OPUS 4 | Chemie

In vitro-Evolution und Analyse der biophysikalischen Grundlagen der Proteinstabilität (2003)

Andreas Martin

In der vorliegenden Arbeit wurde Proside, ein Selektionssystem für stabilisierte Proteine, weiterentwickelt und dafür genutzt, die molekularen Ursachen erhöhter Proteinstabilität zu analysieren. Für diese in vitro-Evolutionsexperimente diente das Kälteschockprotein Bs-CspB aus Bacillus subtilis als Modellprotein. Zusätzlich wurde das Gen-3-Protein (G3P) des Phagen fd, eine essentielle Komponente von Proside, thermodynamisch charakterisiert und sein Faltungsmechanismus aufgeklärt. Proside basiert auf phage display und verknüpft die thermodynamische Stabilität eines Proteins mit einem sehr gut selektierbaren Parameter, der Infektiosität filamentöser Phagen. Die Größe der selektierbaren Mutantenbibliotheken konnte durch Veränderungen des Phagenkonstrukts und der zu ihrer Erstellung verwendeten molekularbiologischen Methoden auf mehr als 108 Varianten gesteigert werden. Gleichzeitig wurde mit diesen Modifikationen der rekombinationsbedingte Verlust von Gastproteinsequenzen aus dem Phagengenom deutlich reduziert. Das Gen-3-Protein, in welches diese Gastproteine inseriert werden, wurde mittels Proside um mehr als 10 kJ/mol stabilisiert. Somit sind jetzt in vitro-Selektionen bei Temperaturen von bis zu 60 °C möglich, ohne dass die Stabilität der Phagenproteine selbst limitierend für die Optimierung der Gastproteine wirkt. Das Potential der so optimierten Proside-Methode konnte anhand der Selektionen stark stabilisierter Varianten von Bs-Csp gezeigt werden. Dieses Protein unterscheidet sich von seinem um 15,8 kJ/mol stabileren Homologen Bc-Csp aus dem thermophilen Bacillus caldolyticus in 12 von 67 Resten, die alle an der Oberfläche des Proteins liegen. Die in vitro-Selektionen nach Sättigungsmutagenese an sechs dieser zwölf Positionen in Bs-CspB lieferten eine Vielzahl von stabilisierten Mutanten, die, abhängig von den Selektionsbedingungen, unterschiedliche Stabilisierungsprinzipien aufzeigten. Während bei der Selektion in Gegenwart des ionischen Denaturierungsmittels GdmCl vor allem die hydrophoben Wechselwirkungen verbessert wurden, führte die Selektion bei erhöhter Temperatur zusätzlich zur Optimierung der Coulomb´schen Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche. Für die stabilste der selektierten Varianten von Bs-CspB ist der Mittelpunkt des thermischen Entfaltungsübergangs um mehr als 28 Grad relativ zum Wildtypprotein angehoben und liegt damit auch deutlich höher als der Wert des thermostabilen Referenzproteins Bc-Csp. Die Variante unterscheidet sich von Bc-Csp an allen sechs randomisierten Positionen. Dennoch nutzen die beiden Proteine ähnliche Strategien für eine hohe Thermostabilität, insbesondere zeichnen sie sich durch eine im Vergleich zu Bs-CspB optimierte Verteilung der Oberflächenladungen aus. Ladungsnetzwerke auf der Proteinoberfläche sind für die Thermostabilität der Kälteschockproteine sehr wichtig. Basierend auf diesen Erkenntnissen war es möglich, ein hyperstabiles Kälteschockprotein mit lediglich vier Austauschen relativ zu Bs-CspB zu konstruieren. Der Schmelzpunkt dieser Variante liegt bei 85,6 °C, d.h. 31,6 Grad über dem des Wildtypproteins. Sie ist damit sogar stabiler als das homologe Csp aus dem hyperthermophilen Organismus Thermotoga maritima. Die Stabilitätsuntersuchungen des für die Phageninfektion essentiellen N-terminalen Fragments des Gen-3-Proteins reflektieren dessen Aufbau aus den beiden Domänen N1 und N2. Während die Stabilität der Domäne N1 unabhängig von Domäne N2 ist, wird Domäne N2 wesentlich durch die Interdomänenwechselwirkungen mit N1 stabilisiert, und ihre Entfaltung ist mit der Domänendissoziation gekoppelt. Die vier mittels Proside gefundenen Mutationen in G3P stabilisieren beide Domänen unabhängig voneinander und verdeutlichen die generellen Prinzipien, die der Stabilität von Zweidomänenproteinen zugrunde liegen. Neben der Erhöhung der intrinsischen Stabilitäten der individuellen Domänen spielt die Verbesserung der Domäneninteraktionen eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung des gesamten Proteins. Die Rückfaltung von G3P ist ein sequentieller Prozess. Domäne N1 faltet innerhalb weniger Millisekunden, gefolgt von der Faltung der N2-Domäne, die nach etwa 3 min abgeschlossen ist. Im letzten Schritt assoziieren die beiden Domänen in einer extrem langsamen Reaktion. Sie zeigt eine Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) und ist in ihrer Rate limitiert durch die trans-cis-Isomerisierung an Pro213 in der Gelenksubdomäne von N2. Durch die Assoziation von N1 und N2 werden beide Domänen in ihrer Entfaltung gekoppelt, so dass Domäne N1 bis zu 150.000-fach langsamer entfaltet als in isolierter Form. Die Prolin-limitierte sehr langsame Domänenassoziation ist möglicherweise für die Funktion des G3P bei der Infektion von E. coli von Bedeutung. Sie erlaubt es, die Domänen nach Bindung an den F-Pilus so lange dissoziiert zu halten, bis der Pilus zurückgezogen ist und Domäne N1 mit dem Corezeptor TolA an der Zelloberfläche wechselwirken kann.

