OPUS 4 | Chemie

Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA (2002)

Sabine Schwarz

In dieser Arbeit wurden drei virale Regulator-Proteine (CAEV-Tat, HK022 Nun und l N (1-53)) und mehrere ihrer nicht-viralen Bindungspartner kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. CAEV-Tat (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus) ist ein Transaktivatorprotein aus einem HIV-verwandten Lentivirus der Ziege. Zur effizienten Expression von CAEV-Tat war es notwendig, einige seltene Codons des tat-Gens gegen die jeweils synonymen, aber in E. coli häufiger verwendeten Codons auszutauschen. Ferner mußte eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (argU) koexprimiert werden, um die für NMR-Spektroskopie nötigen Proteinmengen herstellen zu können. Expression und Reinigung von CAEV-Tat mittels Standardverfahren wie Metallionenaffinitätschromatographie über einen Histidinanhang oder die Expression und Reinigung als GST-Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Daher mußte ein individuell auf CAEV-Tat zugeschnittenes Reinigungsprotokoll etabliert werden. Aufgrund seines hohen pIs von 11 konnte CAEV-Tat über Kationenaustauscher-Chromatographie an CM-Sepharose und anschließende Hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Ausbeuten an Protein ließ sich durch Verwenden von Heparin-Sepharose als Kationenaustauscher-Material noch weiter steigern. CAEV-Tat zeigte in CD- und NMR-Spektren typische Charakteristika eines a-helikalen Proteins. Da CAEV-Tat in Konzentrationen über 400 µM aggregierte und daher nicht für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen, die höher Konzentrationen voraussetzen, geeignet war, wurde eine cysteinfreie Mutante von CAEV-Tat kloniert und nach dem für das Wildtyp-Protein etablierten Protokoll gereinigt. Die Mutante erwies sich als weitaus NMR-tauglicher und zeigte keinerlei Aggregationstendenzen bei Konzentrationen von 1 mM. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß Wildtyp-Protein und cysteinfreie Mutante strukturell identisch sind. Somit steht mit der cysteinfreien Mutante ein für weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignetes Konstrukt zur Verfügung. Für das CAEV-Tat homologe Maedi-Visna-Virus-Tat-Protein war eine Interaktion mit der basischen und der Leucin-Zipper-Domäne der beiden zellulären Transkriptionsfaktoren Jun und Fos postuliert worden (Morse et al., 1999). Für spätere Vergleichsstudien mit CAEV-Tat und Jun / Fos zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit der Beschaffung der entsprechenden Nukleotidsequenzen und der Generierung expressionsfähiger Klone von c-jun, c-fos sowie und fosbZIP bereits wichtige Voraussetzungen für spätere Bindungsstudien mit NMR-Spektroskopie geschaffen. JunbZIP (222-331) konnte bereits erfolgreich als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose gereinigt werden. Nun aus dem lambdoiden Phagen HK022 fungiert bei einer Superinfektion des Wirts mit dem l-Phagen als Terminator der viralen Genexpression. Um spätere Strukturuntersuchungen an diesem System durchführen zu können, mußte zunächst ein auf die E. coli codon usage optimiertes synthetisches Gen für Nun generiert werden. Hierbei erwies sich die Methode nach Kim (1989) als erfolgreich. HK022 konnte mit Ausbeuten von 70 mg/l Kulturmedium über Kationenaustauscher-Chromatographie mit Heparin-Sepharose gereinigt werden. Erste strukturelle Befunde (CD, HSQC-Spektren, Messung des hydrodynamischen Radius) deuten darauf hin, daß es sich bei Nun um ein Protein mit nur gering ausgeprägter Tertiärstruktur handelt. Ein Fragment (1-53) des Antiterminator-Protein N aus dem Phagen l konnte kloniert und als Fusionsprotein mit Ubiquitin exprimiert werden. Die Reinigung erfolgte über Affinitätschromatographie und einen abschließenden RP-HPLC-Schritt nach der Abspaltung des Ubiquitinanteils. l N-Protein liegt in Lösung unstrukturiert vor. Dieser Befund wurde auch für das N(1-53)-Peptid durch CD-Spektroskopie und die Bestimmung des hydrodynamischen Radius erhalten. Bei der Bindung von 15N-N(1-53) an nutboxB-RNA bildet sich ein Komplex, der höchstwahrscheinlich weitgehend die gleiche Struktur wie der Komplex aus N(1-36) und nutboxB-RNA besitzt. Bei Zugabe des Wirtsfaktors NusA aus E. coli zu diesem binären Komplex kommt es auf Seiten von l N (1-53) zu Veränderungen im HSQC-Spektrum, was auf eine spezifische Interaktion zwischen dem längeren l-Peptid und NusA hindeutet. Hiervon sind vor allem die nicht im Komplex mit nutboxB vorliegenden Reste von l N betroffen. Weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen werden klären, inwieweit die nutboxB-RNA an der Interaktion mit NusA beteiligt ist. Mit der Etablierung eines Reinigungsprotokolls für N(1-53) und für E. coli NusA konnten wichtige Voraussetzungen hierfür bereits erfüllt werden.

Strukturbiologische Untersuchungen und Faltungsstudien von Modellproteinen mittels NMR-Spektroskopie (2004)

