken zum Phosphor als auch zum Silicium enthält. Der entsprechende triethyl-substituierte Komplex 96 wurde durch Umsetzung von 88 mit Triethyl-phosphanimin (66) unter Verwendung von Triethylamin als Hilfsbase erhalten. Die einkernigen Komplexe 94-96 sind auch deshalb von besonderem Interesse, weil sie nebeneinander 3 unterschiedliche N-haltige Liganden in der Koordinationssphäre enthalten.

Novel Precursors for Polymer-Protein-Conjugate Synthesis via Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization (2003)

Christine Maria Schilli

The RAFT polymerization of N-isopropylacrylamide with two different chain transfer agents, namely benzyl 1-pyrrolecarbodithioate and cumyl 1-pyrrolecarbodithioate, yielded polymers with narrow molecular weight distributions as well as Mn values that were in good agreement with the calculated ones. A comparison between the Mn values determined from gel permeation chromatography, GPC, and the values from MALDI-TOF mass spectrometry showed that the molecular weights obtained from GPC using polystyrene standards were considerably higher. A relation between log Mn,MALDI and log Mn,GPC was established, which permitted construction of a calibration curve for PNIPAAm polymers. In-situ Fourier-transform near-infrared spectroscopy was applied for the reliable determination of monomer conversions and it indicated living characteristics. Both polymerization processes showed an induction period that seems to be correlated with a retardation in rate, where the induction time is higher for the cumyl chain transfer agent as compared to the benzyl chain transfer agent of the same concentration. The induction periods decrease with decreasing transfer agent concentration and were explained in terms of the different stabilities of the respective radicals that add to monomer in the reinitiation step. The more stable cumyl radical adds slower than the benzyl radical. Both UV spectroscopy and MALDI-TOF mass spectrometry confirm the presence of the expected dithiocarbamate endgroups. MALDI-TOF characterization of the polymer samples showed the transfer agent endgroups together with some initiator-derived polymers. Endgroups that seemed to originate from disproportionation or transfer were the result of fragmentation under MALDI conditions as was shown by a post source decay analysis and MALDI-TOF characterization of the hydrolyzed polymer. With amine-reactive diacetone acrylamide, 2-vinyl-4,4-dimethyl-5-oxazolone and N-hydroxysuccinimide methacrylate, new monomers were polymerized via RAFT in a controlled manner. Poly(diacetone acrylamide) and poly(2-vinyl-4,4-dimethyl-5-oxazolone) showed low polydispersities and good control over molecular weight, where poly(N-hydroxysuccinimide methacrylate) displayed relatively high polydispersities despite the controlled polymerization evident from the monomodal GPC traces. These amine-reactive polymers were subsequently used for successful conjugation to the primary amino group of the model peptide glycine-leucine. For poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(acrylic acid), PNIPAAm-b-PAA, it was demonstrated that hydrogen bonding between N-isopropylacrylamide and acrylic acid units influences strongly its behavior in both the solid state and in solution. The block copolymers form micelles in aqueous solutions in dependence of pH and temperature. Cloud point measurements indicated the formation of larger aggregates at pH 4.5 and temperatures above LCST, whereas micelles formed at pH 5-7 and temperatures above LCST. At pH 5.6 and 50 °C, only micelles were found, whereas, at lower temperatures, larger aggregates and micelles coexist. Formation of larger aggregates by hydrogen bonding interactions was revealed by IR and Raman spectroscopy as well as by cryogenic transmission electron microscopy and dynamic light scattering. Differential scanning calorimetry yielded glass transition temperatures of PNIPAAm-b-PAA that were well above the transition temperatures of the homopolymers, demonstrating molecular interactions between the acrylic acid and the N-isopropylacrylamide blocks. Conjugation of sulfhydryl-terminated PNIPAAm to thiol disulfide exchange reagents and maleimides was probed for later conjugation to proteins. Evaluation of the different cross-linking systems resulted in the choice of maleimides as cross-linkers for subsequent conjugation to the protein streptavidin. Sulfhydryl-terminated PNIPAAm-b-PAA was conjugated to the streptavidin mutant S139C using a bismaleimide cross-linker and also direct conjugation via disulfide linkage. Both conjugations were successful and proceeded with more than 50 % conversion. Conjugation of PNIPAAm and PNIPAAm-b-PAA was also achieved by non-covalent attachment of the biotinylated polymers to wild-type streptavidin. Conjugates of wild-type streptavidin with biotinylated PNIPAAm-b-PAA were found to remain dissolved at temperatures above LCST even at very low pH values, which was in contrast to the observed precipitation of the unconjugated block copolymer at pH <= 4.5. Conjugates of wild-type streptavidin with biotinylated PNIPAAm of different molecular weights formed aggregates in aqueous solutions above LCST and a dependence of aggregate size on the size of the polymer was found

Untersuchungen zur Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPRR (2003)