Strukturbiologische Untersuchungen und Faltungsstudien von Modellproteinen mittels NMR-Spektroskopie (2004)

Markus Wolfgang Zeeb

Die biologische Funktion von Proteinen basiert in den meisten Fällen auf einer definierten dreidimensionalen Struktur, die sich im Verlauf der Proteinfaltung ausbildet. In dieser Arbeit wurden die Modellproteine CspB aus B. subtilis, RNase T1 aus A. oryzae, ORF56 aus S. islandicus sowie des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d mit einer Reihe biophysikalischer Methoden ausführlich charakterisiert. Die schnelle interne Dynamik von CspB wurde bei verschiedenen Lösungsmittelviskositäten untersucht, wobei durch eine erweiterte Lipari-Szabo-Analyse der 15N-Relaxationsparameter die Rotationskorrelationszeit iterativ optimiert. Diese stellt einen empfindlichen Sensor gegenüber der unmittelbaren Umgebung des Proteins innerhalb der Hydratationshülle dar, wobei die Geschwindigkeit der Gesamtbewegung nicht von der Größe des Proteins inklusive seiner Hydratationshülle sondern vielmehr von deren Mikroviskosität abhängt. Die Dynamik im ps- bis ns-Bereich bleibt bei steigender Viskosität nahezu unverändert. Der Beitrag des chemischen Austauschs (Rex) zur transversalen Relaxationsrate ist über das gesamte Protein verteilt und korreliert nicht mit Sekundärstrukturelementen oder flexiblen Schleifen. Rex repräsentiert daher nicht die lokale Dynamik einzelner Reste sondern ist auf die globale Faltungsreaktion von CspB im Millisekundenbereich zurückzuführen. Durch die Erhöhung der Viskosität wird die Größe und Anzahl der Rex-Beiträge signifikant reduziert. Die Kooperativität der Millisekundenfaltung von CspB wurde anhand dynamischer NMR-Methoden untersucht, wobei die Bestimmung der Faltungsraten mit R2-Dispersionsmessungen die verlässlichsten Ergebnisse lieferte. Die 24 analysierten ortsspezifischen Sonden zeigen sehr ähnliche apparente Faltungsraten und stimmen gut mit stopped flow Fluoreszenz detektierten Faltungsraten überein. Die Faltung verläuft kooperativ und über einen wenig heterogenen Übergangszustand. Die Wechselwirkung von CspB mit einzelsträngiger DNA wurde auf struktureller Ebene charakterisiert. Die aus Sequenzvergleichen postulierte potentielle Bindungsregion von CspB wurde mittels NMR-Titrationsexperimenten verifiziert. Dabei konnten zusätzliche Aminosäuren außerhalb der Bindungsmotive identifiziert werden, die für die Interaktion sehr wichtig sind. Die Beiträge einzelner Reste zur Bindungsaffinität wurden anhand einer Mutationsanalyse bestimmt, wobei die Lösungsmittel-exponierten Phenylalanine essentiell für eine feste Bindung sind. Aus der Strukturbestimmung von CspB im Komplex mit dem ssDNA-Fragment dT7 folgte, dass das Proteinrückgrat nahezu unverändert vorliegt und die Hauptunterschiede in der relativen Orientierung der aromatischen Seitenketten liegen. Die Modellierung der Struktur des Komplexes mit HADDOCK weist auf die vermuteten Stapel-Wechselwirkungen der aromatischen Seitenketten mit den Basen der ssDNA hin. Die Bindung der Nukleinsäure stabilisiert CspB. Das homodimere Protein ORF56 aus dem acidohyperthermophilen Archaeon Sulfolobus islandicus wurde mit einer Fülle von biophysikalischen Methoden studiert und dessen dreidimensionale Struktur mittels NMR bestimmt. Diese ähnelt der des Arc-Repressor sehr. Die Faltung von ORF56 kann sowohl im Gleichgewicht als auch in der Faltungskinetik mit dem Zweizustandsmodell für dimere Proteine beschrieben werden. Das Protein besitzt eine außerordentlich hohe Stabilität, was in dem extrapolierten Schmelzpunkt der thermischen Entfaltung von 107 °C zum Ausdruck kommt. Diese extreme Stabilität wird von der schnellen simultanen Assoziations-/Faltungsreaktion aber vor allem durch die besonders langsame Entfaltungsreaktion (5.7 pro Jahr) bestimmt. Die Entwicklung höherdimensionaler Echtzeit NMR-Techniken zum Studium langsamer Faltungsreaktionen wurde mit S54G/P55N RNase T1 durchgeführt. Die geschwindigkeitsbestimmende trans/cis Isomerisierung der Y38-P39 Peptidbindung synchronisiert die kooperative Rückfaltung des Faltungsintermediats, was anhand einer Vielzahl von ortsspezifischen Sonden gezeigt wurde. Die Aufnahme von 3D Echtzeit NOESY-HSQC-Spektren ermöglichte die Zuordnung des Proteinrückgrats des Faltungsintermediats und die Identifizierung von NOE-Kreuzsignalen, die die Basis für eine zukünftige Strukturbestimmung des transienten Zustands bilden. Die Faltung des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d, der weder Trp noch Tyr enthält, wurde mit Circulardichroismus und Phenylalanin-Fluoreszenz beobachtet. Mittels dieser optischen Sonden wurde im Gleichgewicht ein apparentes Zweizustandsmodell gefunden. Allerdings wurde in einem NMR-detektierten Entfaltungsübergang ein dritter Zustand bei mittleren Harnstoffkonzentrationen detektiert. Unter stark nativen Bedingungen konnten drei Rückfaltungsphasen aufgelöst werden. Die langsamste Phase kann mit PPIasen signifikant beschleunigt werden, was auf eine Prolyl-cis/trans-Isomerisierung hindeutet, die mittels 1D Echtzeit NMR-Spektroskopie verfolgt werden konnte.

Änderungen intramolekularer Abstände bei der Faltung des Kälteschockproteins aus Bacillus caldolyticus (2004)