Markus Wolfgang Zeeb

Die biologische Funktion von Proteinen basiert in den meisten Fällen auf einer definierten dreidimensionalen Struktur, die sich im Verlauf der Proteinfaltung ausbildet. In dieser Arbeit wurden die Modellproteine CspB aus B. subtilis, RNase T1 aus A. oryzae, ORF56 aus S. islandicus sowie des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d mit einer Reihe biophysikalischer Methoden ausführlich charakterisiert. Die schnelle interne Dynamik von CspB wurde bei verschiedenen Lösungsmittelviskositäten untersucht, wobei durch eine erweiterte Lipari-Szabo-Analyse der 15N-Relaxationsparameter die Rotationskorrelationszeit iterativ optimiert. Diese stellt einen empfindlichen Sensor gegenüber der unmittelbaren Umgebung des Proteins innerhalb der Hydratationshülle dar, wobei die Geschwindigkeit der Gesamtbewegung nicht von der Größe des Proteins inklusive seiner Hydratationshülle sondern vielmehr von deren Mikroviskosität abhängt. Die Dynamik im ps- bis ns-Bereich bleibt bei steigender Viskosität nahezu unverändert. Der Beitrag des chemischen Austauschs (Rex) zur transversalen Relaxationsrate ist über das gesamte Protein verteilt und korreliert nicht mit Sekundärstrukturelementen oder flexiblen Schleifen. Rex repräsentiert daher nicht die lokale Dynamik einzelner Reste sondern ist auf die globale Faltungsreaktion von CspB im Millisekundenbereich zurückzuführen. Durch die Erhöhung der Viskosität wird die Größe und Anzahl der Rex-Beiträge signifikant reduziert. Die Kooperativität der Millisekundenfaltung von CspB wurde anhand dynamischer NMR-Methoden untersucht, wobei die Bestimmung der Faltungsraten mit R2-Dispersionsmessungen die verlässlichsten Ergebnisse lieferte. Die 24 analysierten ortsspezifischen Sonden zeigen sehr ähnliche apparente Faltungsraten und stimmen gut mit stopped flow Fluoreszenz detektierten Faltungsraten überein. Die Faltung verläuft kooperativ und über einen wenig heterogenen Übergangszustand. Die Wechselwirkung von CspB mit einzelsträngiger DNA wurde auf struktureller Ebene charakterisiert. Die aus Sequenzvergleichen postulierte potentielle Bindungsregion von CspB wurde mittels NMR-Titrationsexperimenten verifiziert. Dabei konnten zusätzliche Aminosäuren außerhalb der Bindungsmotive identifiziert werden, die für die Interaktion sehr wichtig sind. Die Beiträge einzelner Reste zur Bindungsaffinität wurden anhand einer Mutationsanalyse bestimmt, wobei die Lösungsmittel-exponierten Phenylalanine essentiell für eine feste Bindung sind. Aus der Strukturbestimmung von CspB im Komplex mit dem ssDNA-Fragment dT7 folgte, dass das Proteinrückgrat nahezu unverändert vorliegt und die Hauptunterschiede in der relativen Orientierung der aromatischen Seitenketten liegen. Die Modellierung der Struktur des Komplexes mit HADDOCK weist auf die vermuteten Stapel-Wechselwirkungen der aromatischen Seitenketten mit den Basen der ssDNA hin. Die Bindung der Nukleinsäure stabilisiert CspB. Das homodimere Protein ORF56 aus dem acidohyperthermophilen Archaeon Sulfolobus islandicus wurde mit einer Fülle von biophysikalischen Methoden studiert und dessen dreidimensionale Struktur mittels NMR bestimmt. Diese ähnelt der des Arc-Repressor sehr. Die Faltung von ORF56 kann sowohl im Gleichgewicht als auch in der Faltungskinetik mit dem Zweizustandsmodell für dimere Proteine beschrieben werden. Das Protein besitzt eine außerordentlich hohe Stabilität, was in dem extrapolierten Schmelzpunkt der thermischen Entfaltung von 107 °C zum Ausdruck kommt. Diese extreme Stabilität wird von der schnellen simultanen Assoziations-/Faltungsreaktion aber vor allem durch die besonders langsame Entfaltungsreaktion (5.7 pro Jahr) bestimmt. Die Entwicklung höherdimensionaler Echtzeit NMR-Techniken zum Studium langsamer Faltungsreaktionen wurde mit S54G/P55N RNase T1 durchgeführt. Die geschwindigkeitsbestimmende trans/cis Isomerisierung der Y38-P39 Peptidbindung synchronisiert die kooperative Rückfaltung des Faltungsintermediats, was anhand einer Vielzahl von ortsspezifischen Sonden gezeigt wurde. Die Aufnahme von 3D Echtzeit NOESY-HSQC-Spektren ermöglichte die Zuordnung des Proteinrückgrats des Faltungsintermediats und die Identifizierung von NOE-Kreuzsignalen, die die Basis für eine zukünftige Strukturbestimmung des transienten Zustands bilden. Die Faltung des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d, der weder Trp noch Tyr enthält, wurde mit Circulardichroismus und Phenylalanin-Fluoreszenz beobachtet. Mittels dieser optischen Sonden wurde im Gleichgewicht ein apparentes Zweizustandsmodell gefunden. Allerdings wurde in einem NMR-detektierten Entfaltungsübergang ein dritter Zustand bei mittleren Harnstoffkonzentrationen detektiert. Unter stark nativen Bedingungen konnten drei Rückfaltungsphasen aufgelöst werden. Die langsamste Phase kann mit PPIasen signifikant beschleunigt werden, was auf eine Prolyl-cis/trans-Isomerisierung hindeutet, die mittels 1D Echtzeit NMR-Spektroskopie verfolgt werden konnte.

Bestimmung der Struktur der 15. Domäne des Multidomäneninhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie und Design einer inhibitorisch wirksamen Mutante (2004)

