OPUS 4 | Chemie

Strukturbestimmung von Birkenpollenallergenen und birkenpollenassoziierten Nahrungsmittelallergenen mit NMR-Spektroskopie (2003)

Philipp Neudecker

Das 17,4kDa schwere Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 ist bei mehr als 90% der Birkenpollenallergiker für die Bindung der IgE-Antikörper verantwortlich, und IgE-Kreuzreaktionen mit verwandten Proteinen wie Pru av 1 (früher Pru a 1) aus Kirschen, Gly m 4 (ursprünglich SAM22) aus Sojabohnen und Api g 1 aus Sellerie verursachen bei bis zu 70% dieser Patienten allergische Reaktionen auf Nüsse, Obst oder Gemüse. Die molekulare Grundlage für die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Pru av 1 stellt die fast vollständige Identität ihrer Tertiärstrukturen dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten NMR-spektroskopischen Untersuchungen erbrachten den experimentellen Nachweis, dass der ungewöhnlich große hydrophobe Hohlraum im Innern von Pru av 1 mit Steroiden wechselwirkt. Modellierungen zeigten, dass der Hohlraum groß genug für zwei Steroidmoleküle ist, und erlaubten die Vorhersage der Komplexstruktur. Die Konformation des Proteinrückgrats von Pru av 1 wt ist in der hochaufgelösten dreidimensionalen Struktur der weniger IgE-reaktiven Mutante Pru av 1 E45W in Lösung konserviert, was zeigt, dass die Seitenkette von Glu45 an einem kreuzreaktiven IgE-Epitop beteiligt ist. Dementsprechend wurde die IgE-Bindung an Api g 1.0101 durch die Mutation K44E erhöht. Der fast vollständige Verlust der IgE-Bindung an Pru av 1 S112P ist die Folge einer Zerstörung der Tertiärstruktur. Weder die Mutation S112A noch die Deletion der COOH-terminalen Reste 155-159 beeinflusste die IgE-Bindung an Pru av 1. Die P-Schleife um Glu45 erklärt somit teilweise das klinisch beobachtete IgE-Kreuzreaktionsmuster und ortsgerichtete Mutagenese von Glu45 stellt einen Ansatz zur Entwicklung hypoallergener Varianten für die spezifische Immuntherapie dar. Als Ausgangspunkt zur Schließung der strukturellen Lücke zwischen der konstitutiv exprimierten Bet v 1-Familie von Allergenen und der verwandten stressinduzierten PR-10-Familie von mit Krankheitsbefall zusammenhängenden Proteinen wurde der Großteil der 1H-, 13C- und 15N-Resonanzen des stressinduzierten PR-10-Proteins Gly m 4 zugeordnet und eine Reihe von NOESY-Spektren aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen, skalaren und dipolaren Kopplungskonstanten bestätigen ein auf der Grundlage von Pru av 1 und Bet v 1 erstelltes Homologiemodell, so dass die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Gly m 4 ebenfalls auf einer praktisch identischen Tertiärstruktur beruht. Zwischen 5% und 20% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 9,4kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 4, ein Ca2+-bindendes Polcalcin. Wegen der hohen IgE-Kreuzreaktivität der Polcalcine sind viele Patienten auf Pollen verschiedenster Pflanzen polysensibilisiert. Die mit mehrdimensionaler heteronuklearer NMR-Spektroskopie bestimmte hochaufgelöste dreidimensionale Struktur von holo Bet v 4 zeigt ein kanonisches EF-Hand-Paar in der offenen Konformation. Die hochkonservierte polcalcinspezifische amphipatische COOH-terminale a-Helix deckt lediglich einen Teil der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche von holo Bet v 4 ab. Anders als das Polcalcin Phl p 7 aus dem Wiesenlischgras, für das vor kurzem eine durch Domain Swapping entstandene dimere Struktur nachgewiesen wurde, zeigen die hydrodynamischen Parameter aus NMR-Relaxation, NMR-Translationsdiffusion und analytischer Ultrazentrifugation, dass sowohl apo als auch holo Bet v 4 vorwiegend monomer sind. Die geringere Dispersion der chemischen Verschiebungen und der etwas größere hydrodynamische Radius von apo Bet v 4 weisen auf eine reversible Änderung der Struktur bei Ca2+-Bindung hin, was die geringere IgE-Bindungsfähigkeit von apo Bet v 4 erklärt. Trotz ihrer unterschiedlichen Oligomerisierungszustände sind die Tertiärstrukturen von holo Bet v 4 und holo Phl p 7 bemerkenswert ähnlich, was eine zwanglose Erklärung für die IgE-Kreuzreaktivität liefert. Zusammen mit der engen strukturellen Homologie zu Calmodulin und der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche weist diese Änderung der Struktur eher auf eine regulatorische denn eine Ca2+-Speicherfunktion für Bet v 4 hin. Etwa 12% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 34,2kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 6 (früher Bet v 5), das hochgradig IgE-kreuzreaktiv mit Pyr c 5 aus Birnen ist. Die Tertiärstruktur dieser Phenylcoumarin-Benzylether-Reduktasen ist noch unbekannt. Die homonuklearen NMR-Spektren von Pyr c 5 zeigen eine ausgezeichnete Dispersion der chemischen Verschiebungen, was auf eine gemischte a/b-Sekundärstruktur hindeutet. Der Ausschluss vernachlässigbarer Terme durch Einführung eines geeigneten Grenzwerts sparte einen erheblichen Teil der durch die Verwendung des gaußförmigen Datenbank-Potentials verursachten Zunahme des Rechenzeitbedarfs der Strukturberechnung dieser Allergene ein, ohne die Qualität der resultierenden Strukturen zu beeinträchtigen. Außerdem wurden mehrere Inkonsistenzen in der Standardparametrisierung der kovalenten Geometrie des Kraftfelds beseitigt.