Christine Magg

Das kleine Kälteschockprotein Bc-Csp bildet ein beta-barrel aus fünf antiparallelen beta-Faltblattsträngen. Es faltet gemäß einem Zweizustandsmechanismus und erreicht den nativen Zustand in Abwesenheit von Denaturierungsmittel innerhalb einer Millisekunde. Um die strukturellen Veränderungen während dieser schnellen Faltungsreaktion zu untersuchen, wurden intramolekulare Abstandsänderungen mit Hilfe des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) bestimmt. Einzelne Tryptophanreste wurden als Donor und einzelne 5-(((acetylamino)ethyl)amino)-naphthalin-1-sulfonsäure-Reste (AEDANS) als Akzeptor in das Protein eingeführt. An der Oberfläche von Bc-Csp wurden vier verschiedene Donor- und vier verschiedene Akzeptorpositionen ausgewählt. Diese Positionen wurden zu neun einzelnen Donor-Akzeptor Proteinvarianten kombiniert, so daß Änderungen von neun intramolekularen Abständen verfolgt werden konnten. In den nativen Proteinen betrugen diese Abstände zwischen 1,4 und 2,8 nm. Für das Trp/AEDANS Paar liegt der charakteristische Transferabstand im Bereich von 2,2 nm, was ungefähr dem Durchmesser von Bc-Csp entspricht und daher sehr empfindliche Messungen ermöglicht. In den einzelnen Proteinen wurde der Abstand zwischen Donor und Akzeptor sowohl unter nativen als auch unter Entfaltungsbedingungen bestimmt. Für die gefalteten Proteine sind die gemessenen Abstände mit denen aus der Kristallstruktur von Bc-Csp vereinbar, wenn die Länge des AEDANS linker berücksichtigt wird. Bei den entfalteten Proteinen wird eine gute Übereinstimmung mit den berechneten Abständen in einer zufällig angeordneten Peptidkette gefunden. Es gibt daher keinen Hinweis auf nativähnliche Reststrukturen im entfalteten Protein. Die Mutationen und Modifikationen, um sowohl den FRET Donor als auch Akzeptor einzuführen, verringerten die Stabilität von Bc-Csp nur geringfügig und führten zu keiner Veränderung der Rückfaltungsreaktion. Die Änderungen der Transfereffizienz während der Faltung wurden in kinetischen stopped-flow-Experimenten anhand der Trp- und der AEDANS-Fluoreszenz bestimmt. Für diese beiden Sonden wurden reziproke Effekte beobachtet. Bei niedrigen Konzentrationen des Denaturierungsmittels wird bereits in der Totzeit der stopped-flow-Rückfaltungsexperimente ein Anstieg der Transfereffizienz beobachtet, der von einem schnellen Kollaps des entfalteten Proteins verursacht wird. In Abhängigkeit von der Position des Donors und des Akzeptors findet bis zu 70 % der gesamten Abstandsänderung vor dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung statt. Mit Drucksprung- und Temperatursprungexperimenten wird eine höhere Zeitauflösung erreicht, aber der Zeitverlauf des Kollapses konnte auch mit diesen Methoden nicht verfolgt werden. In der Totzeit der Temperatursprungmessungen kommt es zu einer schwachen Effizienzänderung, so daß der Kollaps möglicherweise schneller ist als 0,1 Mikrosekunden. Alle Donor-Akzeptor Proteine zeigen unabhängig vom äußerst schnellen Kollaps ein Zweizustandsverhalten im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung. Es tritt keine Abweichung von der Linearität in den Chevronauftragungen auf, und die kinetischen und die Gleichgewichts-m-Werte stimmen überein. Diese Befunde deuten auf einen kollabierten Zustand hin, der zwar eine kompakte Struktur besitzt, aber für Wasser und Denaturierungsmittel immer noch gut zugänglich ist. Beide Eigenschaften konnten mit Hilfe verschiedener Lösungsmittelzusätze bestätigt werden: Ammoniumsulfat stabilisiert den kompakten kollabierten Zustand, durch Ethylenglykol wird er hingegen destabilisiert. Ethylenglykol wird vom immer noch lösungsmittelzugänglichen Peptidrückgrat des kollabierten Zustands ausgeschlossen. Beim kollabierten Zustand handelt es sich also nicht um ein gut definiertes, teilgefaltetes Intermediat. Der entfaltete und der kollabierte Zustand von Bc-Csp sind wahrscheinlich nicht durch eine Energiebarriere getrennt, sondern bilden zusammen ein Kontinuum von Konformationen mit unterschiedlicher Kompaktheit. Thermodynamisch betrachtet können die kollabierten Moleküle so dem entfalteten Zustand zugeordnet werden. Der Kollaps der Peptidkette ist eine Reaktion auf den Transfer in ein schlechteres Lösungsmittel bei der Rückfaltung. Dieser kollabierte Zustand verzögert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung nicht, und daher erfolgt die effiziente und schnelle Bildung des nativen Zustands von Bc-Csp innerhalb von Millisekunden.

Thermodynamische Stabilisierung von Proteinen durch in vitro Evolution und biophysikalische Analyse ihrer molekularen Grundlagen (2006)