Klaus Vitzithum

In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der 15. Domäne des Multidomänen-Inhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie bestimmt, sowie die inhibitorischen Eigenschaften dieser Domäne untersucht. Das Vorläuferprotein LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor) umfasst fünfzehn Domänen, von denen die 2. und 15. Domäne zwar ein typisches Kazalmotiv zeigen, jedoch anstatt der für klassische Kazalvertreter üblichen sechs 12-13 Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen aufweisen. Bei der schweren autosomal rezessiven Erbkrankheit Netherton Syndrom werden Mutationen im LEKTI-Gen gefunden, die eine vorzeitige Termination der Translation verursachen und daher nur zu verkürzt gebildetem LEKTI-Protein führen. Da die LEKTI-Domäne 15 bei Patienten mit Netherton Syndrom nicht exprimiert wird, ist diese besonders interessant. Einige Symptome des Netherton Syndroms legen eine Fehlregulierung der Proteinase Tryptase nahe, da diese eine Schlüsselrolle bei Überempfindlichkeitsreaktionen und Asthma einnimmt. Bei einem Sequenzvergleich des bislang einzig bekannten natürlich vorkommenden Tryptase-Inhibitors LDTI (leech derived tryptase inhibitor) mit den LEKTI-Domänen wurde eine signifikante Homologie zwischen Domäne 15 und LDTI insbesondere im Bereich der Bindungsschleife gefunden, weswegen eine regulatorische Funktion von LEKTI gegenüber Tryptase vermutet wird. Nachdem kein natürliches Material zur Verfügung stand, war es zur Gewinnung ausreichender Mengen rekombinanten Proteins, wie es für die Bestimmung der Struktur und der inhibitorischen Wirkung erforderlich ist, notwendig, ein geeignetes Expressions- und Reinigungssystem zu entwickeln. Obwohl es inzwischen einige Hinweise auf eine mögliche Prozessierung von LEKTI gibt, ist die natürliche Proteinsequenz der Domäne 15 noch nicht bekannt. Nach Vergleichen mit Kazalvertretern wurde ein 76 Aminosäuren großes Protein (dom15) hergestellt. Wie die strukturelle Charakterisierung ergab, ist dessen COOH-terminaler Abschnitt nicht strukturiert, weswegen eine COOH-terminal verkürzte Variante (dom15kurz) hergestellt wurde, die auch die Auflösung von Mehrdeutigkeiten bei NOE-Kreuzresonanzen erlaubte. Aus den homonuklearen und 15N-editierten NMR-Spektren wurden 887 (dom15kurz) bzw. 908 (dom15) experimentelle Randbedingungen gewonnen, die die Berechnung einer jeweils hochaufgelösten Struktur mit einem RMSD-Wert von 0,5 Å für die schweren Atome des Proteinrückgrats bzw. von 1,0 Å für alle schweren Atome ermöglichten. Beide Varianten zeigen ein typisches Kazal-Strukturmotiv bestehend aus einem dreisträngigen beta- Faltblatt, einer zentralen alpha-Helix und einer exponierten kanonischen Bindungsschleife. Die gegenüber klassischen Kazalvertretern zusätzlichen Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen sind teilweise an der Ausbildung einer weiteren aminoterminalen kurzen Helix und einem hairpin-ähnlichen Motiv beteiligt und so angeordnet, dass der klassische Kazal-Faltungstyp nicht gestört wird. Sowohl die kurze als auch die lange Domäne 15-Variante zeigt eine starke und nicht-temporäre kompetitive Inhibierung von Trypsin und Plasmin bei Werten für die Inhibitionskonstanten im einstelligen nM-Bereich, jedoch keine inhibitorische Wirkung gegenüber Tryptase. Aufgrund des identischen Verhaltens dieser beiden Domäne 15-Varianten gegenüber verschiedenen getesteten Proteinasen ist anzunehmen, dass der COOH-Terminus keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung der LEKTI-Domäne 15 hat. Außerdem wurde in Anlehnung an LDTI eine Variante der Domäne 15 mit nur einer Aminosäure zwischen den ersten beiden Cysteinen (dom15ldti) hergestellt. Nach oxidativer Rückfaltung zeigte dom15ldti ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung gegenüber Trypsin und Plasmin, wie sie auch für dom15 und dom15kurz beobachtet wurde. Dies deutet auf eine starre Bindungsschleife und ein hoch stabilisiertes Proteingerüst hin. Daher wurde ein Strukturmodell für dom15ldti auf Basis der experimentell bestimmten Struktur von dom15kurz erstellt. Reoxidiertes dom15ldti zeigte eine Inhibierung von Chymotrypsin, Elastase und Subtilisin, während dies weder für dom15 noch für dom15kurz beobachtet wurde. Dies lässt darauf schließen, dass der Bereich zwischen den ersten beiden Cysteinen einen Einfluss darauf hat, welche Proteinase inhibiert wird. Aus Überlagerungen der Strukturen von dom15kurz und der Modellstruktur von dom15ldti mit verschiedenen Proteinase-Inhibitor-Komplexstrukturen kann eine sterische Hinderung als mögliche Ursache für das unterschiedliche inhibitorische Verhalten gegenüber verschiedenen Proteinasen abgeleitet werden. Diese Erkenntnis stellt eine mögliche Grundlage für gezielte Veränderungen einer inhibitorischen Selektivität dar. Außerdem erleichtert die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur der LEKTI-Domäne 15 die Suche nach der immer noch unbekannten Zielproteinase.

Synthese, Charakterisierung und Reaktivität von Platin(II)-Komplexen mit Cycloheptatrienylphosphan-Liganden (2005)