Mechanismen molekularer Erkennung: Charakterisierung der molekularen Details der Wechselwirkungen des herpesviralen Tip-Proteins mit SH3-Domänen (2005)

Finn Bauer

Die Wechselwirkungen des Tip-Proteins aus Herpesvirus saimiri mit der T-Zell-spezifischen Kinase Lck sind entscheidend für die Aktivierung der Kinaseaktivität und nehmen somit eine zentrale Rolle bei der T-Zell-Transformation ein. Bis heute war es weder durch Röntgenkristallografie, noch durch NMR-Spektroskopie möglich, eine hochaufgelöste Struktur des LckSH3-Tip-Komplexes zu erhalten. Eine Möglichkeit dieses Probleme zu lösen, ist die Verwendung von stärker bindenden Interaktionspartnern, die sich oft besser für strukturelle Studien eignen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit sowohl der Komplex von Tip mit LynSH3 charakterisiert, als auch eine Punktmutante (P17G) der LckSH3 entworfen, die eine höhere Affinität zu Tip aufweist. Die Strukturinformationen, die aus der Charakterisierung dieser Systeme erhalten werden konnten, sollten als Basis für eine zuverlässige Modellierung des LckSH3-Tip-Komplexes dienen. Analysen ergaben, dass die im Vergleich zur LckSH3 erhöhten Ligandenaffinitäten von LynSH3 und LckSH3_P17G auf unterschiedlichen Mechanismen basiert. Die im Vergleich zur wildtyp LckSH3 um nahezu eine Zehnerpotenz stärkere Bindung von LckSH3_P17G konnte durch schnellen Mischmethoden zumindest teilweise auf eine schnellere Komplexbildung zurückgeführt werden. Eine detaillierte Erklärung dieses Unterschieds auf struktureller Ebene konnte durch Moleküldynamiksimulationen des Wildtyps und der Mutante der LckSH3 erhalten werden. So korreliert die schnellere Komplexbildung der Mutante gut mit einer stärkeren Population der 'bindungsaktiven' Konformation während des Simulationszeitraums. Dabei zeichnet sich LckSH3_P17G nicht nur durch eine erhöhte konformationelle Abtastrate der 'bindungsaktiven' Konformation aufgrund gesteigerter RT-Schleifenflexibilität aus, sondern zeigt eine Zunahme der Gesamtflexibilität der SH3-Domäne im ps-s-Bereich auf. Weiterhin konnten durch die Analyse der thermischen Entfaltung mittels CD-Spektroskopie und MD-Simulationen eine globale Destabilisierung und ein veränderter Entfaltungsweg für die P17G-Mutante der LckSH3 gezeigt werden. Der LynSH3-Tip-Komplex konnte in hoher Auflösung mittels NMR-Spektroskopie bestimmt werden. Analysen der Komplexstruktur ergaben, dass nicht nur die Prolinhelix, sondern auch zusätzliche COOH-terminal flankierende Reste des Liganden an der Bindung beteiligt sind. Eine besondere Rolle nimmt dabei L186 ein. Es bindet in eine hydrophobe Tasche aus H41, W44 und F57 auf der Oberfläche der LynSH3. Ausgehend von der LynSH3-Tip-Komplexstruktur konnte unter der Einbeziehung NMR-spektroskopischer Daten der LckSH3-Tip-Wechselwirkungen ein molekulares Modell des LckSH3-Tip-Komplexes erstellt werden. Obwohl die Bindung von L186 in die hydrophobe Tasche auf der Oberfläche für beide SH3-Domänen experimentell nachgewiesen werden konnte, zeigten Fluoreszenztitrationsexperimente mit einem verkürzten Tip-Peptid, dass L186 aus Tip nur im Komplex mit LynSH3 einen signifikanten Einfluss auf die Affinität hat. Weitere Untersuchungen ergaben, dass L186 bei Bindung in die hydrophobe Tasche der LynSH3 nahezu vollständig von H41 bedeckt wird. Das Serin an strukturell ähnlicher Position in LckSH3 bedeckt hingegen nur einen kleinen Teil von L186. Die zusätzlichen Wechselwirkungen senken die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation des Komplexes, was in guter Übereinstimmung mit dem unterschiedlichen Austauschverhalten auf der NMR-Zeitskala steht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit neben der Aufklärung der molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen der LckSH3 mit dem herpesviralen Tip-Protein gezeigt werden, dass Affinität auch bei sehr nahe verwandten Proteinen auf unterschiedliche Weise erzielt werden kann. Weiterhin unterstreichen die Ergebnisse dieser Arbeit die Notwendigkeit der gleichzeitigen Charakterisierung der Struktur und Dynamik makromolekularer Interaktionen. Erst dieses kann zu einem detaillierteren Verständnis der Mechanismen molekularer Erkennung und darauf aufbauend zukünftig zu verlässlicheren Vorhersagen von molekularen Interaktionen führen.

NMR Studies on Termination/- Antitermination Complexes of HIV-1 Transcription (2006)