Michael Wunderlich

Proteine sind zentrale Bausteine des Lebens und ihre dreidimensionale Struktur ist für die Funktion von entscheidender Bedeutung. Deswegen ist das Verständnis der konformationellen Stabilität von Proteinen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Selektionssystem Proside zur Stabilisierung von Proteinen genutzt. Proside basiert auf der phage display Technologie und verknüpft die thermodynamische Stabilität von Proteinen mit der Infektiosität von filamentösen Phagen. Die bakteriellen Kälteschockproteine werden sowohl von experimenteller, als auch theoretischer Seite als Modellproteine zur Untersuchung der Stabilität von Proteinen genützt. Es ist bekannt, dass elektrostatische Wechselwirkungen auf der Oberfläche von sehr großer Bedeutung für ihre Stabilität sind. Deswegen sollte versucht werden, alternative Ladungsnetzwerke auf der Oberfläche des Kälteschockproteins Bs-CspB aus B. subtilis unter Verwendung von in vitro Evolution zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden Reste anhand von Sequenz- und Strukturvergleichen mit homologen Proteinen ausgewählt und diese Positionen partiell randomisiert. In einem zweiten Ansatz wurden zufällig Mutationen in das Gen von Bs-CspB eingeführt. Nach erfolgter in vitro Evolution der jeweiligen Bibliotheken konnten an sechs oberflächenexponierten Positionen stabilisierende Mutationen identifiziert werden. Die Beiträge dieser Mutationen zur thermodynamischen Stabilität von Bs-CspB wurden analysiert. Die beste Kombination war, mit einem Schmelzpunkt von 83,7°C im Vergleich zu 53,8°C vom Wildtypprotein, sogar stabiler war als das hyperthermophile Homologe Tm-Csp aus T. maritima. Einen beachtlichen Beitrag zu dieser deutlichen Stabilisierung liefern dabei verbesserte Coulomb´sche Wechselwirkungen. Die Beiträge sind dabei jedoch sehr stark von der Umgebung abhängig. Vergleiche der experimentellen Daten mit vorhandenen theoretischen Betrachtungen offenbarten die Schwierigkeiten, Coulombsche Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche korrekt zu berechnen und deren Einfluss auf die thermodynamische Proteinstabilität zu bestimmen. Ein theoretischer Ansatz, welcher unter Verwendung eines quasi-elektrischen Dipolmomentes die Einflüsse von Veränderungen der Ladungsverteilung auf die Stabilität vorhersagte, konnte experimentell nicht verifiziert werden. Ebenso konnten keine Korrelationen zwischen Veränderungen der Stabilität und der Nettoladung des Proteins festgestellt werden und auch keine Korrelation mit der Bildung von Ionenpaaren hergestellt werden. Ebenso wie Bs-CspB stellt auch die b1 Domäne des Streptokokkenproteins G ein Modellprotein zur Untersuchung von thermodynamischer Stabilität dar. In der Gruppe von S. Mayo wurde dieses Protein unter Verwendung von computational design untersucht. Dabei zeigte sich, dass die vier teilweise exponierten Reste ein sehr großes Stabilisierungspotential besitzen. Eine in vitro Evolution dieser vier Positionen durch das Selektionssystem Proside bot somit die Möglichkeit, die Leistungsfähigkeit der beiden Methoden direkt zu vergleichen. Die Selektionen lieferten eine Vielzahl von deutlich stabilisierten Proteinvarianten. Für die stabilste Variante war der Mittelpunkt des thermischen Überganges um 24,7°C erhöht. Die beste Variante aus dem computational design lag von allen untersuchten Varianten auf dem dritten Platz. Sieben der zehn berechneten Varianten, welche in den Kalkulationen alle annähernd gleich stabil waren, enthielten einzeln oder in Kombination die Aminosäurereste L18 und K29. Diese beiden Reste erwiesen sich bei der experimentellen Charakterisierung als sehr ungünstig. Um die Ursachen für diese Unterschiede zu ergründen, wurde von zwei Varianten die dreidimensionale Struktur bestimmt. Zusätzlich wurden die enthaltenen Mutationen einzeln und in unterschiedlicher Kombination thermodynamisch charakterisiert. Dabei zeigten sich bei der Analyse die Schwierigkeiten, strukturelles Verhalten in experimentelle energetische Terme zu übersetzen, was der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse bei der Stabilisierung durch in vitro Evolution und computational design sein dürfte. Im Folgenden sollten für beide Schritte auf dem Weg zur Stabilisierung, der Auswahl von Positionen und dem Finden der besten Aminosäurereste, ein experimentelles Herangehen genützt werden. Durch Selektion von Bibliotheken mit zufälligen Mutationen, erstellt mittels fehlerhafter PCR, konnten viel versprechende Positionen identifiziert werden. Diese wurden dann einer Sättigungmutagenese mit anschließender Selektion unterworfen und die gefundenen Mutationen der beiden stabilsten Varianten wurden abschließend manuell kombiniert. Die erhaltene Variante besaß einen um 35,1°C erhöhten Übergangsmittelpunkt. Bei der Analyse der Ursachen zeigte sich, dass in diesem Fall starke hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den durch diese Mutationen eingeführten Seitenketten wirken. Dies zeigt, dass zur Stabilisierung von Proteinen vielfältige Wege beschritten werden können.

Die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus des Gen-3-Proteins filamentöser Phagen für die Infektion von Escherichia coli (2007)

Barbara Eckert

Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus eines Proteins für dessen Funktionsweise in vivo zu untersuchen. Als Modellsystem diente der filamentöse Phage fd, der Gram-negative Bakterien infiziert. Das Gen-3-Protein (G3P) dieses Phagen ist für die initialen Schritte der Infektion essentiell. G3P ist aus drei Domänen aufgebaut, wobei die C-terminale Domäne das Protein in der Phagenhülle verankert. Die beiden N-terminalen Domänen N1 und N2 bilden eine strukturelle Einheit und wechselwirken mit den beiden zellulären Phagenrezeptoren, dem bakteriellen F-Pilus und TolA in der Zellmembran. Die Wechselwirkung der N2-Domäne mit der Pilusspitze führt zur Dissoziation der beiden Domänen und aktiviert so G3P für die anschließende Interaktion der N1-Domäne mit der C-terminalen Domäne von TolA. Die TolA-Bindungsstelle befindet sich auf N1 an der Domänengrenzfläche und ist deshalb im nativen Ruhezustand des Proteins durch N2 blockiert. Im Verlauf der Infektion muss nach der Pilusbindung die geöffnete, aktive Form des G3P so lange erhalten bleiben, bis N1 mit TolA wechselwirken kann. Die Analyse des Faltungsmechanismus des N1N2-Fragments in vitro zeigte, dass die beiden Domänen N1 und N2 sehr schnell falten, ihre Assoziation im letzten Rückfaltungsschritt jedoch außergewöhnlich langsam ist. Die Geschwindigkeit der Domänenassoziation wird durch die trans-nach-cis-Isomerisierung an Pro213 bestimmt, das in der Gelenkregion zwischen den beiden Domänen lokalisiert ist. Die Isomerisierung in den nativen cis-Zustand ist mit einer Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) sehr viel langsamer als Prolinisomerisierungen in anderen Proteinen und wird durch die lokale Sequenzumgebung um cis-Pro213 (Gln212-Pro213-Pro214) verursacht. Die Relevanz der langsamen Prolinisomerisierung für die Phageninfektiosität konnte in Kompetitionsexperimenten nachgewiesen werden. In diesen Experimenten konkurrierten jeweils zwei Phagenvarianten, die sich in ihrer Isomerisierungsrate und damit der Assoziationsrate der beiden Domänen unterschieden, um die Infektion einer E. coli-Kultur. Phagen, die eine langsame Prolinisomerisierung und damit eine lange Lebensdauer des aktiven, geöffneten Zustands mit dissoziierten Domänen aufweisen, setzten sich in den Kompetitionsexperimenten durch. Dass es sich bei der Inaktivierung der Phagen tatsächlich um einen prolinkontrollierten Mechanismus handelt, zeigte der Einfluss der Prolylisomerase Cyp18. Nach Dissoziation der Domänen kontrolliert also die langsame trans-nach-cis-Isomerisierung die Lebensdauer des infektiösen Zustands. Die Infektion von F--Zellen mit in vitro aktivierten Phagen ermöglichte es, die Lebensdauer des aktiven Zustands und die Kinetik der Inaktivierung der Phagen zu bestimmen. Die für verschiedene Phagenvarianten erhaltenen Zeitkonstanten spiegelten dabei die Isomerisierungskinetik des entsprechenden G3P-Proteins in vitro wider. Die langsame Prolinisomerisierung in der Gelenkregion steuert so die Funktion des G3P bei der Phageninfektion, indem Pro213 sowohl als Schalter als auch als Zeitgeber wirkt. In der nativen cis-Konformation steht dieser Schalter auf „aus“, die beiden Domänen N1 und N2 sind fest miteinander assoziiert und die Gelenksubdomäne liegt gefaltet vor. Entsprechend sind die Phagen in dieser Ruheform stabil, aber nicht infektiös. Die Bindung der N2-Domäne an den F-Pilus führt zur Dissoziation der beiden Domänen. Mit Hilfe CD-spektroskopischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in diesem offenen, aktivierten Zustand entfaltet vorliegt. Dies führt zu einer Destabilisierung der N2-Domäne. Ob N2 bei der Infektion ebenfalls entfaltet vorliegt, konnte jedoch nicht gezeigt werden. Als Folge der partiellen Entfaltung der Gelenkregion isomerisiert Pro213 aus dem sterisch anspruchsvollen cis- in den stabileren trans-Zustand, welcher der „an“-Stellung des Prolinschalters entspricht. Die sehr langsame Rückisomerisierung in die native cis-Konformation fungiert nun als Zeitgeber und gewährleistet, dass G3P lange genug geöffnet und partiell entfaltet bleibt, um eine Wechselwirkung zwischen der N1-Domäne und TolA in der Zellmembran zu ermöglichen. Neben dem Faltungsmechanismus beeinflusst auch die Stabilität des G3P die Infektiosität der Phagen. Mit Hilfe von Infektionsexperimenten von F+- und F--Zellen konnte gezeigt werden, dass die Infektiosität stark von der Stabilität des G3P, insbesondere von der Stärke der Domäneninteraktion, anhängt. Mit zunehmender Stabilität nimmt die Infektiosität ab, und stabilisierende Mutationen erschweren den Übergang in die aktive, partiell entfaltete Form mit dissoziierten Domänen. Die Stabilität des G3P ist daher so angepasst, dass einerseits eine Stabilität der Phagen im Ruhezustand garantiert ist, und es andererseits bei Bindung an den F-Pilus durch Domänendissoziation aktiviert werden kann.