Bettina Ullmann

Tri(1-cyclohepta-2,4,6-trienyl)phosphan P(C7H7)3 (1) kann als ein mehrzähniger Ligand fungieren, da es sowohl über das Phosphoratom als auch über die mittlere Doppelbindung der Siebenringe an ein Zentralmetall koordinieren kann. Dabei war in Komplexen, bei denen das Phosphan zweizähnig gebunden ist, dynamisches Verhalten bezüglich der Koordination der Doppelbindung zu beobachten. Deshalb erschienen die NMR-Signale gemittelt und zum Teil sehr breit. Zusätzlich wurde die Reaktivität dieser Komplexe durch die dynamischen Prozesse eingeschränkt. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Cycloheptatrienylphosphane synthetisiert werden, die zweizähnig an das Platin gebunden sind und geringe Dynamik zeigen. Ein Vertreter solcher Phosphane ist das Cycloheptatrienyl(diphenyl)phosphan Ph2P(C7H7) (3), welches über einen optimierten Syntheseweg hergestellt werden konnte. Bei der Darstellung zwei neuer Phosphane, dem MeP(C7H7)2 (6) und dem Me2P(C7H7) (8), wurde genutzt, dass Cycloheptatrienylphosphoniumsalze durch eine reduktive Eliminierung von Tropyliumbromid mit anschließender Umsetzung mit LiAlH4 stets wieder in ein Phosphan zurückgeführt werden können. Deshalb wurde 1 mit Methyliodid versetzt und anschließend ein C7H7-Ring eliminiert. Durch nochmaliges Umsetzen von 6 mit Methyliodid und anschließender Reduktion erhält man das Dimethyl(cycloheptatrienyl)phosphan (8), das nur einen Siebenring enthält und dadurch fest an das Platin koordiniert. MeP(C7H7)2 (6) ist ein anschauliches Beispiel für 1H- und 13C-NMR-Spektren von diastereotopen =CH-Einheiten des Siebenringes. Neben der Verwendung der Phosphane als Liganden wurden sie mit den elementaren Chalkogenen, O, S, Se, zu Chalkogeniden umgesetzt. Um schließlich die Koordinationschemie der drei dargestellten Phosphane 3, 6 und 8 zu untersuchen, wurde (cod)PtCl2 mit dem entsprechenden Phosphan versetzt (12, 14, 15). Dadurch wird cod durch einen Cycloheptatrienylphosphanliganden substituiert. Die Phosphane koordinieren über das Phosphoratom und über die mittlere Doppelbindung des Siebenringes an das Metall. Wie erwartet zeigen die C7H7-Ringe von 3 und 8 keine dynamischen Prozesse in ihren Platinkomplexen. Die Molekülstruktur für 12 wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Dagegen zeigt 14 in den 1H- und 13C-NMR-Spektren wie [(C7H7)2P(C7H7)]PtCl2 (2) nur gemittelte Signale. Wird das Phosphan 3 im zweifachen Überschuss zum (cod)PtCl2 gegeben, wird der Diphosphankomplex mit zwei einzähnig koordinierten Phosphan-Liganden erhalten, welche cis-ständig am Platin gebunden sind. Wie bereits für 2 beschrieben, ist es möglich, den zum Phosphor-Atom cis-ständigen Chloro-Liganden durch eine Alkinylgruppe zu substituieren. Die Umsetzung von 2 mit Me2Sn(CCR)2 bei Raumtemperatur führt interessanterweise zu Di(alkin-1-yl)platin-Komplexen. Vorher mussten diese über eine Zwischenstufe, dem (cod)Pt(CCR)2, dargestellt werden. Der kristalline Komplex 22 wurde mittels Röntgenstrukturanalyse charakterisiert. Für die Reaktionen mit MeLi wurde die Synthese der Komplexe [(C7H7)2P(C7H7)]PtCl(CCR) wiederholt. Dabei konnte für 27 (R = SiMe3) ein Einkristall erhalten werden, der für eine Röntgenkristallstrukturanalyse geeignet war. Der Chloro-Ligand sollte leicht über Substitutionsreaktionen ersetzt werden können. Allerdings wurden mit MeLi nur Produktgemische erhalten, und diese Produkte wurden mithilfe von verschiedenen NMR-Versuchen charakterisiert. Die Produktverteilung zeigt an, dass die Reaktion unter nucleophiler Addition des Methylanions und anschließender Eliminierung von LiCl, MeLi oder LiCCR abläuft, wobei das Letztgenannte dann auch an der Reaktion teilnimmt. Bei der Umsetzung von 27 mit einem Überschuss an MeLi wird ein weiteres Produkt (44) erhalten, welches an der CC-Gruppe methyliert wurde und durch Röntgenstrukturanalyse charakterisiert werden konnte. Die 1,1-Organoborierungsreaktionen der Alkin-1-yl(chloro)platin-Komplexe laufen sehr langsam bis gar nicht ab. Ein möglicher Grund dafür ist, dass der Alkinyl-Rest trans zur Olefin-Einheit steht. Sie übt im Vergleich zum Phosphor-Atom offenbar einen geringeren trans-Einfluss aus und die Pt-C-Bindung ist für die Organoborierungsreaktion nicht hinreichend polar. Aufgrund des höheren trans-Einflusses des Phosphor-Atoms reagieren die Di(alkin-1-yl)platin-Komplexe an der zum Phosphor trans-ständigen Alkinyl-Gruppe mit BEt3. Dabei entstehen mehrere neue Verbindungen, von denen bisher nur wenige charakterisiert werden konnten. Ein solches Produkt ist 21A, für das zahlreiche NMR-Daten vorliegen. Wenn der Alkinyl-Rest mit einer Trimethylsilyl-Gruppe substituiert ist, kommt es zur Bildung zweikerniger Komplexe (22D, 43D), welche interessante NMR-Spektren liefern. Die spektroskopischen Untersuchungen der Umsetzung von 2 mit LiSnMe3 liefern für ein Produkt sehr komplizierte NMR-Spektren, da sich hier vermutlich ein Platin(II)-Komplex (46) mit vier Stannyl- und einem Phosphan-Liganden bildet.

MAS NMR of Nuclei with Spin S=1/2 in Polycrystalline Powders: Experiments and Numerical Simulations (2004)

Matthias Bechmann

The objective of this work is the examination of one-dimensional magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectra. These spectra serve as a source of spin-system parameters which are related to structural and conformational parameters. It is to show that all spin-system parameters can be derived in a robust and reliable manner. Further on it is investigated how experimental conditions can be optimised in order to determine parameters in a stepwise fashion and get best accuracy for the derived data. This work is dealing with dipolar coupled spin S = 1/2 systems in polycrystalline powdered samples. MAS is used in order to increase spectral resolution and achieve gain in signal-to-noise ratio. However, MAS also causes a substantial down scaling of the information content about the anisotropic interactions of a spin system. A technique to remedy this drawback, while keeping the advantages of MAS, is the use of pulse sequences that reintroduce ("recouple") anisotropic dipolar coupling interactions. To access the spin-system parameters encoded in the lineshapes of MAS NMR spectra an iterative fitting approach is applied. These procedures make numerically exact simulations mandatory and involve accurate calculations of the complete spin-system dynamics. As a consequence all spin-system parameters sensitively encoded in the spectral lineshapes can principally be extracted. Computation of numerically exact simulations can be quite demanding on hardware (CPU speed). The algorithmic implementation of the spin dynamics has significant impact on the time required to simulate a spectrum. Optimisation and clever design of such algorithms is crucial especially when considering the need for repeated simulations in the process of iterative fitting. Usually spin-system size and the complexity of the pulse sequence are the principal factors determining the computation time of a spectrum. The numerical strategy adopted here is applied to one- to four-spin systems where the limiting factor is less the size of the spin system but rather the spin-system characteristics themselves. Spin systems composed of one to four spins have been chosen such that a representative range of spin-system parameters is covered. A combination R² and DQF proved to build robust and reliable experiments making all spin-system parameters accessible to an iterative fitting approach in a usually stepwise manner. The numerical simulations used in this approach additionally can serve for optimising existing pulse sequences. This usually results in better experimental spectra due to a better prediction of optimum experimental setup parameters. Such pre-experiment simulations are especially useful when large CSA interactions are present in dipolar coupled spin systems, a scenario not amenable to a complete theoretical description. Numerically exact simulations can also be regarded as an additional way of designing new pulse sequences. However, there is a certain lack of insight in the physical mechanisms of a pulse sequence when obtained by numerical methods only. For the future it would be useful to improve further the techniques of NMR that give complete and accurate information about local structure. This includes dipolar recoupling experiments of improved selectivity like R²-DQF. But when aiming for the ability to handle larger dipolar coupled spin systems it would also be advantageous to exploit pulse sequences that completely suppress the influence of CSA interactions while maintaining/recoupling the information about dipolar interactions. Further it is important to vary the information content of the spectra, a task for which e.g. OMAS experiments could be used.

