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Analyse von Condensin-Komplexen in Drosophila melanogaster Charakterisierung der Untereinheit CapG und Identifizierung von Interaktionen
(2012)
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Sabine Herzog
- Die akkurate Verteilung der Chromosomen während der Mitose ist essentiell für die genetische Stabilität der Zellen. Der heteropentamere Condensin-Komplex ist hierbei an der Strukturierung der Chromosomen und deren physikalischer Stabilität während der Segregation maßgeblich beteiligt. In höheren Eukaryoten konnten zwei dieser Komplexe (Condensin I und Condensin II) identifiziert werden, die ihrerseits eine distinkte subzelluläre Lokalisation während der Interphase und auch Beladung an das mitotische Chromatin aufweisen. Die beiden Komplexe haben die Structural maintenance of chromosomes (SMC) Untereinheiten SMC2 und SMC4 gemein, während sie sich in den nicht-SMC-Untereinheiten unterscheiden: In Condensin I findet man die Komponenten Chromosome associated protein D2 (CapD2), CapG und CapH und in Condensin II die verwandten Proteine CapD3, CapG2 und CapH2. Während in Vertebraten die Rolle beider Condensin-Komplexe während der Mitose klar etabliert ist, zeichnet sich in Drosophila melanogaster ein anderes Bild ab. Mutanten in den Genen CapH2 und CapD3 zeigen keine mitotischen Phänotypen und ein zu CapG2 homologes Protein konnte bisher nicht identifiziert werden. Da CapG aus Drosophila ein ähnliches Lokalisationsverhalten wie die Condensin II-Untereinheiten der Vertebraten aufweist, wird CapG als Komponente beider Condensin-Komplexe diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktion und die Regulation von CapG in Drosophila melanogaster, primär durch die Analyse von EGFP-fusionierten Proteinvarianten, näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von CapG neben den hauptsächlichen Phosphorylierungsstellen auch Kernimportsequenzen enthält, welche die subzelluläre Lokalisation des Proteins während des Zellzyklus regulieren. Während der Interphase zeigt CapG im Zellkern eine Kolokalisation mit dem Heterochromatin-bindenden Protein HP1, was auf eine direkte Chromatinassoziation von CapG hinweist und mögliche Chromatin-strukturierende Funktionen bestätigen würde. Diese Heterochromatin-spezifische Lokalisation kann vom C-terminalen Drittel von Cap-G vermittelt werden, der andererseits für die generelle Chromatinassoziation während der Mitose, die Interaktion mit den anderen Condensin I-Untereinheiten und für die Funktionalität von CapG während der somatischen Mitosen entbehrlich ist. Da ein Proteinfragment entsprechend der N-terminalen Zwei-Drittel von CapG (CapG-NM) während der Interphase hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert ist, kann die präferentielle Kernlokalisation von CapG während der Interphase, und auch die Phospho-Regulation des Proteins, für die Entwicklung vom Beginn der embryonalen zygotischen Expression bis hin zum adulten Stadium nicht essentiell sein. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Lokalisation von CapG und anderen Condensin Untereinheiten in Geweben der weiblichen und männlichen Keimbahn legt die Vermutung nahe, dass CapG, eventuell im Kontext mit den anderen Condensin-Untereinheiten, eine Rolle bei der Gametogenese zukommt. Konsistent hiermit ist die Beobachtung, dass Weibchen steril sind, die in ihren Keimbahnzellen keine funktionelle CapG-Variante exprimieren. Die Integrität der Ovarien in diesen Tieren spricht für eine Funktion von CapG bei der Reifung des Oozytenkerns oder den meiotischen Teilungen. Die Präsenz von CapG in löslichen Komplexen mit den bekannten Condensin I-Untereinheiten konnte in dieser Arbeit durch Koimmunpräzipitationen mit nachfolgender massenspektroskopischer Bestimmung der assoziierten Proteine bestätigt werden. Eine Assoziation mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten wurde dagegen nicht gefunden. Ebenso assembliert eine ektopisch exprimierte, funktionelle Variante von CapH2 nicht in einem löslichen Komplex