Nageswara Rao Jampani

After HIV enters the host cell the viral RNA is reverse transcribed into double stranded DNA and then integrated into the host genome. At this step, transcription of HIV RNA by Rpol II is tightly regulated by several cellular factors including NELF, DSIF, and pTEFb, and the virus encoded Tat protein. The work presented in this thesis is mainly focussed on understanding the mechanism of termination and antitermination of HIV-1 transcription. Some of the cysteines in the wild type HIV-1 Tat are required for the Zn2+ dependent interaction with pTEFb, but not needed for the binding of TAR RNA in vitro. These cysteines are readily oxidised and leading to the protein aggregation. Thus, a mutant, Tat-Cys-, lacking all cysteines was used for binding studies with TAR RNA. 1H-15N HSQC and 1H-1H TOCSY spectra were measured to monitor the interaction between Tat-Cys- and TAR RNA. The results presented indicate Tat-Cys- is binding to TAR RNA around the bulge region and is able to induce a conformational change in TAR RNA. This is further supported by observing a change in the CD signal at 265 nm upon addition of Tat-Cys- to TAR RNA. {1H}-15N steady state NOE experiments showed that the core region of Tat remains unstructured even in the complex with TAR RNA. Based on the NMR and CD spectroscopic data presented in this thesis, and data published by others it is tempting to speculate that the core and basic regions of Tat-Cys- remain unstructured upon binding to TAR RNA. Furthermore, the solution structure of the RNA binding domain of NELF-E, NELF-E RRM, was determined using multidimensional NMR spectroscopy. The data reveal that the structure of NELF-E RRM exhibits a babbab topology. The atomic coordinates were deposited in the protein data bank (pdb) under the accession code 2BZ2. RNA binding studies were performed with TAR RNA and various oligoribonucleotides. NMR studies with NELF-E RRM:TAR complexes indicate NELF-E RRM binds to various RNAs in a very similar manner but with different affinities. Mapping of chemical shift perturbations on the structure of NELF-E RRM indicate that the RNA binding interface is mainly located on the b-sheet surface. Large chemical shift perturbations are observed for the residues located in the flexible C-terminal region of NELF-E RRM and in the loop between b3 and a2. Among the various RNAs tested, TAR49-57 displayed the highest affinity to NELF-E RRM. Further structural characterisation of the NELF-E RRM:TAR49-57 complex revealed that the C-terminal region of NEFL-E RRM adopts a small 310 helix around the b3-a2 loop and is stabilised by several hydrophic interactions. The C-terminal region of NELF-E RRM in the RNA bound conformation is very close to the RNA binding interface and could be involved in the RNA binding. However, further structural characterisation of NELF-E RRM in the complex with RNA will be needed to fully understand the mechanism of RNA recognition.

Die Regulation der prokaryontischen Transkription auf molekularer Ebene (2008)

Stefan Josef Prasch

In Escherichia coli wird die RNA-Synthese durch eine aus fünf Untereinheiten bestehende RNA Polymerase (RNAP) katalysiert. Für die Bildung der Phosphodiesterbindung in der RNA sind die beta- und beta’-Untereinheiten verantwortlich. Die aminoterminalen Domänen der beiden alpha-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau zuständig, während die durch einen flexiblen Linker verbundenen carboxyterminalen Domänen (alphaCTD) regulatorische Aufgaben erfüllen. Die zuletzt entdeckte omega-Untereinheit fördert ebenso den Aufbau, ist aber für das Überleben von Escherichia coli nicht notwendig. Der Ablauf der Transkription wird begrifflich in die Initiation, Elongation und Termination eingeteilt. Bei der Initiation bindet ein so genannter sigma-Faktor an