Jan Eickhoff

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Funktion der PTPRR in der zellulären Signaltransduktion mit den Schwerpunkten Substrate, Regulation und Beteiligung an biologischen Prozessen. Von besonderem Interesse war die Rolle der PTPRR bei der Tumorentstehung und Transformation von Zellen. Dabei wurden noch unveröffentlichte Daten bestätigt, daß PTPRR die MAPKn ERK1 und 2 über ein neuartiges MAPK-Bindungsmotiv, das KIM, sowohl in vitro als auch in vivo binden und dephosphorylieren kann. Somit ist PTPRR die erste tyrosinspezifische Phosphatase, der eine Dephosphorylierung von MAPKn in höheren Eukaryonten nachgewiesen wurde. Eine weitere Analyse durch transiente Überexpression der PTPRR in HEK293-Zellen ergab, daß PTPRR spezifisch die MAPKn ERK1/2, nicht jedoch p38 Kinase oder JNK/SAPK dephosphoryliert. Zudem wurde über Transkriptionsaktivierungs-experimente der Nachweis erbracht, daß PTPRR die ERK1/2-vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren negativ beeinflussen kann. Bei der näheren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK1/2 wurde eine vorher unbekannte Verknüpfung des PKA mit dem ERK-Signalweg aufgedeckt. Es wurde gezeigt, daß PKA den im KIM gelegenen Serinrest in der Position 321 der Aminosäuresequenz der PTPRR phosphorylieren und so die Bindung und Dephosphorylierung der ERK1/2 in vivo inhibieren kann. Dies weist auf einen neuartigen Mechanismus hin, über den PKA die Aktivierung des MAPK-Signalwegs reguliert. Ein weiterer Effekt, der nachgewiesen wurde, ist die Inhibition der c-Src-induzierten Phosphorylierung des KIF1C, welcher am retrograden Transport vom Golgi-Apparat zum Endoplasmatischen Retikulium beteiligt ist. Damit wurde PTPRR als erste PTPase mit einer Dephosphorylierung des KIF1C in Verbindung gebracht. Über in vitro-Assoziation mit GST-PTPRR im präparativen Maßstab mit anschließender Sequenzierung der gebundenen Proteine wurden die Hitzeschockproteine HSP70 und GRP78 als in vitro Bindungspartner der PTPRR identifiziert. Die nähere Untersuchung der Bindung ergab, daß diese innerhalb der Juxtamenbrandomäne der PTPRR erfolgt und von ATP abhängig ist. Diese Art der Bindung ist ein Anzeichen dafür, daß die Wechselwirkung spezifisch und PTPRR ein Substrat der Chaperone HSP70 und GRP78 ist, welche für die korrekte Faltung von Proteinen sorgen. Da HSP70 ebenfalls mit anderen Mitgliedern des ERK-Signalwegs wechselwirken kann und zudem aus Komplexen mit den MAPK-Kaskade-Gerüstproteinen KSR und HSP90 isoliert wurde, ergibt sich aus der Assoziation von PTPRR und HSP70 die Möglichkeit einer Beteiligung an einem Multiprotein-ERK-Signalkomplex. Bei der Analyse der endogenen Proteinexpression der PTPRR wurde erstmals das Auftreten verschiedener Isoformen in humanen Zellen nachgewiesen. Über Immunfluoreszenz wurde gezeigt, daß die zytoplasmatische Isoform PTPRRcyto im gesamten Zytoplasma vorkommt, während die Isoform PTPRR TM in perinukleären Vesikeln lokalisiert ist. Ein Vergleich der Effekte verschiedener überexprimierter Isoformen zeigte Unterschiede sowohl bei der PDGF-induzierten Phosphorylierung der ERK1/2 als auch bei der c-Src-vermittelten Phosphorylierung des KIF1C. Zudem wurden in Transkriptionsaktivierungsexperimenten Unterschiede in der ERK1/2-vermittelten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren detektiert. In allen Fällen hatte die zytoplasmatische Isoform die stärkste inhibitorische Wirkung. Ferner wurde in stabil mit PTPRR transfizierten NIH3T3-Zellen der Effekt dieser PTPase auf biologische Prozesse untersucht. Dabei wurde ein negativer Einfluß der Überexpression der PTPRR auf die basale und PDGF-induzierte Proliferation sowie auf die Migration der Zellen beobachtet, welche beide an der Tumorentstehung beteiligt sein können. Die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK für diese Effekte wurde dadurch belegt, daß eine Mutante der PTPRR, die ERK1/2 nicht mehr bindet, in beiden Experimenten keine Wirkung zeigte. Außerdem konnte die Überexpression der PTPRR sowie der verwandten PTPase STEP die durch die Onkogene v-Ki-Ras- und Her2-, nicht jedoch die durch v-ErbB- oder v-Fms-induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen in Focusbildungs-experimenten verhindern. Zudem reduzierte die Überexpression der PTPRR die Her2-vermittelte Proliferation von Zellen unter Entzug von Wachstumsfaktoren. Diese Daten liefern nicht nur Hinweise auf eine potentiell tumorsupprimierende Wirkung der PTPRR und STEP, sondern gewähren auch Einblicke in die von den Onkogenen ausgehenden Signalwege, die zur Transformation von Zellen führen. Auch wurde nachgewiesen, daß der Expressionslevel der PTPRR in Tumorzellinien und –geweben im Vergleich zu nichttransformierten Zellinien und Geweben erhöht ist. Es ergeben sich erste Hinweise auf einen Rückkopplungsmechanismus, mit dem Zellen versuchen könnten, die durch Onkogene häufig hyperaktivierten ERKn negativ zu regulieren.

In vitro-Evolution und Analyse der biophysikalischen Grundlagen der Proteinstabilität (2003)