Das Gen-3-Protein filamentöser Phagen als Modellsystem zur Untersuchung von Proteinstabilität, Faltungsmechanismen und Prolylisomerisierung (2009)

Roman Jakob

Proteine sind die funktionstragenden Moleküle in lebenden Zellen und ihre pharmazeutische und biotechnologische Anwendung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Um ihre Funktion zu erlangen, müssen Proteine falten und die gefaltete Struktur möglichst lange beibehalten. Die Faltungsmechanismen und die Grundlagen der konformationellen Stabilität von Proteinen zu verstehen, ist daher eines der zentralen Ziele der biophysikalischen und biochemischen Forschung. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Gen-3-Protein des Phagen fd. Sein Faltungsmechanismus ist aufs Engste mit seiner biologischen Funktion verknüpft, und es ist ein Modellsystem für die Untersuchung von Proteinfaltung, -stabilität und Prolylisomerisierung. Die isolierte N2-Domäne des Gen-3-Proteins im Mittelpunkt der Arbeit. Dabei zeigte sich, dass in der nativen N2-Domäne ein cis/trans-Gleichgewicht an Pro161 existiert, das entscheidend für die Stabilität und Faltung des Proteins ist. Solche Heterogenitäten an Prolinresten werden als potentiell wichtige regulatorische Schalter in biologischen Systemen diskutiert, konnten aber bislang kaum untersucht werden. Während der Faltung von N2 wird der cis-Anteil an Pro161 von 7 % im denaturierten Protein auf 89 % im nativen Protein erhöht, was einem Energieaufwand von 10 kJ mol-1, der Hälfte der insgesamt verfügbaren Konformationsenergie des nativen Protein, entspricht. Um diese Kopplung auf molekularer Ebene zu verstehen, wurde die lokale Sequenzumgebung von Pro161 systematisch variiert. In der cis-Form zeigte die Schleife um Pro161 eine definierte native Konformation. Die energetische Kopplung zwischen der cis-Form an Pro161 und den Faltblattsträngen ist dabei schon im Übergangszustand der Faltung voll ausgebildet. In der trans-Form hingegen ist die Schleife entfaltet, und es besteht keine energetische Kopplung mit dem Beta-Faltblatt. Die Beiträge der einzelnen Bereiche der N2-Domäne zur Struktur und zur Energetik des Übergangszustands der Faltung wurde mit Hilfe einer Phi-Wert-Analyse analysiert. Es sind zwar fast alle Bereiche für die Stabilität des nativen Proteins wichtig, den Faltungsprozeß hingegen bestimmt nur ein eng begrenzter Faltungsnukleus. Die trans-cis-Isomerisierung an Pro161 in der N2-Domäne lässt sich sehr gut durch Prolylisomerasen katalysieren. Um die Substratspezifität von Prolylisomerasen der FKBP-Familie untersuchen zu können, wurde eine Bibliothek von N2-Varianten mit allen natürlichen Aminosäuren vor Pro161 hergestellt. Prolylisomerasen, die nur aus einer katalytischen Domäne bestehen, zeigen für kurze Peptide und für faltende Proteine die gleiche Substratspezifität, mit einer sehr starken Präferenz für hydrophobe Reste vor Prolin. Besitzen die Prolylisomerasen zusätzlich eine Chaperondomäne, wie SlyD oder Triggerfaktor, dann ist ihre Aktivität praktisch unabhängig von der Aminosäure vor Prolin. Der Grund dafür ist, dass die enzymkinetischen Parameter der katalysierten Faltung, die Affinität und die Umsatzzahl durch die Chaperondomäne bestimmt werden. Die N2-Domäne besitzt nur eine marginale Stabilität. Deshalb wurde mit diesem Protein untersucht, inwieweit Proteine durch rationales consensus design von Beta-Turns stabilisiert werden können. Für N2 konnte durch Sequenzoptimierung von drei Beta-Turns die Stabilität tatsächlich praktisch verdoppelt werden, was die generelle Anwendbarkeit dieser Methode verdeutlicht. Interessanterweise führt diese Turnoptimierung auch zu einer sehr starken Beschleunigung der Faltung von N2, offensichtlich weil diese Beta-Turns bereits sehr früh im Faltungsprozess von Proteinen wichtig sind, da sie Bildung von nativen Interaktionen in den benachbarten Bereichen ermöglichen. Im Gen-3-Protein des Phagen fd tritt während der in-vitro-Faltung ein langlebiges Intermediat mit einem trans-Prolin213 auf. Mittels NMR-Spektroskopie wurde herausgefunden, das in diesem Intermediat die N1- und die N2-Domäne bereits ihre native chemische Verschiebung zeigen, aber die Gelenkdomäne zwischen den Domänen nur teilweise strukturiert ist. In der anschließenden Domänenassemblierungsreaktion werden als Folge der trans-cis Isomerisierung an Pro213 besonders Wasserstoffbrückenbindungen stark stabilisiert, die eine Kette zwischen der Grenzfläche von N1 und der Gelenkregion bilden. Die Ergebnisse zur Kopplung zwischen cis/trans Isomeren an Pro213 entsprechen konzeptionell dem Mechanismus an Pro161 in der N2-Domäne. Am Beispiel des Gen-3-Proteins des Phagen IKe wurde untersucht, ob alle Gen-3-Proteine filamentöser Phagen eine ähnliche Struktur und Faltungsmechanismus besitzen. Dabei zeigte sich, dass die TolA-bindenden Domänen beider Proteine strukturell und funktionell stark konserviert sind. Die jeweiligen pilusbindenden Domänen sind dagegen architektonisch komplett verschieden, da sie spezifisch an den jeweiligen Wirt adaptiert wurden. Deshalb sind vermutlich die Faltungsmechanismen dieser Mehrdomänenproteine, und damit auch die Infektionsmechanismen grundlegend verschieden.