die RNAP. Das so entstandene Holoenzym erkennt den Promotor und startet die RNA-Synthese. Der sigma-Faktor verlässt die RNAP, es bildet sich der Transkriptionselongationskomplex, der zu einer stark gesteigerten RNA-Syntheserate führt. Im letzten Schritt erfolgt der Kettenabbruch, woraufhin freigewordene RNAP erneut einen Transkriptionszyklus starten kann. Eine zentrale Rolle bei der Regulation der Elongation und Termination spielt das essentielle NusA Protein (N utilization substance A), das im Verbund mit NusB, NusE und NusG, vor allem die Geschwindigkeit der RNA-Synthese steuert. Der Aufbau von NusA aus sechs Domänen spiegelt die vielfältigen Aufgaben des Proteins. Die aminoterminale Domäne vermittelt die Interaktion mit der RNAP. Die RNA-Bindungsregion wird durch die S1-, KH1- und KH2-Domänen aufgebaut. Die beiden carboxyterminalen acidic repeats AR1 und AR2 erfüllen jeweils unterschiedliche Aufgaben, die bisher nur zum Teil aufgeklärt sind und im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Eine weitere Rolle spielt NusA bei der Antitermination. Dieser zuerst im Phagen lambda entdeckte Mechanismus bewirkt, dass die Transkription nicht an einem Terminationssignal abbricht. Das dafür notwendige Antiterminationssignal besteht aus zwei bestimmten RNA-Sequenzabschnitten, boxA und boxB, die durch eine Trennsequenz miteinander verbunden sind. Während die boxA sowohl im Phagen lambda als auch in den für die ribosomale RNA codierenden Operons stark konserviert ist, weist die boxB in den beiden genannten Fällen nur geringe Gemeinsamkeiten auf. Das NusA Protein bindet an das Antiterminationssignal und an die RNAP. Die so veränderte RNAP ist nun in der Lage, stromabwärts gelegene Terminationssignale zu überlesen. In dieser Arbeit wurde zuerst die Rolle der AR1 Domäne untersucht. Eine bereits bekannte Kristallstruktur zeigt AR1 in Komplex mit lambda N. Jedoch fehlt in dieser Struktur die zweite Hälfte des lambda N Bindungsmotives (Aminosäurereste 42 bis 47), ebenso wie AR2, was zur Vermutung führte, dass diese Domäne lambda N(42-47) binden könne. Zur Klärung dieser Frage wurden die beiden Domänen AR1 und AR2 jeweils einzeln kloniert und im Hinblick auf ihre Bindung an das lambda N Protein getestet. In dieser Arbeit wurde eine ausschließliche Bindung von AR1 an lambda N gefunden, inklusive der in der Kristallstruktur fehlenden Aminosäurereste. Zusätzlich induziert AR1 bei der Bindung eine helikale Konformation im Bereich des Arginin-reichen Motives von lambda N (Aminosäurereste 1 bis 22), wodurch ein theoretisches Modell der lambda N Funktionsweise bestätigt wurde. Zudem wurde die Interaktion von NusA-AR2 charakterisiert. Biochemische Daten ließen auf eine Wechselwirkung von NusA mit alphaCTD schließen. Basierend darauf wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass in diesem Fall ausschließlich AR2 für die Wechselwirkung mit alphaCTD verantwortlich ist. Mit Hilfe von NMR-Experimenten wurde im Anschluss daran die Komplexstruktur berechnet. Die resultierende Bindungsfläche seitens alphaCTD lieferte dabei Rückschlüsse, wie NusA möglicherweise die RNAP von der Initiations- in die Elongationsphase überführt. Ebenso erlaubten die neu gewonnenen Ergebnisse einen Vergleich der Bindungseigenschaften von AR1 und AR2. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Wechselwirkung von NusA mit dem Antiterminationssignal studiert. Dazu wurde eine NusA Deletionsmutante kloniert und gereinigt, die ausschließlich aus den bisher vermuteten RNA-Bindungsdomänen S1, KH1 und KH2 bestand. Anhand der gemessenen Fluoreszenzanisotropie-Daten wurde die Bindung im Bereich der Trennsequenz lokalisiert. Die schwächere Affinität des Phagen lambda Signals nutL und nutR im Vergleich zur ribosomalen RNA erklärt die Notwendigkeit des zusätzlichen Faktors lambda N im Phagen System.