Andreas Martin

In der vorliegenden Arbeit wurde Proside, ein Selektionssystem für stabilisierte Proteine, weiterentwickelt und dafür genutzt, die molekularen Ursachen erhöhter Proteinstabilität zu analysieren. Für diese in vitro-Evolutionsexperimente diente das Kälteschockprotein Bs-CspB aus Bacillus subtilis als Modellprotein. Zusätzlich wurde das Gen-3-Protein (G3P) des Phagen fd, eine essentielle Komponente von Proside, thermodynamisch charakterisiert und sein Faltungsmechanismus aufgeklärt. Proside basiert auf phage display und verknüpft die thermodynamische Stabilität eines Proteins mit einem sehr gut selektierbaren Parameter, der Infektiosität filamentöser Phagen. Die Größe der selektierbaren Mutantenbibliotheken konnte durch Veränderungen des Phagenkonstrukts und der zu ihrer Erstellung verwendeten molekularbiologischen Methoden auf mehr als 108 Varianten gesteigert werden. Gleichzeitig wurde mit diesen Modifikationen der rekombinationsbedingte Verlust von Gastproteinsequenzen aus dem Phagengenom deutlich reduziert. Das Gen-3-Protein, in welches diese Gastproteine inseriert werden, wurde mittels Proside um mehr als 10 kJ/mol stabilisiert. Somit sind jetzt in vitro-Selektionen bei Temperaturen von bis zu 60 °C möglich, ohne dass die Stabilität der Phagenproteine selbst limitierend für die Optimierung der Gastproteine wirkt. Das Potential der so optimierten Proside-Methode konnte anhand der Selektionen stark stabilisierter Varianten von Bs-Csp gezeigt werden. Dieses Protein unterscheidet sich von seinem um 15,8 kJ/mol stabileren Homologen Bc-Csp aus dem thermophilen Bacillus caldolyticus in 12 von 67 Resten, die alle an der Oberfläche des Proteins liegen. Die in vitro-Selektionen nach Sättigungsmutagenese an sechs dieser zwölf Positionen in Bs-CspB lieferten eine Vielzahl von stabilisierten Mutanten, die, abhängig von den Selektionsbedingungen, unterschiedliche Stabilisierungsprinzipien aufzeigten. Während bei der Selektion in Gegenwart des ionischen Denaturierungsmittels GdmCl vor allem die hydrophoben Wechselwirkungen verbessert wurden, führte die Selektion bei erhöhter Temperatur zusätzlich zur Optimierung der Coulomb´schen Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche. Für die stabilste der selektierten Varianten von Bs-CspB ist der Mittelpunkt des thermischen Entfaltungsübergangs um mehr als 28 Grad relativ zum Wildtypprotein angehoben und liegt damit auch deutlich höher als der Wert des thermostabilen Referenzproteins Bc-Csp. Die Variante unterscheidet sich von Bc-Csp an allen sechs randomisierten Positionen. Dennoch nutzen die beiden Proteine ähnliche Strategien für eine hohe Thermostabilität, insbesondere zeichnen sie sich durch eine im Vergleich zu Bs-CspB optimierte Verteilung der Oberflächenladungen aus. Ladungsnetzwerke auf der Proteinoberfläche sind für die Thermostabilität der Kälteschockproteine sehr wichtig. Basierend auf diesen Erkenntnissen war es möglich, ein hyperstabiles Kälteschockprotein mit lediglich vier Austauschen relativ zu Bs-CspB zu konstruieren. Der Schmelzpunkt dieser Variante liegt bei 85,6 °C, d.h. 31,6 Grad über dem des Wildtypproteins. Sie ist damit sogar stabiler als das homologe Csp aus dem hyperthermophilen Organismus Thermotoga maritima. Die Stabilitätsuntersuchungen des für die Phageninfektion essentiellen N-terminalen Fragments des Gen-3-Proteins reflektieren dessen Aufbau aus den beiden Domänen N1 und N2. Während die Stabilität der Domäne N1 unabhängig von Domäne N2 ist, wird Domäne N2 wesentlich durch die Interdomänenwechselwirkungen mit N1 stabilisiert, und ihre Entfaltung ist mit der Domänendissoziation gekoppelt. Die vier mittels Proside gefundenen Mutationen in G3P stabilisieren beide Domänen unabhängig voneinander und verdeutlichen die generellen Prinzipien, die der Stabilität von Zweidomänenproteinen zugrunde liegen. Neben der Erhöhung der intrinsischen Stabilitäten der individuellen Domänen spielt die Verbesserung der Domäneninteraktionen eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung des gesamten Proteins. Die Rückfaltung von G3P ist ein sequentieller Prozess. Domäne N1 faltet innerhalb weniger Millisekunden, gefolgt von der Faltung der N2-Domäne, die nach etwa 3 min abgeschlossen ist. Im letzten Schritt assoziieren die beiden Domänen in einer extrem langsamen Reaktion. Sie zeigt eine Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) und ist in ihrer Rate limitiert durch die trans-cis-Isomerisierung an Pro213 in der Gelenksubdomäne von N2. Durch die Assoziation von N1 und N2 werden beide Domänen in ihrer Entfaltung gekoppelt, so dass Domäne N1 bis zu 150.000-fach langsamer entfaltet als in isolierter Form. Die Prolin-limitierte sehr langsame Domänenassoziation ist möglicherweise für die Funktion des G3P bei der Infektion von E. coli von Bedeutung. Sie erlaubt es, die Domänen nach Bindung an den F-Pilus so lange dissoziiert zu halten, bis der Pilus zurückgezogen ist und Domäne N1 mit dem Corezeptor TolA an der Zelloberfläche wechselwirken kann.

Synthese und Charakterisierung von ternären Halogeniden und Oxidhalogeniden der Übergangsmetalle (2003)