Regulation der Transkription: Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen der carboxyterminalen Domäne von E.coli NusA (2005)

Anke Eisenmann

Die RNA-Synthese in der Zelle wird durch RNA Polymerasen (RNAPs) katalysiert und erfolgt in einem Zyklus aus Initiation, Elongation und Termination. In den letzten Jahren konnten durch die Aufklärung von Kristallstrukturen elongierender RNAPs vor allem Fortschritte im Verständnis der Elongationsphase erzielt werden, so daß die Elongation derzeit ein attraktives Forschungsgebiet darstellt. Während der Elongation bildet die RNAP einen stabilen Komplex mit DNA und RNA, der als Transkriptionselongationskomplex (TEC) bezeichnet wird, und über Tausende von Basenpaaren prozessiv ist, das heißt nicht dissoziiert. Lediglich an bestimmten DNA-Elementen, sogenannten Terminatoren, kann der TEC soweit destabilisiert werden, daß die Transkription beendet werden kann. Die Effizienz der Termination wird dabei durch Transkriptionsfaktoren reguliert. In E.coli wird die Entscheidung Elongation-versus-Termination an einem Terminator durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor NusA beeinflußt. NusA assoziiert während der Elongation mit dem TEC und fördert sowohl Pausen während der Transkription als auch die Termination. Dagegen wirkt NusA zusammen mit dem viralen Antiterminator-Protein lambda N selbst als Antiterminator und setzt die Terminationseffizienz herab. Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen bakteriellen NusA-Proteinen sowie biochemische Daten weisen darauf hin, daß NusA aus drei funktionellen Domänen besteht. Dabei wechselwirkt die aminoterminale Domäne mit den großen Untereinheiten der RNAP während die zentrale Domäne RNA-Interaktionen vermittelt. Die ungefähr 160 Aminosäuren umfassende carboxyterminale Domäne, NusACTD, ist nur in einigen NusA-Proteinen vorhanden. NusACTD ist auffallend negativ geladen und enthält eine Sequenzwiederholung. Für den konservierten aminoterminalen und zentralen Bereich von NusA wurden die Strukturen von T.maritima und M.tuberculosis mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Eine hochaufgelöste Struktur für NusACTD konnte dagegen erst in dieser Arbeit mit NMR-Spektroskopie gewonnen werden. NusACTD besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen NusA(353-416) (AR1)und NusA(431-490) (AR2), die ungefähr den zwei homologen sauren Sequenzbereichen entsprechen. Mit 15N-Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, daß die Domänen über eine flexible Linkerregion verbunden sind und keine definierte Orientierung zueinander einnehmen. Jede der Domänen weist fünf Helices auf, die eine (HhH)2-Faltung annehmen. Charakteristisch für die (HhH)2-Faltung sind jeweils zwei gegeneinander gepackte HhH-Motive, die zusammen mit der Verbindungshelix zwischen den Motiven einen kompakten hydrophoben Kern bilden. (HhH)2-Faltungen kommen häufig als selbständige Domänen vor, die DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. E.coli NusACTD wechselwirkt mit dem viralen lambda N-Protein sowie der carboxyterminalen Domäne der alpha Untereinheit der RNAP (alpha CTD). Zudem reguliert NusACTD die RNA-Bindung an die zentrale Domäne von NusA, indem es selbst mit den RNA-Bindungsstellen interagiert. Trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit erkennen AR1 und AR2 lambda N und alpha CTD auf unterschiedliche Art und Weise. In dieser Arbeit durchgeführte Titrationsexperimente weisen darauf hin, daß alpha CTD ausschließlich an AR2 bindet, während lambda N wahrscheinlich nur mit AR1 spezifische Kontakte ausbildet. Die Wechselwirkung von alpha CTD mit NusA ermöglicht in vitro eine RNA-Bindung an NusA. Es ist daher anzunehmen, daß AR2 eine autoinhibitorische Funktion besitzt. Zusätzlich scheinen die Wechselwirkungen von NusACTD und alpha CTD zur Stabilisierung der RNAP-NusA-Interaktion beizutragen. Die antiterminatorische Wirkung von lambda N beruht auf einer direkten Interaktion zwischen der RNAP und einer Region von lambda N außerhalb der NusA-Bindungsregion. Die lambda N-NusA-Wechselwirkung steigert die Antiterminationseffizienz von NusA wahrscheinlich über eine Stabilisierung der schwachen RNAP-lambda N-Interaktion. Der Vergleich der Struktur von AR1 im ungebundenen Zustand mit der kürzlich gelösten Röntgenkristallstruktur des NusA(350-424)-lambda N(34-47)-Komplexes unterstützt die Hypothese, daß die NusA-lambda N-Wechselwirkung nicht direkt am Mechanismus der Antitermination beteiligt ist, da nur geringe konformationelle Änderungen durch die Komplexbildung beobachtet werden. Insgesamt stellt NusACTD über seine beiden (HhH)2-Module eine vielseitige Interaktionsfläche bereit, die möglicherweise Bindungsstellen für weitere Proteine neben alpha CTD und lambda N bietet. Die Trennung der Domänen über eine mobile Linkerregion ermöglicht eine Anpassung an konformationelle Veränderungen in der TEC-Struktur, die zum Beispiel beim Übergang des TEC von einem Elongations- in einen Antiterminationszustand auftreten können. Die flexible Verbindung zwischen den Domänen ist zudem für den Mechanismus der Autoinhibition wichtig, da bei der Bindung von NusA an den TEC die RNA Zugang zu den Bindungsstellen erhält.