mit CapG. Auch die Analyse direkter Protein-Protein-Interaktionen in einem in vitro-System ergab keine Hinweise auf eine Assoziation von CapG mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten. Dagegen konnten in diesem System die Interaktionen nachvollzogen werden, die für Condensin I und Condensin II aus anderen Systemen publiziert und somit erwartet sind. Experimente zur genetischen Interaktion der Condensin-Untereinheiten offenbarten bei Anwesenheit von CapG-Mutationen eine Suppression des Phänotyps, der nach Überexpression von CapH2 in Speicheldrüsen erhalten wird. In einem reziproken Ansatz führten CapG-Mutationen zu einer Verstärkung des CapH2-mutanten Phänotyps in den Nährzellen von Ovarien. CapH2 und CapG scheinen also auf genetischer Ebene miteinander zu interagieren. Zusammengenommen legen die Ergebnisse ein Modell nahe, in dem CapG zwar nicht in direkter Assoziation mit Condensin II-spezifischen Komponenten vorliegt, aber parallel an der Strukturierung von Chromatin beteiligt ist und funktionell zum Teil mit den Aufgaben der Condensin II-spezifischen Komponenten überlappt.
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Molecular detection and identification of phytoplasmas in sugarcane in Hawaii, Thailand, Cuba and Near East
(2012)
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Ziad Soufi
- The Yellow leaf syndrome (YLS) had been first detected and described in Hawaiian sugarcane plantations. The polerovirus Sugarcane yellow leaf virus was identified as a causal agent of the syndrome; however there was no strict correlation between the degree of symptom expression and the virus titre. Therefore several surveys on breeding station sugarcane plants in Hawaiian Islands were done for Sugarcane yellow leaf phytoplasma (SCYLP), a bacterium which had been hypothesized to be also a causal agent of YLS. Two types of phytoplasmas were found in Hawaiian sugarcane cultivars mainly sugarcane white leaf phytoplasma (SCWL) which is a member in rice yellow dwarf group, in addition to aster yellows group. This was also true for sugarcane plants from Hawaiian plantations, which routinely use hot water-treatment for the seed cane cuttings. Sugarcane samples were obtained also from other countries including Cuba, Egypt, Syria and Thailand where sugarcane plants are also showing symptoms of yellowing or whiting. Aster yellows and X-disease phytoplasmas were found in Cuban cultivars whereas one sugarcane cultivar from Egypt contains grassy shoot phytoplasma that is a member in rice yellow dwarf group, but the other two Egyptian ones were phytoplasma-free. Syrian sugarcane was infected by phytoplasma that identified preliminary in rice yellow dwarf group. To our knowledge, this is the first report for the detection and identification of phytoplasma in sugarcane plants from Hawaii, Egypt and Syria. Our investigation on Thai sugarcane plants was in agreement with previous literature where sugarcane white leaf (SCWL) phytoplasma is associated with white leaf disease (Nakashima et al., 1994; Wongkaew et al., 1997). Q-PCR (real-time PCR) offers the opportunity to detect the phytoplasma in a sensitive, specific and quick manner, but that is not true for sugarcane plants with a very low titer of phytoplasma. Therefore, nested-PCR is better than qPCR for low titer phytoplasma detection and that is true for sugarcane yellow leaf phytoplasma disease. A BLAST search for the 16S rRNA gene sequences reported in this study showed that they shared 99 to 100% sequence identity with those of other phytoplasmas in the Aster yellows, X-disease and Rice yellow dwarf groups. However, no one of these identified strains can be described as a new “Candidatus Phytoplasma species”. On the other hand, Hawaiian sugarcane cultivar H78-7750 as a representative of Hawaiian breeding station sugarcane contains phytoplasma clustered to strain sugarcane white leaf (SCWL) phytoplasma, closely together with sugarcane white leaf phytoplasma from Taiwan (AY139874). It is possible to explain the occurrence of (SCWL) phytoplasma in Hawaiian Islands, by insect vectors or by infected stem cuttings which were obtained from other countries. Thai sugarcane contains phytoplasma isolate closely together with sugarcane white leaf phytoplasma from Myanmar. The transmission electron microscopic (TEM) studies revealed the presence of sugarcane white leaf phytoplasma only in phloem sieve tubes of diseased sugarcane leaves but not in adjacent cells to the sieve elements including companion cells and phloem parenchyma as well. According to ultrastructural observations under TEM, parenchymatic cells of bundle sheath and mesophyll tissue of affected leaves showed some alterations including accumulations of starch granules, increase plastoglobuli number and size in disorganized chloroplasts. Insect vectors of phytoplasmas are phloem feeders. Thus far, none of aphid species has been found to be a vector of phytoplasmas. Our tests showed also that black sugarcane aphids (Melanaphis Sacchari) were unable to transmit the phytoplasmas from infected sugarcane into the phytoplasma-free one. Hot water treatment has been proposed to cure plant material from phytoplasmas. Our tests showed that the appropriate hot water treatment, which recommended for phytoplasma elimination, is immersion of the sugarcane stem cuttings at 50°C for 60 min.
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Identification of substrate proteins of FtsH during sporulation of Bacillus subtilis
(2012)
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Hue Bach Thi Nguyen
- FtsH is an ATP- and Zn2+-dependent metalloprotease anchored in the cytoplasmic membrane by two transmembrane segments. It is the unique membrane-bound AAA-protease in bacteria that performs a variety of regulatory functions. In B. subtilis, an ftsH knockout exhibits a pleiotropic phenotype such as filamentous growth, sensitivity towards heat, osmotic shock and cells are unable to sporulate. Recently, it has been shown that ftsH knockout cells fail to entry sporulation stage II due to lack of a sufficient amount of Spo0A~P and the first substrate of FtsH identified in B. subtilis is the Spo0E phosphatase, a negative regulator that dephosphorylates Spo0A~P. However, the sporulation frequency in a spo0E ftsH double mutant strain was only partly restored, we hypothesized that FtsH might degrade additional substrate proteins involved in sporulation. To identify these proteins, two different strategies were applied. By using the 2D gel technique, the proteomes of an ftsH wild-type strain was compared with an ftsH null mutant. Several proteins were identified to be either up- or down-regulated in the absence of FtsH. One of them up-regulated about 4-fold was identified as Spo0M. Since ftsH did not interfere with transcription of spo0M, an in vitro proteolysis assay was established using purified components. It was shown that Spo0M was degraded by FtsH in an ATP- and time-dependent way. In the second strategy, an ftsHtrap mutant was constructed and tested for loss of its proteolytic activity. Protease trap mutants are still able to bind substrate proteins, but are unable to degrade them. By using FtsHtrap fused to a GST-tag, YwnF, a membrane protein, was trapped and identified as a substrate of FtsH by mass spectrometry. However, further experiments will be required to confirm YwnF as a target of FtsH. The last part of this thesis was focused on the eag gene, which forms a bicistronic operon with Spo0E. Construction and analysis of an eag insertion mutant exhibited a slight increase in the sporulation frequency and in the amount of Spo0A. A transcriptional fusion between the promoter of the spo0E-eag operon and the lacZ reporter gene revealed an increase in the beta-galactosidase activity from t0 when the cells were grown in sporulation medium. Since the Eag protein may be an integral membrane protein, it may bind excess Spo0E thereby preventing it from dephosphorylating Spo0A~P. Alternatively, Eag may bind Spo0E and present it as a modulator to FtsH for degradation.