Sabina Hartwig

Hauptziel dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung neuer Enneahalogenodimetallate der Übergangsmetalle Titan, Vanadium und Chrom. Mit Hilfe der so erhaltenen Daten war es möglich, Untersuchungen an Systemen mit repulsiven Metall-Metall-Wechselwirkungen durchzuführen und diese mit Systemen mit attraktiven Wechselwirkungen zu vergleichen. Dabei konnten mit Cs3Ti2I9, Cs3V2I9 und Rb3Cr2I9 drei neue A3M2X9-Verbindungen in einkristalliner Form dargestellt und mittels Röntgen-strukturanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, von acht weiteren A3M2X9-Verbindungen mit A = K, Rb, Cs, M = Ti, V, Cr und X = Cl, Br, I für die Röntgenstrukturanalyse geeignete Einkristalle zu züchten. Damit konnte der zur Verfügung stehende Datensatz exakter struktureller Parameter im Bereich der Systeme mit repulsiven Metall-Metall-Wechselwirkungen an wichtigen Stellen ergänzt werden. Mit Hilfe dieser Daten wurden, Tendenzen und Gesetzmäßigkeiten bezüglich der Geometrie der Doppeloktaedereinheit innerhalb der Gruppen mit bindenden bzw. nichtbindenden Metall-Metall-Wechselwirkungen herausgearbeitet. Im zweiten Schritt wurden diese miteinander verglichen und prinzipielle bzw. graduelle Unterschiede aufgezeigt. Zunächst konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der geometrischen Parameter des M2X9-Doppeloktaeders Systeme mit bindenden und nichtbindenden Metall-Metall-Wechselwirkungen qualitativ unterschieden werden können. Dazu eignen sich in erster Linie der Winkel beta (M-Xb-M) und der Wert für d´/d´´, während die Aussagekraft des Winkels alpha aufgrund der nur sehr geringen Unterschiede zwischen bindenden und nichtbindenden Verbindungen gering bleibt. Der Nachteil bei Verwendung dieser Parameter besteht allerdings darin, dass sie eine Abhängigkeit von der die Übergangsmetallatome umgebenden Matrix zeigen. Mit der Einführung der Parameter k1 (Verhältnis des mittleren M-X-Abstandes zum M-M-Abstand), k2 (Verhältnis M-Xt / M-Xb), k3 (Verhältnis Xb-Xb / Xt-Xt) und k4 (Verhältnis Höhe des Doppeloktaeders zum mittleren X-X-Abstand) wurden, die Metall-Metall-Wechselwirkungen halogen- bzw. alkalimetallunabhängig betrachtet. Quantitative Aussagen lässt allerdings nur k3 zu, mit dem zumindest in bindenden Systemen, die Stärke der Metall-Metall-Wechselwirkung abgeschätzt werden kann, während die k3-Werte bei den nichtbindenden Enneahalogenodimetallaten sehr eng zusammen liegen und eine Quantifizierung nicht sinnvoll ist. Die Parameter k1, k2 und k4 liefern „halbquantitative“ Trends, die eine Unterscheidung bindend / nichtbindend ermöglichen. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass quantitative Aussagen über die Stärke von Metall-Metall-Bindungen allein anhand dieser geometrischen Betrachtungsweise nur sehr bedingt möglich sind, während eine qualitative Unterscheidung sehr zuverlässig ist. Zur weiteren Charakterisierung der synthetisierten Enneahalogenodimetallate wurden zunächst phasenreine Proben dargestellt und IR-, Raman- sowie UV-Vis-spektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Spektren wurden durch Vergleich mit der Literatur bzw. anhand von theoretischen Berechnungen ausgewertet und den IR- bzw. Raman-Banden die entsprechenden Schwingungen sowie den UV-Vis-Banden die zugehörigen elektronischen Absorptionen zugeordnet werden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von Übergangsmetalloxidhalogeniden. Dabei wurden mit NbO2I und NbOI3 zwei neue ternäre und mit KWOI4 bzw. RbWOI4 zwei neue quarternäre Verbindungen in einkristalliner Form dargestellt und röntgenographisch charakterisiert. NbO2I kristallisiert in einem völlig neuen Strukturtyp. Dieser lässt sich nahtlos in die Struktursystematik der Oxidhalogenide einreihen. Dabei liegen Schichten vor, in denen Oktaeder über Spitzen zu Ketten und diese über Kanten zu Schichten verknüpft sind. Jeweils zwei dieser Schichten sind wiederum um eine halbe Kantenlänge gegeneinander verschoben und bilden so isolierte Doppelschichten, in denen eine Kante jedes Oktaeders durch ein Sauerstoffatom der Nachbarschicht überkappt ist Das Niob besitzt dabei die ungewöhnliche Koordinationszahl sieben. Im neuen Strukturtyp des NbOI3 stellen, wie auch im NbOCl3-Typ, Doppelstränge aus über Sauerstoffatomen verknüpften Nb2O4I6-Doppeloktaedern das strukturbestimmende Motiv dar. Die Doppelstränge liegen im NbOI3 jedoch parallel nebeneinander, während sie im NbOCl3 abwechselnd um 90° gegeneinander verdreht sind. Die Struktur der beiden isotypen quarternären Oxidiodide KWOI4 und RbWOI4 kann als eine Verzerrungs- und Auffüllungsvariante des WOCl4-Typs angesehen werden, bei der in den Ketten aus spitzenverknüpften WO2I4-Oktaedern jeweils aufeinanderfolgende Oktaeder um 45° gegeneinander verdreht sind. Die Alkalimetalle sitzen in Lücken zwischen den Ketten.

Phase Behavior and Structural Transitions in The Mixtures of Cationic Surfactants and Hydrophobic Counterions (2003)

Rami Abdel-Rahem

Anionic hydrophobic counterions with certain geometry adsorb onto the surface of cationic surfactant micelles and they minimize the repulsion between the headgroups, so the charge density on the surface is reduced. As a result of this, the micelle spontaneously changes its morphology due to a new packing for the head groups. The adsorption of 2-hydroxy-1-naphthoic acid 2,1 HNC and 6-hydroxy-2-naphthoic acid 6,2 HNC onto the surface of the cationic surfactant cetyltrimethylammonium hydroxide was studied. The results were compared to the published system 3-hydroxy-2-naphthoic acid 3,2 HNC/CTAOH. When an increasing amount of 2,1 HNC is introduced into a micellar solution of 100 mM CTAOH, one finds low viscous micellar solution, viscoelastic gel (consisting of rod like micelles), turbid region (two phase region), and viscoelastic liquid crystalline gel (consisting of multilamellar vesicles MLV with yield value). The complex viscosity (0.01 Hz) of 100 mM CTAOH rises by six orders of magnitude as the rodlike micelles form.It decreases then to the turbid region, and then rises again approximately six orders of magnitude. The second rising of the complex viscosity is accompained by the formation of a liquid crystalline phase which consists of multilamellar vesicles. This has been proven by DICM, FF-TEM and Cryo-TEM. The vesicles were polydisperse and ranged from 100 to 1000 nm in diameter. SANS detected the transition in the microstructure which was caused by changing the concentration of 2,1 HNC in the system. SANS calculations show results similar to that obtained by microscopic methods. Surprising rheological behavior was measured in the rodlike micelle region, at which storage modulus was about one order of magnitude higher than loss modulus and both were parallel in the frequency range 0.001-10 Hz. Such behavior usually indicates the presence of vesicles in the liquid crystal phases. It was proved that other rheological measurements can be used to distinguish the tow types, namely, amplitude sweep measurements, first normal stress difference N1 (Weissenbeg effect), the effect of adding electrolyte, and stress relaxation curves. When 6,2 HNC (new substitution of HNC) is added with an increasing amount to 100 mM CTAOH, a new phase behavior is observed. Here the structure changes from small micelle aggregates into rodlike micelles, and then a two phase region consisting of L1-phase and un-reacted 6,2 HNC is formed. No transition into MLV has been detected. In the case of 3,2 HNC and 2,1 HNC, the hydroxyl and the carboxyl group are neighboring, so they can effectively share in reducing the repulsion between the headgroups while the rings are in interaction with hydrocarbon tails. For 6,2 HNC the hydroxyl group is in position number 6 on the aromatic rings, which means that hydroxyl group is distant from the carboxyl group, thereby, less screening for the cationic charge in the micelle surface is obtained. Substitution of HNC plays a main role in controlling the microstructure and other physical properties such viscosity, Krafft point, ..etc. In the second part of this work, the hydrophobic counterion is fixed (2,1 HNC), and the length of the cationic surfactant‘s chain is changed from C16 into C14, C12, C10 and C8. For the system 2,1 HNC/ tetradecyltrimethylammonium hydroxide TTAOH similar phase behavior as 2,1 HNC/CTAOH is observed. At 2,1 HNC/TTAOH ratio r aproximately 1, formation of MLV is observed. After the neutralization addition of excess amount of 2,1 HNC is possible since the insoluble molecular form of 2,1 HNC becomes solublized in the formed MLV. Conductivity measurements prove that 2,1 HNC stays in the molecular form after the neutralization. A difference in the rheological behavior of the system 2,1 HNC/TTAOH compared to 2,1 HNC/CTAOH is seen. In the rodlike micelles region of 2,1 HNC/TTAOH, the solutions exhibit a short relaxation time compared to 2,1 HNC/CTAOH system. FF-TEM and SANS proved the formation of polydisperse MLV in this system with a maximum diameter of about 2000 nm and wall thickens of about 28 nm. As a result of this work, it is concluded that the role of the hydrophobic counterions with certain geometry could be looked upon as a co-surfactant with a shorter chain length which changes the bending rigidity, of the bilayer. They are surface active species that bind strongly on the micelle surface and change the packing parameter of the headgroups. It is suggested that the hydrophobicity of the counterion plays an important role in deciding the structure of the supramolecular assemblies such as vesicles, or micelles. As a consequence one can change the morphology of micelle species by changing the ratio of counterion /surfactant ion. These studies also suggest that by mixing cationic surfactant and hydrophobic counterion with varying cationic surfactants chain lengths, one can have a control over the supramolecular structures formed.