Von der Faltung zur Funktion: Steuerung des Infektionsmechanismus filamentöser Phagen durch Faltungsprozesse und Beschleunigung oxidativer Faltung durch Thioloxidasen (2010)

Stefan Lorenz

Die filamentösen Phagen IF1 und fd sind eng miteinander verwandt. Dies spiegelt sich auch bei der Infektion von E. coli Zellen wider, die bei beiden Phagen nach einem Zweischrittmechanismus abläuft, der durch die jeweiligen Gen-3-Proteine (G3P) vermittelt wird. Im ersten Schritt bindet die N2 Domäne von G3P an den bakteriellen Pilus, beim Phagen IF1 an den I Pilus, beim Phagen fd an den F Pilus. Durch die spezifische Bindung an einen Pilus bestimmt die N2 Domäne von G3P die Wirtsspezifität des Phagen. Im zweiten Schritt der Infektion interagiert in beiden Fällen die N1 Domäne mit dem bakteriellen Rezeptor TolA-C. Die N1 Domänen der G3Ps beider Phagen binden mit demselben Bindungsmuster an die gleiche Stelle von TolA C, wie die Röntgenstrukturanalyse der beiden Komplexe zeigt. Der molekulare Mechanismus der Infektion unterscheidet sich, da die G3Ps der Phagen IF1 und fd eine verschiedenartige Domänenorganisation besitzen. Im G3P des Phagen IF1 stellen N1 und N2 zwei eigenständige und stabile Einheiten dar, die Bindungsstellen für den I Pilus und TolA-C sind daher permanent zugänglich. Das native G3P des Phagen fd liegt dagegen in einer geschlossenen, inaktiven Konformation vor, in der N1 und N2 fest miteinander assoziiert sind und die Bindungsfläche für TolA-C auf N1 in der Grenzfläche zwischen N1 und N2 verborgen ist. Erst die Bindung von N2 an den bakteriellen F Pilus führt zur Domänendissoziation, wodurch die Bindungsstelle für TolA C auf N1 zugänglich wird. Dieser komplexe Infektionsmechanismus des Phagen fd konnte in den einfacheren Infektionsmechanismus des Phagen IF1 überführt werden, indem die Domäneninteraktion durch die Deletion von sieben Aminosäuren im Gelenkbereich zwischen N1 und N2 aufgelöst wurde. Eine Erhöhung der Infektionsraten auf das Niveau des Referenzphagen fd wurde durch eine nachträgliche selektive Stabilisierung der N2 Domäne erreicht. Die Phagen fd und IF1 entwickelten unterschiedliche Strategien um Infektiosität und eine hohe thermodynamische Stabilität der G3Ps zu vereinen. In IF1 G3P bildeten sich zwei eigenständige, stabile Domänen aus, in fd G3P hingegen etablierte sich eine geschlossene Konformation, in der die labile N2 Domäne durch eine starke Assoziation mit der N1 Domäne stabilisiert wird. Die Notwendigkeit der Domänendissoziation in G3P während der Infektion durch den Phagen fd wurde durch die Konstruktion eines G3Ps nachgewiesen, in dem N1 und N2 durch eine Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Diese Verknüpfung verhindert die Domänendissoziation und folglich die Infektion. Das Phagenkonstrukt mit dieser G3P Variante als Vermittler der Infektion ermöglicht eine steuerbare Infektion, die durch Reduktion der Disulfidbrücke induziert werden kann. Die Konstruktion von Disulfidbrücken wurde ebenfalls benutzt, um die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlpA zu stabilisieren. In weitergehenden Untersuchungen werden die Disulfidbrücken in das Volllängenprotein SlpA eingebaut, um die Auswirkung dieser entropischen Stabilisierung auf Funktion und Stabilität des Zweidomänenproteins analysieren zu können. Die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlyD, die in isolierter Form ungefaltet vorliegt, konnte ebenfalls durch den Einbau einer Disulfidbrücke stabilisiert werden. Die konformationelle Faltung dieser stabilisierten Variante ist strikt an die Ausbildung der Disulfidbrücke gekoppelt. Daher eignet sich dieses Protein hervorragend als Substrat, um die Beschleunigung der oxidativen Faltung durch Thioloxidasen zu charakterisieren. Die Effizienz der Katalyse der oxidativen Faltung korreliert dabei nicht mit dem Reduktionspotential der Faltungshelfer, sondern mit der Fähigkeit nicht-native Substratproteine über hydrophobe Bindungsflächen, hier Chaperondomänen, zu binden. Die Bindung nicht-nativer Substrate über Chaperondomänen, sowie ein geeignetes Reduktionspotential des katalytischen Disulfids, sind ebenfalls Voraussetzungen für eine Disulfidisomeraseaktivität von Faltungshelfern. Deshalb besitzen PDI und DsbC neben einer hohen Thioloxidaseaktivität auch eine hohe Disulfidisomeraseaktivität. Für diese Untersuchungen wurde ein sensitiver Test auf Grundlage der Reaktivierung fehlgefalteter RNase T1 und der Hydrolyse von Fluorophor-markierten Oligonukleotiden etabliert und zur Analyse von PDI, DsbC und DsbA eingesetzt. Mia40 ist eine neuartige Thioloxidase im Intermembranraum von Mitochondrien. Für Mia40 konnte die Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,3 Å gelöst werden. Mia40 zeigt keine strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Thioloxidasen. Wie viele andere Faltungshelfer wirkt Mia40 als Chaperon, in vitro verhindert es effektiv die Aggregation rückfaltender Citratsynthase. Mia40 zeigt in vitro lediglich Oxidase-, aber keine Disulfidisomeraseaktivität. Ob Mia40 in vivo ausschließlich als Thioloxidase wirkt, oder bei speziellen Substraten doch fehlerhafte Disulfidbrücken auflösen kann, ist noch unklar und Gegenstand weiterführender Forschungsarbeiten.

Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen (2012)

Stephanie Hoffmann-Thoms

Für die Infektion von E. coli Zellen benötigt der filamentöse Phage fd sein aus drei Domänen bestehendes Gen-3-Protein (G3P). Die C-terminale Domäne verankert das G3P in der Phagenhülle, die N-terminalen Domänen N1 und N2 vermitteln die initialen Schritte der Infektion. Im Ruhezustand des Phagen liegen N1 und N2 in assoziierter Form vor, wodurch die Bindungsfläche auf der N1-Domäne für den sekundären Rezeptor, die C-terminale Domäne von TolA, blockiert wird. Zur Aktivierung des G3P interagiert der Phage über seine N2-Domäne mit dem F-Pilus der Wirtszelle wodurch die für die Assoziation der Domänen wichtige Gelenkregion entfaltet und das dort befindliche Pro213 in die trans-Konformation übergeht. Die Lebenszeit des aktiven Zustandes wird limitiert durch die Reisomerisierung von Pro213, die jedoch sehr langsam abläuft. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Bereiche für die Population des offenen bzw. geschlossenen Zustandes und damit die Funktionalität des G3P wichtig sind. Über die Analyse des Faltungsmechanismus des Wildtyp G3P, sowie der Stabilität und Struktur seines Intermediates mittels NMR-Spektroskopie, konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in der aktiven Form komplett entfaltet vorliegt. In der Variante G3P IIHY, die unter anderem in der Gelenkregion zwei stabilisierende Substitutionen enthält, sind dagegen die Domänen im Intermediatszustand noch lose miteinander assoziiert. Die Unterschiede in der Stärke der Domänenassoziation beeinflussen die Wechselwirkung der entsprechenden G3P-Varianten mit TolAC, was in vitro anhand von Bindungsexperimenten nachgewiesen werden konnte. Sowohl im aktiven Intermediat, als auch in der nativen Form führen stabilisierende Austausche zu einer deutlichen Verschlechterung der Interaktionsfähigkeit des G3P mit TolAC. Dies wurde zusätzlich durch Infektionsexperimente sowohl mit pilusfreien, als auch mit pilushaltigen Zellen bestätigt. Die Analyse der Stabilität und des Faltungsmechanismus der P213G-Variante des fd G3P zeigt, dass auch Pro213 die Stabilität des inaktiven Ruhezustandes und damit die Lebensdauer der aktiven Form beeinflusst. Aufgrund des Verlustes des Prolinschalters liegt das entsprechende G3P P213G zum großen Teil in nicht assoziierter und damit instabiler Form vor. Durch den Austausch der beiden zu Pro213 benachbarten Reste sind die N-terminalen Domänen ebenfalls fast vollständig unabhängig voneinander, was unter anderem auf die beschleunigte Isomerisierung an Pro213 zurückgeführt werden kann. Um zu analysieren, welche Bereiche des G3P an der Weiterleitung des Signals der Bindung von N2 an den Pilus beteiligt sind, wurden verschiedene Substitutionsvarianten hergestellt, thermodynamisch charakterisiert und die Infektiositäten der entsprechenden Phagenvarianten untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erste Schleife der N1-Domäne, die sich in der Interaktionsfläche zur N2-Domäne befindet, eine wichtige Rolle spielt. Nach Ersatz durch eine kürzere Schleife liegen N1 und N2 fast vollständig dissoziiert vor, wie unter anderem aus der Analyse der Affinität gegenüber TolAC sowohl in vitro als auch in vivo hervorgeht. Während der Aktivierung müssen im Umkehrschluss auch die Wechselwirkungen zwischen der Schleifenregion von N1 und N2 gelöst werden. Aufgrund der hohen Stabilität seines G3P im Ruhezustand wird der fd Phage als Grundlage des PROSIDE-Selektionsverfahrens verwendet, um stabilisierte Proteinvarianten zu erhalten. Für das Gb1-Protein aus Streptococcus sp. wurden darüber unter anderem vier stark stabilisierende hydrophobe Austausche identifiziert, die in der Variante Gb1-M2 kombiniert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität dieser hyperstabilen Variante näher analysiert. Die relativ zum WT-Gb1 deutlich erhöhte Stabilität von Gb1-M2 ist dabei zum Teil durch deren Dimerisierung bedingt. Die Kristallstruktur des Proteins zeigt, dass die Assoziation der Monomere über die Ausbildung eines intermolekularen b-Faltblattes und eine hydrophobe Interaktionsfläche vermittelt wird. Der Kern dieser Assoziationsfläche wird durch Leucinreste an den Positionen 16 und 37 gebildet. Die Untersuchung weiterer Varianten hat gezeigt, dass die Kombination von hydrophoben Resten an diesen Positionen zur Dimersierung führt. Um den Beitrag der Austausche zur konformationellen Stabilität des Monomers von Gb1-M2 zu bestimmen, wurde dessen Faltungsmechanismus mittels Einzel- und Doppelmischexperimenten analysiert. Die Faltung des Monomers konnte dabei von der Einstellung des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes getrennt und seine Stabilität bestimmt werden. Diese ist gegenüber dem WT-Gb1 deutlich erhöht. Eine solche kinetische Analyse kann allgemein für oligomere Proteine verwendet werden, um die Stabilität ihrer monomeren Form zu ermitteln. Voraussetzung ist, dass, wie in Gb1-M2, die Faltung des Monomers schneller abläuft als die Einstellung des Monomer-Oligomer-Gleichgewichtes.