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Impact of extreme hydrological conditions on belowground carbon cycling and redox dynamics in peat soils from a northern temperate fen
(2012)
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Cristian Estop Aragonés
- Peatlands have an important role in the global carbon cycle and constitute the largest pool of carbon stored in terrestrial ecosystems due to their disproportionally high areal soil carbon density. This globally relevant carbon stock is the result of a process mostly initiated after the last glaciation period. A key factor for this long term carbon accumulation is the relative low decomposition of organic matter in these predominantly water logged ecosystems. Hydrological conditions play thus a fundamental role in peatlands and the feedback of carbon cycling in these ecosystems in response to climate change is under debate. Peatlands are important CO2 sinks but also constitute global sources of CH4. The atmospheric exchange and production rates of these greenhouse gases are strongly influenced by the hydrological regime. An increased frequency of extreme meteorological conditions resulting in drying and flooding events is predicted to occur in the future.
The major issue regarding the climate change debate at the global scale is how rapid these greenhouse gases are being released to the atmosphere. Despite the general consensus regarding the broad effects of drying and flooding on CO2 and CH4 exchange, belowground processes producing such greenhouse gases and their response to water table dynamics is underrepresented and usually simplified or overgeneralized. Temperature, moisture, oxygen content and nutrient content are among the major environmental controls for organic matter decomposition rates in peat soils. Another important and intrinsic control is peat quality or humification degree of organic matter. The interrelation and relevance of all these factors vary among sites and with hydrological condition in a temporal and spatial scale.
This work presents investigations focusing on belowground redox processes aiming to witness the dynamic interrelation of soil physical and chemical (soil gas and pore water chemistry) variables, and evaluates the relevance of some controls of organic matter decomposition during a wide range of hydrological conditions. Most of this work shows information under in situ conditions and complementary laboratory experiments were performed minding the in situ observations. The findings contribute to general knowledge by providing raw data in fen peats under fluctuating and contrasting water table conditions in a relatively high spatiotemporal resolved scale. Dryings led to increased air filled porosity, O2 intrusion, CO2 degassing, inhibition of methanogenesis and renewal of electron acceptors. The opposite trend occurred upon rewetting with pulses of iron and sulphate reduction and delayed methane production to a variable extent. Upon flooding, continued anaerobic conditions stimulated the accumulation of reduced products, methanogenic precursors (acetate and hydrogen) and CH4.
The general assumption that the water table directly controls the oxygen content in peat was relativized. This work shows that such relation is greatly influenced by peat physical properties, which partially control the changes in moisture. Based on these findings, the mineral content and the degree of compaction in organic soils can be implemented to more accurately represent the dynamics of aeration in peats upon water table changes. Another general assumption is that drying events, i.e. temporary decline of water table below mean position, lead to increased CO2 production and emission from peat soils to the atmosphere. Such statement was also relativized and must account for the depth distribution of respiration rates in relation to the mean water table of the peat deposit. Based on these findings, the high relative contribution of upper peat layers already exposed above the water table mask the effects of increased CO2 production in deeper peat upon water table drop. Additionally, the role of moisture was shown to be little for aerobic respiration. This work also evaluates the importance of drought severity by accounting for the post drought effects on methane production. More intense and prolonged drying events led to a greater regeneration of electron acceptors in peat soil, which broadly suppressed or limited methane production upon rewetting. This relation was not simple and several factors such as water table position, post drought water table fluctuations, temperature and organic matter content contributed to the recovery of methane production after drying. The provision of substrates by fermentation processes limited peat respiration during shallow water table and drying. In contrast, accumulation of acetate and hydrogen was observed during flooding indicating a decoupling of fermentation from terminal metabolism and favouring the co-occurrence of iron reduction, sulphate reduction and methanogenesis.