Kinetik der Vesikelbildung in katanionischen Tensidsystemen (2003)

Stefan Schmölzer

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Untersuchung der Kinetik der Vesikel-bildung in katanionischen Tensidsystemen. Ein wesentlicher Aspekt dabei war der Vergleich von einfachen Mischungen von anionischen mit kationischen Tensiden, bei welchen die Tenside als Salze vorlagen, mit katanionischen Amphiphilen, bei welchen als Gegenionen Protonen und OH- Ionen vorlagen. Zur allgemeinen Beschreibung der katanionischen Tensidmischungen kann das Pseudophasenseparationsmodell verwendet werden. Bei diesem Modell wird der Wechselwirkungsparameter eingeführt, da es sich bei den katanionischen Tensidmischungen nicht um ideale Mischungen handelt. Aufgrund der entgegengesetzten Ladung der einzelnen Spezies ergibt sich zwangsläufig ein starker Synergieeffekt. Aus experimentellen Daten konnte nun der Wechselwirkungsparameter für die Systeme TTAB/SL und TTAB/SC bestimmt werden, welche in gutem Einklang mit den Literaturwerten vergleichbarer katanionischer Systeme stehen. Dieser starke Synergieeffekt spiegelt sich nun in dem reichen Phasenverhalten der katanionischen Tensidmischungen wider. In dieser Arbeit wurden eine Vielzahl von katanionischen Systemen untersucht. Bei den Mischungen der Alkyltrimethylammonium-bromide mit den Natriumsalzen der Laurin- bzw. Caprinsäure zeigte sich bei konstanter Gesamtkonzentration immer ein identischer Phasenverlauf. Ausgehend von einer mizellaren Lösung, z. B. der anionischen Komponente, gelangt man bei Erhöhung des Anteils an kationischem Tensid über ein Zweiphasengebiet in die vesikuläre Phase im Bereich der Äquimolarität. In diesen salzhaltigen Systemen kommt es fast immer bei exakt äquimolarer Zusammensetzung bei Raumtemperatur zur Präzipitatbildung. Unterschiede in der absoluten Lage der Phasengrenzen sind bei unterschiedlicher Kettenlänge der Tenside festzustellen, dabei kann auch die Präzipitatbildung bei Raumtemperatur unterdrückt werden. In den salzfreien Systemen ist die Ladung der Vesikel nicht abgeschirmt und es kommt nicht zur Kondensation der Vesikelphase. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich nun mit der Untersuchung der Kinetik der Vesikelbildung der beschriebenen katanionischen Systeme. Diese wurde mit Hilfe von Stopped Flow Messungen mit unterschiedlichen Detektionsmethoden verfolgt. Es konnte festgestellt werden, dass es sich bei der Vesikelbildung um einen mehrstufigen Prozess handelt. Bei den salzhaltigen Mischungen zeigte sich, dass die Bildungsgeschwindigkeit der Vesikel stark abhängig von der Gesamtkonzentration ist und bei hoher Konzentration (> 100 mM) mitunter schon an der Auflösungsgrenze der Stopped Flow Methode liegt. Die Bildung von Mischmizellen als Vorstufen zu den Vesikeln konnte nicht explizit nachgewiesen werden. Die Aufladung, durch unterschiedliches Mischungsverhältnis von anionischem zu kationischem Tensid, zeigt keinen Einfluß auf die eigentliche Bildungsgeschwindigkeit der Vesikel. Im Zuge von Stopped Flow Messungen mit Detektion der Transmission wurde festgestellt, dass es im weiteren zeitlichen Verlauf zu einem Größenwachstum der Vesikel und zur Abnahme der Polydispersität kommt. Darüber hinaus ist bei den äquimolaren Mischungen schon die Tendenz zur Präzipitatbildung nach mehreren Minuten zu verzeichnen. Die makroskopische Auftrennung der Phasen bis zum Erreichen des thermodynamisch stabilen Endzustandes kann hier jedoch mehrere Stunden dauern. Der Einfluß der Temperatur auf die Kinetik der Vesikelbildung konnte am System TTAB/SC nachgewiesen werden. Solange man sich bei Temperaturänderung in der gleichen Phase befindet, so ändern sich die Zeitkonstanten allgemein nach der Arrhenius´schen Gleichung. Ist jedoch mit der Temperatur ein Phasenübergang innerhalb der Vesikelphase verbunden, so zeigt auch die Kinetik dementsprechend einen Knickpunkt im Verlauf der Zeitkonstanten mit der Temperatur. Im Vergleich zu den salzhaltigen Systemen wurden auch die katanionischen Ionenpaar Amphiphile hinsichtlich der Bildungskinetik der Vesikel untersucht. Mit Hilfe von zeitaufgelösten SAXS Messungen konnte an diesen Systemen eindeutig das Vorhandensein von Mischmizellen zu Beginn der Vesikelbildung nachgewiesen werden. Diese Misch-mizellen, welche einen schalen- oder scheibchenförmigen Charakter haben, lagern sich innerhalb von 500 ms in einem weitaus langsameren Prozess zu unilamellaren Vesikeln um. Diese wachsen mit einer Zeitkonstanten von 20 – 30 s an, wobei die Größenverteilung monodisperser wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, daß die Vesikelbildung nicht nur auf das Vorhandensein von Scherkräften zurückzuführen ist, sondern es durchaus in bestimmten Systemen sich bei der Bildung von Vesikeln um einen reinen Selbstaggregations-prozess handelt. Der kinetische Ablauf der Vesikelbildung wird dabei zu einem stark durch die Elektrostatik des Systems gesteuert. Zum anderen spielt der letztlich stabile Endzustand des Systems eine wesentliche Rolle für den zeitlichen Verlauf der Phasenbildung.