Structural insights into RNA binding by NusA and interaction studies of Nun with E. coli Nus factors. (2008)

Sujatha Pagadala Santhanam

In phage lambda, antitermination is initiated by the lambda-encoded N protein which recruits a number of host proteins called Nus factors. Several of these host proteins which are essential for effective transcription termination and antitermination have been identified, these includes NusA, NusB, NusE and NusG. The subject of this work is mainly focused on characterization of interactions between various Nus host factors in the termination and antitermination system by NMR spectroscopy. Like N protein, Nun also requires additional host factors for efficient termination. It has been reported already that NusA interacts with C-terminal region of Nun and also that Nun binding to NusA requires NusA ar1 region. On the basis of these results, 1H,15N-HSQC spectra were recorded to monitor the interaction between HK022-Nun and NusA ar1. NMR titration experiments between Nun and NusA clearly showed a lack of chemical shift perturbations. Therefore, it can be concluded that there is no intermolecular interaction between Nun and NusA ar1. Up to date, no information about the interaction between Nun and NusG as well as Nun and NusB are known. Titration experiments between Nun and both Nus factors, have also revealed no direct interaction. Altogether, it can be deduced that there might be no direct interaction between Nun and NusA ar1, and NusG, and NusB. The NusA transcription elongation protein, which binds nut site RNA, contains sequences corresponding to the S1 and KH classes of identified RNA binding domains. To gain comprehensive insights into binding surface on SKK domain upon nut RNA binding, backbone resonances of SKK domain was assigned using sequential C-alpha, C-beta and CO chemical shift information derived from an array of TROSY based triple-resonance experiments. With virtually complete backbone assignment (80.5 %) of the SKK domain it was possible to characterize the interaction between SKK domain and lambda nutL RNA by NMR titration experiments. Significant chemical shift changes observed on SKK domain upon addition of unlabeled lambda nutL RNA, had reflected a direct interaction. Mapping of chemical shift perturbations on SKK domain revealed that the RNA binding interface is mainly located in the KH domains. The results implied a sequence-specific RNA binding. In the free state, NusA cannot bind to RNA. Once alpha-CTD of RNA polymerase is bound to NusA the RNA binding inhibition is released. Direct interactions between alpha-CTD and NusA ar2 have been reported and therefore NusA ar2 could be a prime candidate for inhibiting the RNA binding of NusA. To further evaluate the autoinhibition effect of NusA ar2 on SKK domain, titrations between NusA ar2 and SKK domain have been performed. Upon NusA ar2 binding, notable chemical shift changes were observed in the KH1 region of SKK domain. The residues which were affected on binding to NusA ar2 were also affected during the SKK and lambda nutL titration experiments. The results are in good agreement with the proposed idea that NusA ar2 possibly occludes the RNA binding domains of NusA. To investigate the effect of alpha-CTD on RNA binding by NusA, titration of the complex containing SKK domain and NusA ar2 by gradually adding an increased molar ratio of alpha-CTD have been carried out. On addition of alpha-CTD, it was clearly observed that alpha-CTD displaced NusA ar2 from the complex suggesting that the inhibition of RNA binding by NusA ar2 could be released by alpha-CTD.

Die Regulation der Transkriptionsantitermination in Escherichia Coli. (2009)

Björn Burmann