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Umsetzung verschiedener didaktischer Theorien im außerschulischen Unterricht: Potentiale und Grenzen des wiederentdeckten Lernorts Bauernhof
(2012)
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Gabriele Fröhlich
- Die Entfremdung von Lebensmittelproduktion und landwirtschaftlicher Praxis sowie das Unwissen über enge Verflechtungen zwischen Umwelt und Landwirtschaft der heranwachsenden Generation (Ernst & Theimer, 2011; Hubert, Frank, & Igo, 2000; Tal, 2008) sind ein allgemeines gesellschaftliches Problem, dem man mit Bildung begegnen kann und sollte (Harms, King, & Francis, 2009). Um diese Themen, im Sinne einer Bildung für nachhaltige Entwicklung, zu vermitteln und so innerhalb der Gesellschaft zu festigen, scheint sich am besten situationsbezogenes und kontext-orientiertes Lernen am außerschulischen Lernort Bauernhof zu eignen (Knobloch, Ball, & Allen, 2007). Kontext-orientiertes Lernen ermöglicht den Schülerinnen und Schülern das in der Schule Gelernte auf den Alltag zu übertragen und so effektiver zu lernen (Bennett, Lubben, & Hogarth, 2007).
Das in dieser Studie entwickelte agrarische Umweltbildungsprojekt unterscheidet sich bewusst von bestehenden, zum Teil mehrtägigen und erlebnisorientierten Projekten, indem es Schulpraxisrelevanz für sich beansprucht: Es wird auf Ansprüche und Anforderungen des Lehrplans (fachliche Inhalte, Kompetenzvermittlung, kurze Projektdauer), der Lehrer (einfache Organisation und Durchführbarkeit) und der Schüler (schülerzentrierte und kooperative Lernmethode) Rücksicht genommen und diese bestmöglich umgesetzt.
Die Zielsetzungen der Promotionsstudie waren zum einen genauere Untersuchungen zur Naturverbundenheit von Kindern (Teilarbeit A), die Erziehung zu umweltfreundlicherem Konsumverhalten (Teilarbeit B) und eine kognitive Wissensvermittlung durch das entwickelte Projekt (Teilarbeit C). Darüber hinaus wurden noch Schülervorstellungen zur landwirtschaftlichen Praxis am Anfang und Ende der Sekundarstufe I erhoben (Teilarbeit D), um die Wahrnehmung von Landwirtschaft bei Kindern und Jugendlichen in einer modernen Industriegesellschaft besser beurteilen zu können. Das Wissen dieser Vorstellungen ist als Basis zur Erarbeitung effizienter Bildungsmaßnahmen in diesem Bereich erforderlich.
Teilarbeit A zeigt sowohl einen negativen Zusammenhang zwischen dem Alter (untersucht wurde der Zeitraum vor dem Einsetzen der Pubertät (9 – 13 Jahre)) als auch einen positiven Zusammenhang zwischen den kognitiven Fähigkeiten (Indikatorvariable: Schulform) und dem Grad der Naturverbundenheit.
Frühere Studien (Davis, 2011; Schultz, 2002) zeigten einen engen Zusammenhang zwischen Naturverbundenheit und umweltfreundlichem Verhalten. Dennoch hat sich in Teilarbeit B herausgestellt, dass Naturverbundenheit bei den Bildungsprojekt-Teilnehmern (Durchschnittsalter: 11,5 Jahre) keinen wichtigen Beitrag zur Intention für umweltfreundlicheres Konsumverhalten leistete, ebenso wenig wie das neu hinzugewonnene Wissen. Signifikant hingegen waren die Korrelationen mit situationsbedingten Lernemotionen, die direkt im Anschluss an die Unterrichtseinheit gemessen wurden. Jedoch war das Konsumverhalten nach sieben Wochen wieder auf dem vor der Intervention gemessenem Ausgangsniveau.
Wissensvermittlung, die Hauptintention der meisten Bildungsprojekte, erwies sich in Teilstudie C für die teilnehmenden Schüler insgesamt, unabhängig vom Lernort (Klassenzimmer vs. Bauernhof), als erfolgreich. Schlüsselt man die einzelnen Wissensbereiche weiter auf, so ergab sich ein signifikanter mittelfristiger Lernzuwachs bei Mädchen zum Thema Ernährung, und ein signifikanter kurz- und mittelfristiger Lernzuwachs für das Themengebiet Landwirtschaft bei beiden Geschlechtern.