Strukturbestimmung des humanen Guanylin-Prohormons zur Analyse der Rolle einer Hormon-Prosequenz und Design eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne der Guanylatzyklase-C (2003)

Thomas Lauber

Die Peptidhormone Guanylin und Uroguanylin sind als spezifische Liganden der intestinalen membrangebundenen Guanylatzyklase-C (GC-C) entscheidend an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushalts im Darm beteiligt. Obwohl die Rolle dieses Guanylin/GC-C Systems bei der durch die hitzestabilen bakteriellen Enterotoxine vermittelten Diarrhöe schon lange bekannt ist, kennt man bis heute keine strukturellen Details der Vorläuferproteine der GC-C-Liganden, der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne der GC-C (GC-CECD) und der Liganden/Rezeptor-Wechselwirkung. Um zum Verständnis der biochemischen Eigenschaften des Guanylin-Prohormons beizutragen sowie den Einfluß der Prosequenz auf die Ausbildung der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Disulfidbrücken zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur von humanem Proguanylin bestimmt. Weiterhin wurde als Grundlage für weiterführende NMR-spektroskopische Untersuchungen der Guanylin/GC-C-Wechselwirkung ein geeignetes Fragment der GC-CECD konstruiert. Um die Strukturbestimmung von Proguanylin zu ermöglichen, wurde zunächst ein effizientes Expressions- und Reinigungsprotokoll entwickelt, das es erlaubte, Proguanylin mit der nativen Disulfidverbrückung und natürlichen biologischen Aktivität in löslicher Form zu gewinnen. Durch den Vergleich mit dem natürlichen, aus menschlichem Hämofiltrat isolierten Prohormon wurden für beide Proteine übereinstimmende biophysikalische Eigenschaften und dreidimensionale Strukturen nachgewiesen. Des Weiteren wurde mittels analytischer Sedimentationsexperimente für beide Proteine eindeutig ein monomerer Assoziationsgrad in Lösung auch bei millimolaren Konzentrationen nachgewiesen und dadurch ein früher postulierter dimerer Zustand widerlegt. Die anschließende Berechnung der dreidimensionalen Struktur von Proguanylin erfolgte durch die Verwendung von 700 aus den NMR Spektren des homogen 15N und 13C/15N markierten rekombinanten sowie des natürlichen Proteins abgeleiteten experimentellen Randbedingungen. Die Struktur von Proguanylin in Lösung stellt einen neuen Proteinfaltungstyp dar und weist drei zu einem Bündel zusammengelagerte alpha-Helices, ein kurzes, dreisträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt sowie einen 23 Aminosäuren umfassenden unstrukturierten Bereich auf. Da das Faltblatt durch zwei N-terminale und einen C-terminalen Strang gebildet wird, kommt es zu einer unmittelbaren Nachbarschaft der Termini. Dabei wird die Hormonregion (Reste 80-94) von Proguanylin unter anderem durch die Wechselwirkungen mit dem N-terminalen Faltblattstrang in einer Guanylin A-Isomer ähnlichen Topologie stabilisiert. Diese Kontakte bewirken außerdem eine teilweise Abschirmung der ansonsten im freien Hormon zugänglichen Oberfläche und können daher die äußerst geringe Affinität bezüglich der GC-C und die damit verbundene vernachlässigbare Aktivität von Proguanylin erklären. Eine beobachtete Wechselwirkung zwischen der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Seitenkette von Tyr88 mit Arg72 leistet einen zusätzlichen Beitrag zur Inaktivierung der Hormonregion. Die Wechselwirkungen zwischen den terminalen Bereichen in der Proguanylin-Struktur scheinen außerdem für die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung essentiell zu sein. Eine Bestätigung dieser Annahmen wurde aus der Analyse von Proguanylin-Mutanten erhalten, die eine strukturstabilisierende Funktion der Disulfidbrücke C48-C61 nahelegt und für einen direkten Einfluß der Prosequenz auf die Struktur der Hormonregion spricht. Basierend auf einer weiteren Mutante konnte außerdem für das homologe Uroguanylin-Prohormon ein Strukturmodell erstellt werden. Für die GC-CECD wurde ein Strukturmodell erstellt, mit dessen Hilfe die Ligandenbindungsregion auf die direkte Umgebung eines exponierten und zugänglichen Faltblattstrangs kartiert werden konnte. Daher wurde für die Wechselwirkung zwischen Guanylin und der GC-CECD ein zu den intramolekularen Kontakten zwischen Guanylin und der Prosequenz ähnliches Interaktionsmotiv postuliert. Aufgrund der Größe und des Oligomerzustandes ist die GC-CECD nicht für NMR-spektroskopische Untersuchungen zur detaillierten Charakterisierung der Wechselwirkung dieses Rezeptors mit seinen Liganden geeignet. Daher wurde ein kleineres, lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung fähiges Rezeptorfragment benötigt, das in Form der als miniGC-C bezeichneten membrannahen Subdomäne der GC-CECD konstruiert wurde. Dieses Fragment erfüllt die gewünschten Anforderungen und ist zur hoch affinen Bindung des Liganden STp-(5-17) in der Lage. Zur Untersuchung des zugehörigen Komplexes stellt das entwickelte Expressions- und Reinigungssystem zur Gewinnung von rekombinantem Proguanylin gleichzeitig die Grundlage für die Herstellung von homogen 15N und 13C/15N markiertem Guanylin dar, welches für zukünftige NMR-spektroskopische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Guanylin und der GC-C benötigt wird.