Die Transkription wird in den Zellen durch die RNA-Polymerasen (RNAP) katalysiert. Die bakterielle RNAP ist aus den zwei alpha, beta´, beta, omega-Untereinheiten aufgebaut. Das katalytische Zentrum wird durch die beta’- und beta-Untereinheit gebildet und sorgt für die Bildung der Phosphodiesterbindung. Die alpha- und omega-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau der RNAP verantwortlich, wobei Teile der alpha-Untereinheiten zusätzlich regulatorische Funktionen haben. Der Ablauf der Transkription ist in Initiation, Elongation und Termination unterteilt. Alle drei Phasen werden innerhalb der Zellen streng reguliert. Während der Elongation bewirkt die sogenannte Antitermination das Überlesen von Terminationssequenzen. Dieser zuerst beim Phagen Lambda identifizierte Mechanismus, beruht auf dem Aufbau eines Multi-Protein-Komplexes, bestehend aus den Escherichia coli (E. coli) Nus-Proteinen (A, B, E, G), der RNAP, der nut RNA-Sequenz und dem Lambda N-Protein. Die ribosomalen (rrn) Operons in E. coli werden durch intrinsische Antitermination reguliert. Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen konnten zeigen, dass die Bildung des NusB:NusE Heterodimers und seine Bindung an die boxA der nut und rrn RNA-Sequenzen ein wichtiger Schritt im Aufbau des Antiterminationskomplexes ist. Für die sogenannte NusB101-Mutation, Asp118Asn, die den negativen Effekt von Mutationen in anderen Komponenten des Komplexes aufheben kann, konnte eine höhere Affinität zur Erkennungs-RNA gezeigt werden. Weitere Mutationen an dieser Position zeigten, dass die Aminosäureposition 118 zentral für die Stabilität der RNA-Bindung ist. Ein weiterer Bestandteil des Antiterminationskomplex ist das zwei Domänenprotein NusG, über dessen Interaktion innerhalb des Komplexes wenig bekannt war. Interaktionen für die beiden Domänen, die das NusG-Paralog RfaH konstituieren, sind in der Literatur beschrieben, wie es auch bei der Kristallisation von NusG aus Aquifex aeolicus gezeigt werden konnte. Für E. coli NusG konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese Interaktion konzentrationsabhängig, damit intermolekular, und sehr kurzlebig ist. Zusätzlich konnten Proteinbindungsflächen auf beiden Domänen bestimmt werden. Als Erkenntnis von zentraler Wichtigkeit und sehr weitreichenden Konsequenzen wurde in dieser Arbeit eine spezifische und strukturell sehr gut definierte Wechsel-wirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE, das unter der Bezeichnung S10 auch ein Bestandteil der 30S Untereinheit des Ribosoms ist, identifiziert. Seit wenigen Wochen ist in der Literatur die Interaktion der amino-terminalen Domäne von NusG mit der RNA-Polymerase beschrieben. Die hier beobachtete Wechselwirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE könnte damit zur Rekrutierung des NusB:NusE Heterodimers und zur Ausbildung eines kompakten Antiterminationskomplexes beitragen. Da NusE auch Teil des Ribosoms ist, stellt die NusG:NusE Interaktion möglicherweise die erste direkte molekulare Verbindung zwischen Transkription und Translation in Bakterien dar. Diese Kopplung von bakterieller Transkription und Translation ist ein sehr lange bekanntes, aber molekular nicht erklärtes Phänomen von außerordentlicher Bedeutung für die Überlebensfähigkeit von Bakterien. In ähnlicher Weise, wie das Lambda N-Protein, aber mit entgegengesetzter Wirkung – Termination statt Antitermination – bindet das Nun-Protein aus dem Phagen HongKong 022 an die boxB, eine Haarnadelschleife der nut Sequenz. Durch in vivo Studien wurde die Nun Tyr39Ala Mutante, die wichtige Hinweise für das Verständnis der Peptid-RNA-Interaktion lieferte, identifiziert. Durch diese Mutation ist eine ursprünglich als wichtig angesehene Wechselwirkung mit dem Adenosin 9 der boxB nicht mehr möglich. Molekulardynamikuntersuchungen zeigen deutliche Unter-schiede zur Lambda N:boxB Wechselwirkung auf, da die analoge Trp18:A9 Interaktion essentiell für prozessive Antitermination ist. Auf diese Weise lieferte diese Untersuchung wichtige Hinweise auf den molekularen Schaltmechanismus.