Schließlich wurde in Teilstudie D Schülervorstellungen zu den Aufgaben eines Landwirts erhoben. Hierzu wurden Schüler am Anfang der Sekundarstufe I (5./6. Jahrgangsstufe) und am Ende (10. Jahrgangsstufe) befragt. Bei der induktiven Kategorienbildung der qualitativen Inhaltsanalyse nach Mayring (2007) ergaben sich kaum Unterschiede zwischen den Altersgruppen, jedoch lag der Schwerpunkt der Arbeitsaufgaben für die jüngeren Schüler bei den Tieren und für die Älteren bei den Pflanzen. Lediglich ein geringer Anteil der Zehntklässler nannte ökologische Aufgabenbereiche, bei den Jüngeren fehlt dieser Aspekt völlig. Generell zeigten sich sehr stereotype und einfache Vorstellungen bei den teilnehmenden Schülern.
Kurze, schülerzentrierte Bildungsmaßnahmen im Bereich der Landwirtschaft und Ernährung können kurz- und mittelfristig Wissen vermitteln, Anregungen für umweltfreundlichere Verhaltensweisen schaffen und positive Lernemotionen stärken, die sich jedoch stark auf das Antwortverhalten der Schüler auswirken können. Zusammenfassend kann man sagen, dass das entwickelte Bildungsprojekt gut geeignet ist, Grundlagen der agrarischen Umweltbildung schülergerecht zu vermitteln. Die Inhalte des Projekts sollten wiederholt in der Schullaufbahn aufgegriffen und altersgerecht vertieft werden, um den Schülern agricultural literacy(Frick et al., 1991) und damit ein realeres Bild über die moderne landwirtschaftliche Praxis zu vermitteln.
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Untersuchung des Beitrags von Nicotianaminsynthase zur Zinkhyperakkumulation in Arabidopsis halleri
(2012)
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Ulrich Deinlein
- Zinkdefizienz gehört zu den am meisten verbreiteten Nährstoffmangelerkrankungen weltweit (White and Broadley, 2009). Die Züchtung von zinkreicheren Anbaupflanzen könnte durch ein besseres Verständnis der Mechanismen pflanzlicher Zinkhyperakkumulation erleichtert werden. Hyperakkumulierer sind dazu in der Lage, mehr als hundertmal mehr Zink in den Blättern anzureichern als normale Pflanzen.
In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Nicotianaminsynthase 2 (NAS2) in den Wurzeln der zinkhyperakkumulierenden und -hypertoleranten Pflanze Arabidopsis halleri um ein Vielfaches stärker exprimiert ist, als im Nicht-Hyperakkumulierer Arabidopsis thaliana (Weber et al., 2004; Weber et al., 2006). Diese Tatsache machte NAS2 zu einem wichtigen Kandidatengen für die Zn-Hyperakkumulation, wobei es aufgrund von Ergebnissen aus Hefevorexperimenten auch zu einem Kandidatengen für die Zn-Hypertoleranz wurde (Weber et al., 2004). NAS2 katalysiert die Bildung des Metallchelators Nicotianamin (NA) aus drei Molekülen S-Adenosyl-Methionin (SAM) (von Wiren et al., 1999).
Die Kernaufgabe dieser Dissertation war, einen potentiellen Zusammenhang zwischen der in A. halleri erhöhten NAS2-Expression und der Hyperakkumulation von Zink zu untersuchen. Dafür wurden A. halleri Populationen von metallkontaminierten und von unbelasteten Standorten sowie AhNAS2 RNAi-Linien untersucht und charakterisiert.