Molekulare Grundlagen der Erdnussallergie: Rekombinante Darstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung und Struktur der Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6 (2003)

Katrin Lehmann

Die Erdnussallergie stellt auf Grund ihrer Verbreitung und der Stärke der ausgelösten Reaktionen ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Der derzeit einzige Schutz vor den typischen Symptomen besteht in einem absoluten Verzicht auf erdnusshaltige Lebensmittel. Folglich stellt die Charakterisierung von Erdnussallergenen eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Ansätzen dar. Als Grundlage für biochemische und biophysikalische Studien wurde eine rekombinante Expressionsstrategie zur Herstellung von authentisch gefaltetem Ara h 2 und Ara h 6 in dieser Arbeit entwickelt. Die Strategie zur effizienten Präparation großer Mengen Protein basiert auf der Anwendung spezieller E. coli Stämme mit oxidativem Cytoplasma und eignet sich zur Expression nativ gefalteter und disulfidverbrückter rekombinanter Erdnussallergene vom 2S Albumintyp und mit hoher Wahrscheinlichkeit weiterer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die Integrität der Sekundär- und Tertiärstruktur, der Disulfidverbrückung und der immunologischen Reaktivität der rekombinanten Proteine wurde am Beispiel von Ara h 2 mit Hilfe von natürlichem Protein aus der Erdnuss verifiziert. Die Verfügbarkeit von authentischen rekombinanten Erdnussallergenen eröffnet neue Möglichkeiten für eine verfeinerte Diagnose allergischer Erkrankungen und für die Entwicklung von spezifischen Immuntherapien. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass sich die Allergene Ara h 2 und Ara h 6 durch eine außerordentliche Stabilität gegenüber thermaler Denaturierung und proteolytischem Abbau auszeichnen. Durch CD spektroskopische Studien wurde eine Disulfidbrücken abhängige Stabilität der Sekundärstruktur bis 373 K nachgewiesen. Die Resistenz gegenüber Verdauungsreaktionen wurde an Hand der Enzyme Trypsin und Chymotrypsin untersucht. Der proteolytische Verdau von Ara h 2 und Ara h 6 resultierte in der Ausbildung heterodimerer immunologisch aktiver Produkte. Der proteolytische Angriff erfolgt innerhalb zweier definierter Bereiche. Die resistenten Kernbereiche der Proteine beinhalten eine Reihe von vor Proteolyse geschützten Schnittstellen. Die Faltungen der unverdauten Proteine und der proteaseresistenten Kernbereiche sind nahezu identisch. Die proteaselabilen Bereiche weisen keine reguläre Sekundärstruktur auf und sind von einer signifikanten Flexibilität geprägt. Die für die Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6 nachgewiesene Stabilität stellt ein wichtiges Merkmal der Lebensmittelallergene dar. Je länger ein möglichst großer Proteinabschnitt intakt bleibt, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Immunantwort ausgelöst werden kann und umso stärker wird diese ausfallen. In der vorliegenden Arbeit konnte die Lösungsstruktur des proteaseresistenten Ara h 6-Kerns bestimmt und charakterisiert werden. Die resultierende Struktur besteht aus fünf alpha-Helices, die einen vor enzymatischer Spaltung geschützten kompakten Kernbereich ausbilden. Die ermittelte Struktur stellt die erste experimentell bestimmte dreidimensionale Struktur eines Erdnussallergens und die erste hochaufgelöste Struktur eines 2S Albumins dar. Die globale Faltung von Ara h 6 aus der Erdnuss ähnelt weiteren Pflanzenproteinen: den nichtspezifischen Lipidtransferproteinen, den Amylase/Trypsin-Inhibitoren und dem hydrophoben Protein aus Sojabohne. Eine wichtige Frage betrifft die Lokalisation der IgE bindenden Epitope. In früheren Studien konnten in Ara h 6 keine linearen IgE reaktiven Epitope identifiziert werden, für Ara h 2 wurden hingegen drei immunodominante Regionen beschrieben. Um die Frage nach der Lokalisation dieser Epitope innerhalb der dreidimensionalen Struktur von Ara h 2 zu klären, wurde ein molekulares Modell des Proteins auf der Basis der experimentell gelösten Ara h 6 Struktur erstellt. Sämtliche Epitope befinden sich in einem ausgedehnten Schleifenbereich und am aminoterminalen Ende des Proteins. Dieser Befund weist in Kombination mit der Kenntnis, dass die Multivalenz eines Allergens eine Voraussetzung für das Auslösen einer allergischen Antwort darstellt und mit ihrer Intensität korreliert, stark auf die Existenz von konformationellen Epitopen in Ara h 6 und Ara h 2 hin. Die Präsentation von stabilen konformationellen Epitopen auf Mastzellen führt im Allgemeinen zu einer effizienteren und stärkeren Mediatorausschüttung. Dies ist mit den beobachteten starken klinischen Symptomen bei Patienten mit Erdnussallergie konsistent. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Stabilität und Kompaktheit der Struktur sowie das potentielle Vorhandensein von konformationellen Epitopen eine Erklärung für die extreme Allergenizität der Erdnussallergene liefern kann. Die Identifizierung von IgE-bindenden Epitopen auf der Basis der dreidimensionalen Struktur der Erdnussallergene liefert eine Grundlage für die Entwicklung von veränderten Proteinen mit reduzierter Allergenizität, dem Verständnis von Kreuzallergien und der Entwicklung neuer Therapieformen.