Neue organometallisch substituierte Alkine, Alkene und Metallacyclen - Anwendung der Multikern-NMR-Spektroskopie (2010)

Peter Thoma

Diese Dissertation berichtet über die Synthese neuer Mono- und Dialkinylstannane. Diese wurden mit gängigen Methoden (NMR, IR, MS, teils Röntgenstrukturanalyse) charakterisiert und ihre Anwendung in 1,1-Organoborierungsreaktionen wurde gezeigt. Die Alkinylstannane können in guten bis sehr guten Ausbeuten (teilweise quantitativ) erhalten werden. Nur in wenigen Fällen war eine Reinigung mittels fraktionierter Destillation nötig. Drei der Dialkinylstannene konnten kristallisiert und mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse charakterisiert werden. Bei zwei dieser Strukturen handelt es sich um Diethinylstannane, von denen bisher kein Beispiel literaturbekannt ist. Bei der Charakterisierung mit Hilfe der NMR-Spektroskopie konnte der bisherige Datensatz für Alkinylstannane (chemische Verschiebung, Kopplungskonstanten und isotopeninduzierte chemische Verschiebung) beträchtlich erweitert werden. Als ein besonders bemerkenswerter Effekt ist die beobachtete große Kopplungskonstante 6J(119Sn,19F)=30-35 Hz zu nennen, die in allen Alkinylstannanen beobachtet wurde, die para-Fluor-Benzylgruppen tragen. Dies weist auf eine Hyperkonjugation des Zinn-Atoms mit dem aromatischen Rest hin. Bei der Reaktion der Dialkinylstannane mit Triorganoboranen konnten verschiedene Reaktivitäten und Produktverteilungen beobachten werden. In allen Fällen für Dialkinylstannane die mit Trimethylsilyl-Gruppen substituiert sind liefert die Organoborierung 2,5-trimethylsilylsubstituierte Stannole, unabhängig vom Triorganoboran. Für Trialkylborane konnten Intermediate [Alkinyl(alkenyl)stannane] beobachtet werden, die innerhalb weniger Tage zu den entsprechenden Silolen abreagieren. Für BPh3 8 konnten diese Zwischenstufen nicht beobachtet werden. Diethinylstannane reagierten mit allen Trialkylboranen selektiv zu 2,5-unsubstituierten Stannolen. In der Reaktion mit 9-Et-9-BBN konnte nur die Erweiterung der Borabicyclo[3.3.1]nonan-Einheit beobachtet werden und die Ethyl-Gruppe verbleibt am Bor-Atom. Im Gegensatz dazu führt die entsprechende Reaktion mit BPh3 zu einer Mischung aus Stannolen und 1,4-Stanna-bora-cyclohexa-2,5-dienen neben weiteren bisher noch unbekannten Nebenprodukten. Die Umsetzung der anderen Dialkinylstannane mit Trialkylboranen liefert Gemische aus Stannolen und 1,4-Stanna-bora-cyclohexa-2,5-dienen. Der relative Anteil der 6-Ringe steigt mit dem sterischen