Sowohl die AhNAS2-Transkritniveaus als auch die Nicotianamingehalte waren in den Wurzeln aller getesteten Individuen der verschiedenen Arabidopsis halleri Populationen signifikant höher als in Arabidopsis thaliana. Des Weiteren konnte in den Experimenten mit AhNAS2 RNAi-Pflanzen gezeigt werden, dass diese erhöhte AhNAS2-Expression und daraus resultierende höhere NA-Gehalte in den Wurzeln zur Hyperakkumulation von Zink beitragen. In Linien mit starkem AhNAS2 RNAi-Effekt wurden im Vergleich zum Wildtyp signifikant höhere Zinkkonzentrationen in den Wurzeln gemessen, wobei im Spross das Gegenteil der Fall war. Das Verhältnis von Sprosszinkgehalt zu Wurzelzinkgehalt ist in einer hyperakkumulierenden Pflanze größer als 1 und lag in der vorliegenden Arbeit in Wildtyppflanzen und Kontroll-RNAi-Linien jeweils über dem Wert 15. In den starken RNAi-Linien konnte dieser Wert einzig durch die Herunterregulierung der AhNAS2-Transkriptmengen unter 4 gesenkt werden. Dieses Ergebnis untermauert die Hypothese, dass Nicotianamin eine wichtige Rolle in der Zinkhyperakkumulation in A. halleri spielt. In Zinklokalisierungsexperimenten mit dem fluoreszenten Farbstoff Zinpyr-1 konnten die in den ICP-OES-Analysen erhaltenen Unterschiede zwischen Wurzelzinkgehalt im Wildtyp und der starken Linie 1-2 mit einem konfokalen Lasermikroskop bestätigt werden. Die höheren Zinkgehalte im Sprossgewebe des Wildtyps waren sowohl im hydroponischen Wachstumsmedium als auch in Experimenten mit artifiziell kontaminierter Erde und unter fast natürlichen Bedingungen mit kontaminierter Erde von nativen A. halleri Standorten im Harz konsistent. Analysen zur Speziierung und Zinkverteilung zeigten, dass in den Wurzeln von A. halleri Zink-Nicotianamin-Komplexe gebildet werden, welche die Xylembeladung erleichtern. Diese Entdeckung besitzt hohe Relevanz für die Entwicklung von Biofortifikationsanwendungen. In Toleranzexperimenten konnte gezeigt werden, dass Cadmiumkonzentrationen bis 2 µM im hydroponischen Wachstumsmedium keine toxischen Effekte, weder auf A. halleri Wildtyp- noch auf AhNAS2 RNAi-Pflanzen hatten. Im Gegensatz dazu bildeten alle getesteten Linien nach Zugabe von 10 µM Cd2+ bzw. 5 µM Ni2+ zum Medium starke Chlorosen aus. Die Wurzellängen der getesteten Linien unterschieden sich nach Cadmiumzugabe nicht, während das Wurzellängenwachstum in Gegenwart von zusätzlichem Ni2+ in den starken RNAi-Linien verglichen mit dem Wildtyp signifikant reduziert war. Unter den getesteten Konzentrationen zeigte sich somit die Verbindung von NA zur Nickeltoleranz, nicht jedoch zur Cadmiumtoleranz. Des Weiteren wurden hydroponische Toxizitätsexperimente mit einer externen Zinkkonzentration von 300 µM durchgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollbedingungen führte dieser erhebliche Zinküberschuss zu einem deutlich verbesserten Sprosswachstum aller Pflanzen, wobei keine der getesteten Linien Toxizitätssymptome aufwies. In Microarrayanalysen konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der NA-Gehalte in A. halleri Wurzeln keine Sekundäreffekte auf andere Metallhomöostasegene zur Folge hat. Nur wenige Gene waren verglichen mit dem Wildtyp in der starken RNAi-Linie induziert, wobei ein für ein “defensin-like protein“ codierendes und eines, welches für die Bildung eines “dual specificity protein“ verantwortlich ist, sowohl unter Kontrollbedingungen als auch nach Zinkbehandlung mindestens vierfach hochreguliert waren.