Strukturbestimmung von Birkenpollenallergenen und birkenpollenassoziierten Nahrungsmittelallergenen mit NMR-Spektroskopie (2003)

Philipp Neudecker

Das 17,4kDa schwere Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 ist bei mehr als 90% der Birkenpollenallergiker für die Bindung der IgE-Antikörper verantwortlich, und IgE-Kreuzreaktionen mit verwandten Proteinen wie Pru av 1 (früher Pru a 1) aus Kirschen, Gly m 4 (ursprünglich SAM22) aus Sojabohnen und Api g 1 aus Sellerie verursachen bei bis zu 70% dieser Patienten allergische Reaktionen auf Nüsse, Obst oder Gemüse. Die molekulare Grundlage für die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Pru av 1 stellt die fast vollständige Identität ihrer Tertiärstrukturen dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten NMR-spektroskopischen Untersuchungen erbrachten den experimentellen Nachweis, dass der ungewöhnlich große hydrophobe Hohlraum im Innern von Pru av 1 mit Steroiden wechselwirkt. Modellierungen zeigten, dass der Hohlraum groß genug für zwei Steroidmoleküle ist, und erlaubten die Vorhersage der Komplexstruktur. Die Konformation des Proteinrückgrats von Pru av 1 wt ist in der hochaufgelösten dreidimensionalen Struktur der weniger IgE-reaktiven Mutante Pru av 1 E45W in Lösung konserviert, was zeigt, dass die Seitenkette von Glu45 an einem kreuzreaktiven IgE-Epitop beteiligt ist. Dementsprechend wurde die IgE-Bindung an Api g 1.0101 durch die Mutation K44E erhöht. Der fast vollständige Verlust der IgE-Bindung an Pru av 1 S112P ist die Folge einer Zerstörung der Tertiärstruktur. Weder die Mutation S112A noch die Deletion der COOH-terminalen Reste 155-159 beeinflusste die IgE-Bindung an Pru av 1. Die P-Schleife um Glu45 erklärt somit teilweise das klinisch beobachtete IgE-Kreuzreaktionsmuster und ortsgerichtete Mutagenese von Glu45 stellt einen Ansatz zur Entwicklung hypoallergener Varianten für die spezifische Immuntherapie dar. Als Ausgangspunkt zur Schließung der strukturellen Lücke zwischen der konstitutiv exprimierten Bet v 1-Familie von Allergenen und der verwandten stressinduzierten PR-10-Familie von mit Krankheitsbefall zusammenhängenden Proteinen wurde der Großteil der 1H-, 13C- und 15N-Resonanzen des stressinduzierten PR-10-Proteins Gly m 4 zugeordnet und eine Reihe von NOESY-Spektren aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen, skalaren und dipolaren Kopplungskonstanten bestätigen ein auf der Grundlage von Pru av 1 und Bet v 1 erstelltes Homologiemodell, so dass die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Gly m 4 ebenfalls auf einer praktisch identischen Tertiärstruktur beruht. Zwischen 5% und 20% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 9,4kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 4, ein Ca2+-bindendes Polcalcin. Wegen der hohen IgE-Kreuzreaktivität der Polcalcine sind viele Patienten auf Pollen verschiedenster Pflanzen polysensibilisiert. Die mit mehrdimensionaler heteronuklearer NMR-Spektroskopie bestimmte hochaufgelöste dreidimensionale Struktur von holo Bet v 4 zeigt ein kanonisches EF-Hand-Paar in der offenen Konformation. Die hochkonservierte polcalcinspezifische amphipatische COOH-terminale a-Helix deckt lediglich einen Teil der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche von holo Bet v 4 ab. Anders als das Polcalcin Phl p 7 aus dem Wiesenlischgras, für das vor kurzem eine durch Domain Swapping entstandene dimere Struktur nachgewiesen wurde, zeigen die hydrodynamischen Parameter aus NMR-Relaxation, NMR-Translationsdiffusion und analytischer Ultrazentrifugation, dass sowohl apo als auch holo Bet v 4 vorwiegend monomer sind. Die geringere Dispersion der chemischen Verschiebungen und der etwas größere hydrodynamische Radius von apo Bet v 4 weisen auf eine reversible Änderung der Struktur bei Ca2+-Bindung hin, was die geringere IgE-Bindungsfähigkeit von apo Bet v 4 erklärt. Trotz ihrer unterschiedlichen Oligomerisierungszustände sind die Tertiärstrukturen von holo Bet v 4 und holo Phl p 7 bemerkenswert ähnlich, was eine zwanglose Erklärung für die IgE-Kreuzreaktivität liefert. Zusammen mit der engen strukturellen Homologie zu Calmodulin und der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche weist diese Änderung der Struktur eher auf eine regulatorische denn eine Ca2+-Speicherfunktion für Bet v 4 hin. Etwa 12% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 34,2kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 6 (früher Bet v 5), das hochgradig IgE-kreuzreaktiv mit Pyr c 5 aus Birnen ist. Die Tertiärstruktur dieser Phenylcoumarin-Benzylether-Reduktasen ist noch unbekannt. Die homonuklearen NMR-Spektren von Pyr c 5 zeigen eine ausgezeichnete Dispersion der chemischen Verschiebungen, was auf eine gemischte a/b-Sekundärstruktur hindeutet. Der Ausschluss vernachlässigbarer Terme durch Einführung eines geeigneten Grenzwerts sparte einen erheblichen Teil der durch die Verwendung des gaußförmigen Datenbank-Potentials verursachten Zunahme des Rechenzeitbedarfs der Strukturberechnung dieser Allergene ein, ohne die Qualität der resultierenden Strukturen zu beeinträchtigen. Außerdem wurden mehrere Inkonsistenzen in der Standardparametrisierung der kovalenten Geometrie des Kraftfelds beseitigt.

Chemie

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