Komplexe des Prion Proteins mit antiprional wirksamen Substanzen (2008)

Christian Mangels

Prionerkrankungen gehören zur Klasse der neurodegenerativen Erkrankungen, in deren Verlauf sich das Prion Protein (PrP) von einer zellulären in eine pathogene Konformation umwandelt. Sie verlaufen letal und eine Therapie ist trotz intensiver Forschung bisher nicht verfügbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Interaktionsflächen von zellulärem Prion Protein (PrPc) mit möglichen Wirkstoffen strukturell zu beschreiben. Die hierzu untersuchten Peptide und kleinen organischen Verbindungen, welche als antiprionwirksam beschrieben worden sind, interagierten aber nicht oder nur in einem Maß, welches eine detaillierte Strukturuntersuchung nicht ermöglicht hätte. Hingegen konnte gezeigt werden, dass der organische Wirkstoff 293G02, der an die Scrapie-Form des Prion Proteins bindet, auch mit PrPc interagiert. Für die physiologisch relevante und auch krankheitsassoziierte Oktarepeat-Region (4OR) war bekannt, dass diese kupferabhängig an PrP binden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein NMR-Schnelltest modifiziert, um die Versuchsbedingungen für NMR-Interaktionsstudien von PrP und 4OR zu optimieren. Trotz Verwendung eines gut löslichen Fusionspartners konnten NMR-Studien wegen mangelnder Löslichkeit im relevanten pH-Bereich nicht erfolgen. Es gelang aber, Bedingungen zu finden, unter denen Kristalle mit gebundenem Kupfer für die Röntgenstrukturanalyse präpariert werden konnten. Schwerpunkt dieser Arbeit war die strukturbiologische Charakterisierung des therapeutisch aktiven Einzelstrangantikörpers W226. Dieser bindet an Helix 1 aus PrPc mit nanomolarer Dissoziationskonstante und kann persistent scrapieinfizierte Zellkulturen heilen. Anhand verschiedener biophysikalischer Methoden, insbesondere Fluoreszenz- und NMR-Spektroskopie, wurden das Epitop und die entsprechende Bindungsstelle am Antikörper untersucht. Für das Epitop konnten die Positionen Y145, R148 und E152 mittels eines fluoreszenzbasierten Alanin-Scans als essenziell bestimmt werden. Diese bilden unter Einbezug benachbarter Positionen ein strukturelles Epitop, welches durch seine Dichte von geladenen und polaren Gruppen besticht. Die Daten implizieren eine, auf der Abschirmung von für die Umfaltung relevanten Positionen beruhende, antiprionale Wirkung. Trotz der für die NMR-Spektroskopie anspruchsvollen Größe von 33 kDa konnten für den scFv W226 alle relevanten mehrdimensionalen Spektren aufgenommen und so eine strukturelle Charakterisierung vorgenommen werden. Möglich wurde dies durch die Kombination verschiedener Markierungsmethoden, die eine Dreifachmarkierung und die mehrfache aminosäurespezifische selektive Markierung einschloss. Ergänzend wurden Messungen zur Bestimmung oberflächenexponierter Positionen mittels einer löslichen, paramagnetischen Spinsonde durchgeführt. Alle Messungen wurden jeweils in Ab- und Anwesenheit des Epitops durchgeführt. W226 besitzt im Bereich der variablen Regionen einige für Antikörper relativ große Schleifen, die im freien Zustand zu internen Bewegungen auf der mittleren NMR-Zeitskala führen, welche in weiterer Folge eine eindeutige Zuordnung im epitopbindenden Bereich mit den heteronuklearen 3D-NMR-Spektren verhinderten. Dennoch konnten 144 von 311 Resten eindeutig zugeordnet werden. Diese liegen in zusammenhängenden, strukturbildenden Bereichen des Antikörperfragments rund um das Paratop und erlaubten die Verifizierung von Homologiemodellen. Mittels deutlich empfindlicheren zweidimensionaler 15N-Korrelationsspektren des freien und epitopgebundenen Zustands in Kombination mit ausgewählten aminosäuretypselektiv 15N-markierten Proben, die mit Hinblick auf die Verteilung bestimmter Aminosäuretypen in den variablen Bereichen des Antikörperfragments erfolgte, konnte anhand mehrdeutiger Zuordnungen gezeigt werden, dass alle sechs variablen Schleifen zur Bindung des Epitops beitragen, wobei die variable Schleife 3 der leichten Kette nur einen untergeordneten Beitrag leistet. In Verbindung mit den gegen die NMR-Daten verifizierten Homologiemodellen und dem zuvor bestimmten strukturellen Epitop konnten diese Informationen in Docking-Simulationen verwendet und ein erstes Modell für den Komplex aus W226 und PrPc erstellt werden. Helix 1 bindet dabei parallel in eine Furche, die aus den variablen Schleifen gebildet wird. Somit wird eine große Kontaktfläche geschaffen, die Wechselwirkungen zwischen aromatischen und polaren Resten, sowie Salzbrücken zwischen Antikörper und Antigen aufweist. Das Modell unterstützt den hier vorgeschlagenen Mechanismus für die antiprionale Wirksamkeit, nämlich der Abschirmung von für die pathogene Konformationsumwandlung wichtigen Resten in PrPc. Gleichzeitig bildet es die Grundlage für Protein-Engineering am Antikörper zur weiteren Verbesserung der Bindungskonstante von W226. Es ermöglicht auch Studien zum Design kleiner organischer Wirkstoffmoleküle, welche an Helix 1 binden und dabei die Kontaktoberfläche der epitopbindenden Regionen aus W226 imitieren.