Kombination von Substratanreicherung und Katalyse als generelles Prinzip von Faltungshelferenzymen (2012)

Anne-Juliane Geitner

In der Zelle existieren eine Vielzahl von Faltungshelferenzymen: molekulare Chaperone, die durch Bindung an aggregationssensitive Oberflächen die Konzentration aggregationssensitiver Intermediate herabsetzen und Peptidylprolylisomerasen und Thioldisulfidoxidoreduktasen, die geschwindigkeitsbestimmende Schritte während der Proteinfaltung katalysieren. Viele Faltungshelferenzyme kombinieren katalytische Funktion und Chaperonfunktion, die häufig innerhalb verschiedener Domänen lokalisiert sind. Ein solches Beispiel ist die Peptidylprolylisomerase SlpA, die aus einer FKBP-Domäne und einer Chaperondomäne aufgebaut ist. Die FKBP-Domäne besitzt Prolylisomeraseaktivität, die IF-Domäne ist für die Chaperoneigenschaften von SlpA verantwortlich. SlpA besitzt eine sehr geringe Prolylisomerase- und Faltungshelferaktivität, ist jedoch ein äußerst effizientes Chaperon. Die NMR-Struktur von SlpA und ein Vergleich mit der Struktur der homologen Prolylisomerase SlyD liefert keine Erklärung für die sehr geringe Prolylisomeraseaktivität. Die Untersuchung von homologen SlpA-Proteinen aus verschiedenen anderen Organismen zeigt, dass die niedrige Prolylisomeraseaktivität und die hohe Chaperonaktivität in der Familie der SlpA Proteine konserviert sind. SlpA bindet mit hoher Affinität und sehr hoher Dynamik an permanent entfaltete RNaseT1. Die geringe Faltungshelferaktivität von SlpA ist also auf die geringe Prolylisomeraseaktivität der FKBP-Domäne zurückzuführen, und nicht auf eine gestörte Substratbindung oder Dynamik der IF-Domäne. Die Konstruktion einer Chimäre aus der FKBP-Domäne von SlyD und der IF-Domäne von SlpA bestätigt dies. Da in diesem chimären Protein die effiziente Prolylisomerasedomäne von SlyD vorhanden ist, ist es ein hochaktiver Faltungshelfer. SlpA gehört zu den Zwei-Domänen-Proteinen, bei denen eine Domäne (IF) in die Schleife einer anderen Domäne (FKBP) insertiert ist. Stabilitätsuntersuchungen zeigen, dass die IF Domäne in isolierter Form gefaltet vorliegt. Innerhalb des Gesamtproteins stabilisiert die Insertion der IF-Domäne die FKBP-Domäne. Die Faltung der IF-Domäne ist sehr schnell und läuft zum größten Teil autonom von der FKBP-Domäne ab. Bei höheren Konzentrationen an Denaturierungsmittel ist die Stabilität der IF-Domäne nicht mehr ausreichend um selbstständig zu falten. Daher wird sie von der FKBP-Domäne abhängig und beide Domänen bilden eine Faltungseinheit. Die FKBP-Domäne wird nicht nur durch die IF Domäne stabilisiert, sondern stabilisiert auch ihrerseits die IF-Domäne. Die Analyse der Stabilität und der Faltung der SlyD-SlpA-Chimäre zeigt ebenfalls, dass die SlpA-IF-Domäne einen enormen stabilisierenden Einfluss auf die Wirtsdomäne, in dem Fall die SlyD FKBP Domäne, besitzt. Damit unterscheiden sich SlpA und SlyD aufgrund der unterschiedlichen Stabilitäten ihrer IF-Domänen grundlegend in ihren Faltungsmechanismen. Um solche modular aufgebauten Faltungsenzyme genauer zu untersuchen, wurden artifizielle Proteine konstruiert, bei denen nicht-homologe Chaperondomänen, die apikale Domäne aus GroEL aus E. coli, die b'-Domäne der PDI aus S. cerevisiae und die Chaperondomäne des periplamatischen Faltungshelfers SurA aus E. coli in die Prolylisomerase hFKBP12 insertiert wurden. Die Insertion dieser Domänen in eine Schleife von hFKBP12 wirkt stark destabilisierend, da durch den Einbau die lokalen Kontakte der Schleife zerstört werden. Durch das Einführen natürlich vorkommender Linkerbereiche und ihre schrittweise Verlängerung konnte die Wirtsdomäne hFKBP12 stabilisiert werden und ihre Prolylisomeraseaktivität, die durch die Destabilisierung stark beeinträchtigt war, wiederhergestellt werden. Auch durch das Einführen einer Disulfidbrücke im Linkerbereich konnten sowohl hFKBP12 als auch die Gastdomänen enorm stabilisiert werden konnten. Die Anwesenheit der Chaperondomänen steigert in allen Fällen die Faltungshelferaktivität von hFKBP12 und verringert die hohe Substratspezifität der Prolylisomerase gegenüber Proteinsubstraten. Demzufolge ist dies ein generischer Effekt, der unabhängig ist von der Herkunft der Chaperondomäne. Die chimären Faltungshelferenzyme binden mit hoher Affinität und hoher Dynamik an entfaltete Proteinsubstrate. Neben seiner Chaperondomäne besitzt SurA zwei Parvulindomänen, von denen nur eine als Prolylisomerase aktiv ist. Durch den Einbau der IF-Domäne von SlyD als Chaperondomäne in die beiden Parvulindomänen sind die chimären Parvulinkonstrukte in der Lage, entfaltete Protein zu binden und als Chaperon zu wirken. Die Faltungshelferaktivität der katalytisch aktiven Parvulindomäne konnte durch den Einbau der IF-Domäne enorm gesteigert werden. Diesre Arbeit zeigt, dass separate Bindungsstellen für generische Substratbindung und spezifische Katalyse Voraussetzung sind für die Konstruktion von aktiven, artifiziellen Faltungsenzymen aus nicht-verwandten Domänen.

Chemie

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