Anspruch der Reste am Zinn und am Bor. Wird BPh3 verwendet, konnten reine 6-Ringe erhalten werden. Eine Erhöhung der Lewis-Acidität der Triorganoborane kann durch die Verwendung von Tris(pentafluorophenyl-)boran, B(C6F5)3 9 erreicht werden. In der Tat führte dies zu einigen interessanten Beobachtungen. Stannole waren die Endprodukte in der Reaktion zwischen Dialkinylstannane die mit Trimethylsilyl-Gruppen substituiert sind und B(C6F5)3. Diese waren, im Gegensatz zu ihren Silol-Analoga, beständig gegen Photoisomerisation. In allen anderen Fällen reagieren Dialkinylstanne mit B(C6F5)3 unter der quantitativen Bildung von 1,4-Stanna-bora-cyclohexa-2,5-dienen, wobei eines mittels Röntgenkristallstrukturanalyse charakterisiert werden konnte. Die Lewis-acide Natur von B(C6F5)3 9 half dabei die postulierten zwitterionischen Intermediate mit Hilfe spektroskopischer Methoden zu charakterisieren und in zwei Beispielen konnten die Molekülstrukturen mittels Röntgenkristallstrukturanalyse erhalten werden. Zum ersten Mal konnte ein solider struktureller Beweis für solche Intermediate mit H- oder Me3Si-Gruppe am Alkin erbracht werden Die Absättigung des stark Lewis-aciden Bor-Atoms mit vier Substituenten erklärt die langsame Umlagerung in die Endprodukte. Betrachtet man die Stannole als 1,3-Dipole kann man sich Additionsreaktionen mit Dipolarophilen vorstellen. Tatsächlich zeigten die Stannole eine Reaktivität mit Isocyanaten und einigen Isothiocyanaten. Diese Produkte konnten als neue bicyclische Verbindungen charakterisiert werden. Die vorgeschlagenen Konfiguration (H am C2 in cis-Position relativ zu Et am C3) konnte mittels 1D 1H-1H-NOE-Differenz-NMR-Spektroskopie bestätigt werden. Zwei stereogene Zentren werden hierbei in einer Reaktion erzeugt. Die Umsetzung von 1,4-Stannabora-3,4,5-triphenyl-cyclohexa-2,5-dienen mit Ethylisocyanat ergibt keine bicyclischen Verbindungen. Statt dessen werden neue Alkenylstannane gebildet. Ringöffnende Alkoholyse der Bicyclen ergab neue Stannolene. Von diesen konnte eines im Festkörper mittels Röntgenkristallographie untersucht werden. Beide Enantiomere sind im Kristallgitter vorhanden und kristallisieren in einer kettenartigen Struktur, in der sie sich abwechseln. Die Untersuchung der Reaktivität der Stannole bezüglich Isoselenocyanaten ergab ein abweichendes Verhalten im Vergleich zu Isocyanaten und Isothiocyanaten. Als einziges Produkt konnte das 1,3,5,2,4,6-Triselenatristannin-Derivat identifiziert werden.

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