Struktur, Funktion und Allergenität Bet v 1-homologer Proteine: Das Allergen Gly m 4 und das Enzym Norcoclaurin-Synthase (2009)

Hanna Berkner

In Nord- und Mitteleuropa wird ein beträchtlicher Teil der Pollen- und Nahrungsmittelallergien bei Erwachsenen durch allergene Proteine aus der Bet v 1-Familie ausgelöst, die nach dem Hauptbirkenpollenallergen benannt ist. Die Bet v 1-Familie wird in die Klasse 10 der pathogenesis-related proteins (PR10-Proteine) eingeordnet. Die PR10-Proteine spielen eine Rolle im „Immunsystem“ der Pflanze, wobei die genaue physiologische Funktion dieser Proteine bis heute nicht bestimmt werden konnte. Die strukturelle Untersuchung der Mitglieder der Bet v 1-Familie kann nicht nur neue Erkenntnisse bezüglich ihrer physiologischen Funktion erbringen, sondern stellt auch eine wichtige Voraussetzung für die Herstellung hypoallergener Proteinvarianten zur Verwendung in der Immuntherapie dar. Bisher konnten die Strukturen dreier verschiedener Bet v 1-Allergene gelöst werden, die alle die typische Bet v 1-Faltungstopologie aufweisen: ein siebensträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt und zwei kurze V-förmig angeordnete alpha-Helices, die zusammen mit einer langen C-terminalen alpha-Helix einen hydrophoben Hohlraum umschließen. Die in dieser Arbeit mittels magnetischer Kernspinresonanz-(NMR-)Spektroskopie im Detail bestimmte Struktur des Bet v 1-Homologs Gly m 4 aus der als Nahrungsmittelzusatz verwendeten Sojabohne gehört ebenfalls diesem Faltungstyp an. In einigen strukturellen Einzelheiten aber zeigt Gly m 4 größere Ähnlichkeit zu drei PR10-Proteinen aus der gelben Lupine als zu Bet v 1. Die Ergänzung der gewonnenen strukturellen Informationen durch immunologische Daten ermöglichte die Lokalisierung von vier potentiellen kreuzreaktiven IgE-Epitopen auf der Oberfläche von Gly m 4, welche die molekulare Grundlage für Kreuzallergien auf Birkenpollen und Sojaprodukte darstellen. Auch die enzymatisch aktiven (S)-Norcoclaurin-Synthasen (NCS) zeigen Sequenzähnlich-keiten mit Bet v 1, jedoch in wesentlich geringerem Maße als die „klassischen“ Bet v 1-Allergene. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Kombination von Circulardichroismus- und NMR-Spektroskopie mit der Methode der Homologiemodellierung ein semi-experimentelles Strukturmodell der NCS aus der Alkaloid-produzierenden Pflanze Thalictrum flavum konstruiert werden. Anhand dieses Modells konnte gezeigt werden, dass auch die NCS die typische Bet v 1-Faltungstopologie aufweist, wobei jedoch die C-terminale alpha-Helix in drei Abschnitte unterteilt ist. Erst kürzlich wurde das Modell weitgehend durch die Kristallstruktur des Proteins bestätigt. Die NCS ist somit ein echtes Mitglied der Bet v 1-Superfamilie, in der sie im Hinblick auf ihre bekannte physiologische Funktion eine Ausnahme darstellt. Sie katalysiert einen wichtigen Schritt in der Synthese pharmakologisch aktiver Sekundärmetabolite, die Kondensation von 4-Hydroxyphenylacetaldehyd und Dopamin zu (S)-Norcoclaurin. Anhand von NMR-Titrationsexperimenten mit Substrat bzw. Substratanalogon und Untersuchung des Oligomerisierungszustands in An- und Abwesenheit der Substrate konnten erste Einblicke in das aktive Zentrum des Enzyms und dessen Reaktionsmechanismus gewonnen werden. Aktivitätstests mit Bet v 1 zeigten, dass das Hauptbirkenpollenallergen hingegen nicht in der Lage ist, die NCS-Reaktion zu katalysieren. Bezüglich des Nutzens der NCS für die Erforschung kreuzreaktiver Epitope stellt das Enzym aufgrund seiner im Zuge dieser Arbeit ermittelten strukturellen und immunologischen Eigenschaften einen interessanten Kandidaten für das sogenannte Epitope grafting dar. Ziel dieser Methode ist es, eine bestimmte Bindungsstelle eines Proteins auf ein anderes Protein zu übertragen. In diesem Fall soll mit dem Ziel der detaillierten Charakterisierung der Antikörper-Bindungsstelle ein potentielles IgE-Epitop von Bet v 1 auf die strukturell sehr ähnliche, aber kaum kreuzreaktive NCS übertragen werden.

Foamy Virus Enzymes - Activity, Regulation and Resistance (2010)

Maximilian Hartl

Foamy viruses or spumaretroviruses belong to the family of retroviridae but differ in several aspects from other retroviruses (orthoretroviruses). Viral particles contain DNA not RNA. The Pol protein, the precursor of the viral enzymes, is translated from a separate mRNA independently of the capsid and matrix proteins. The protease remains covalently bound to the reverse transcriptase, while in orthoretroviruses the protease is cleaved off autocatalytically. Thus, in mature spumaretroviruses a protease-reverse transcriptase protein (PR-RT) with three different catalytic activities is found: proteolysis, DNA polymerization and RNase H activity. In this work, the recombinant PR-RTs from the prototype foamy virus and a simian foamy virus isolate from macaques were purified and compared. The biophysical and enzymatic properties of the two enzymes were similar. However, their behavior towards the nucleoside inhibitor azidothymidine is different. This nucleoside analog inhibits the replication of foamy viruses by terminating polymerization. Prototype foamy virus was not able to develop resistance against azidothymidine, but we succeeded in the generation of an azidothymidine-resistant simian foamy virus. Up to four mutations within the reverse transcriptase were found to be necessary to confer high resistance against azidothymidine. To characterize the mechanism of resistance, the corresponding recombinant PR-RTs were investigated in vitro. The data reveal that the azidothymidine resistance is based on the excision of the incorporated inhibitor in the presence of ATP. Retroviral proteases are only active as homodimers. In this work, analysis of the PR-RT of prototype foamy virus and simian foamy virus isolated from macaques by analytical ultracentrifugation and size exclusion chromatography indicate, that foamy virus proteases are stable and inactive monomers in solution. The three-dimensional structure of the simian foamy virus protease domain was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy and revealed the typical folding of a monomer subunit of retroviral proteases. Furthermore, nuclear magnetic resonance analysis by paramagnetic relaxation enhancement suggested the formation of transient protease homodimers under native conditions. Finally, it is shown that polypurine rich sequences of the foamy virus RNA are able to activate protease activity. Chemical analysis of the secondary structure of these RNA sequences indicated a characteristic hairpin loop structure. Retardation and protein crosslinking experiments prove the formation of stable PR-RT dimers in the presence of the polypurine RNA sequences. Based on these in vitro data we propose a model for foamy virus assembly.

Warten auf die Transkription: Die humanen Elongationsfaktoren NELF und DSIF (2009)

Sabine Wenzel

Die humanen Elongationsfaktoren negative elongation factor (NELF) und 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) sind Schlüsselfaktoren beim promotorproximalen Arretieren in der frühen Elongationsphase der Transkription. Dabei interagieren beide Faktoren direkt mit RNA-Polymerase II. NELF bindet über die RNA recognition motif (RRM)-Domäne der Untereinheit E zusätzlich an die naszierende RNA. Eine derartige Transkriptionsblockade tritt auch während der Transkription des Genoms des humanen Immunschwächevirus 1 (HIV-1) Provirus auf. NELF bindet hierbei an die Haarnadel-Struktur der naszierenden RNA (HIV-1 TAR RNA). Ein Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Analyse der RRM-Domäne von NELF E sowie die Untersuchung einer möglichen sequenzspezifischen Bindung von NELF E RRM an HIV-1 TAR RNA. Außerdem galt es, die Struktur der kleinen Untereinheit von DSIF, hSpt4, zu bestimmen und ihre Interaktion mit der NGN-Domäne der großen DSIF-Untereinheit hSpt5 näher zu charakterisieren. Die Struktur der RRM-Domäne von NELF E wurde mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) bestimmt (PDB: 2BZ2) und besteht aus einem viersträngigen Faltblatt mit zwei alpha-Helices, die gegen eine Seite des Faltblattes packen. An der RNA-Bindung sind die zentralen beta-Stränge mit den beiden aromatischen Resten Tyr43 und Phe77 aus dem Konsensussequenzmotiv ribonucleoprotein domain 2 (RNP2) bzw. RNP1 involviert. Der in der freien Form unstrukturierte C-Terminus der RRM bildet in der gebundenen Form (PDB: 2JX2) eine 3-10-Helix aus, die höchstwahrscheinlich direkt an der RNA-Bindung beteiligt ist. RRM-Domänen gelten als klassische einzelstrangbindende Domänen. Die prognostizierte Bindestelle von NELF E ist jedoch die doppelsträngige HIV-1 TAR RNA Stammregion. Die durchgeführten 15N-NMR-Titrationsexperimente und Fluoreszenzgleichgewichtstitrationen mit die HIV-1 TAR RNA umfassenden RNA Oligonukleotiden zeigten, dass NELF E RRM präferentiell einzelsträngige RNA bindet. Die ermittelten KD-Werte lagen dabei alle im niederen mikromolekularen Bereich. NELF E RRM zeigt somit im Vergleich zu anderen RRM-Domänen eine schwächere Affinität für RNA. Eine sequenzspezifische Bindung an die HIV-1 TAR RNA konnte, auch in Versuchen mit der gesamten NELF E Untereinheit, nicht beobachtet werden. Vieles deutet somit darauf hin, dass RNA-Bindung durch NELF E sequenzunabhängig stattfindet. Der Zeitpunkt der RNA-Bindung während der Elongation der Transkription wird womöglich durch andere Faktoren bzw. Ereignisse gesteuert. NELF übt seine inhibitorische Wirkung nur im Zusammenspiel mit dem Elongationsfaktor DSIF aus, über den es nur wenig strukturelle Informationen gibt. Die Koexpression von hSpt4 mit der NusG N-terminalen Homologie Domäne von hSpt5 (hSpt5-NGN) als dessen Interaktionspartner ermöglichte die Bestimmung der Kristallstruktur von hSpt4/hSpt5-NGN bis zu einer Auflösung von 1.55 Å (PDB: 3H7H). hSpt5-NGN besteht aus einem zentralen, viersträngigen Faltblatt und aus einzelnen Helices, die von beiden Seiten gegen das Faltblatt packen. hSpt4 verfügt über ein zwei- und ein dreisträngiges Faltblatt, die senkrecht zueinander angeordnet sind und sich auf der Interaktionsfläche zugewandten Seite befinden. Zusätzliche helikale Elemente werden durch den ausgebildeten Zinkfinger fixiert. Die Komplexstruktur ist von einem zentralen sechssträngigen intermolekularen beta-Faltblatt geprägt. hSpt4/hSpt5-NGN zeigt sehr große Strukturähnlichkeit zur kürzlich publizierten homologen Komplexstruktur von Spt4/Spt5-NGN aus S. cerevisiae. Ein für die Bindung essentieller Glutamatrest (E338) von Spt5-NGN ist auch in hSpt5-NGN konserviert (E228). Der Komplex hSpt4/hSpt5-NGN(E228Q) konnte wegen der Unlöslichkeit von hSpt5-NGN(E228Q) nicht gereinigt werden. Dies deutet an, dass die Interaktion zwischen hSpt4 und hSpt5-NGN(E228Q) gestört ist. Somit ist E228 von hSpt5-NGN höchstwahrscheinlich ebenso essentiell für die Wechselwirkung mit hSpt4 wie im homologen Hefekomplex. hSpt5-NGN hat auch strukturelle Ähnlichkeiten zur N-terminalen Domäne (NTD) des bakteriellen Transkriptionsfaktors NusG. E. coli (Ec)NusG-NTD verfügt an der Position des Glutamatrestes über einen Glutaminrest (Q72). hSpt4-Bindung an EcNusG-NTD bzw. EcNusG-NTD(Q72E) wurde jedoch nicht beobachtet. Ein möglicher Grund dafür ist die unterschiedliche Ladungsverteilung an der hSpt4-Bindungsfläche. hSpt4 besitzt hingegen Ähnlichkeiten zum archaealen Transkriptionsfaktor RpoE‘‘. Überlagerung der Strukturen von hSpt4 und RpoE‘‘ aus P. furiosus (PDB: 1RYQ) zeigten, dass beide den Zinkfinger und die senkrecht zueinander angeordneten Faltblätter gemein haben. Strukturbestimmung sowie funktionelle Analyse von NELF E RRM und hSpt4/hSpt5-NGN repräsentieren somit einen weiteren Schritt auf dem Weg zur Entschlüsselung der komplexen zellulären Vorgänge während der eukaryontischen Transkription.

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