Zusammenfassend kann angemerkt werden, dass mit NAS2 der zweite wichtige Zinkhyperakkumulationsfaktor neben HMA4 (Hanikenne et al., 2008) identifiziert werden konnte.
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Transformation einer argentinischen Sommerweizenvarietät (Triticum aestivum L.) durch Transfer eines Seneszenz-verzögernden Gens zur Verbesserung der Ertragsleistung
(2012)
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Eduardo Daniel Souza Canada
- Um den Seneszenz-Prozess der Weizenpflanze zu verzögern und so eine höhere Ertragsleistung zu erreichen, wurde eine bisher noch nicht übertragene Nutzgenkassette in eine argentinische Weizenvarietät (Triticum aestivum L.) eingebracht. Diese Nutzgenkassette besteht aus der proteincodierenden Region des Isopentenyltransferase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens und dem Seneszenz-spezifischen HvS40-Promotor aus Hordeum vulgare.
SCREENING VON WEIZEN-VARIETÄTEN
Die Kombination der Embryo-Entwicklungsstadien H und W mit den zwei 2,4-D Konzentrationen ergab vier verschiedene Bedingungen, denen alle 22 argentinischen Sommerweizenvarietäten ausgesetzt wurden. Insgesamt wurden 10091 unreife Embryonen getestet. Die besten Ergebnisse bei fünf von sechs der getesteten Parameter erbrachte die Kombination des Entwicklungsstadiums H und der Auxinkonzentration 1 mg 2,4-D /l medium. Die Induktion eines Scutellarkallus sowie die Regenerationsfähigkeit der unreifen Embryonen zur Pflanze waren vom Genotyp, vom Entwicklungsstadium und von der 2,4-D Konzentration im Medium abhängig.
TRANSFORMATION UND IN VITRO GEWEBEKULTUR DER EMBRYONEN DES WEIZENS
Für Klein Brujo konnte ein auf Partikelbeschusstechnik basierendes Transformationssystem etabliert werden.
Nach der Optimierung der Beschussbedingungen ergaben sich drei Variable, die für eine hohe Transformationseffizienz von Klein Brujo (10 % im besten Versuch) entscheidend waren: das Kallus-Induktionsmedium, die Vorkultur und das osmotische Behandlungsmedium.
Die neu etablierte Gewebekulturstrategie führte zu einer Verkürzung der in vitro Kulturdauer zwischen Embryonenpräparation und ex vitro Kultur. Die Verwendung von Phosphinothricin (PPT) als Selektionsmittel während der ex vitro Kultur minimierte die Anzahl falscher Positiver unter den überlebenden Pflanzen (Cotransformanten 97,4%). Allerdings ließen sich durch unabhängige Segregation keine Reporter- bzw. Selektionsgen-freien T1-Pflanzen kultivieren.
In allen T0-Regeneraten konnte über Southern blot-Analysen die proteincodierende Region des eingeführten ipt-Gens nachgewiesen werden (Genkopien zwischen 2 und 7). Das Konstrukt aus einem um 2 kb verkürzten HvS40-Promotor (welcher in dieser Arbeit neu konstruiert wurde) und dem ipt-Gen (pS40-IPT) wurde in Weizenblättern sowohl bei künstlich induzierter als auch bei natürlicher Seneszenz exprimiert. Dies wurde mittels RT-PCR der ipt-mRNA in T0- und T2-Pflanzen nachgewiesen.
PHYSIOLOGISCHE EFFEKTE DER ÜBERTRAGUNG DES IPT-GENS UND DER ERTRAGSLEISTUNG
Um einen Hinweis auf die Funktion des ipt-Gens zu bekommen wurde der Chlorophyll-Gehalt während der induzierten Seneszenz von voll entwickelten, abgeschnittenen Fahnenblättern von transgenen T1-Pflanzen gemessen. Bei fünf von den sechs untersuchenden Transgenen zeigte sich ein deutlich geringerer Chlorophyll-Verlust was auf die Aktivität des ipt-Gens und eine erhöhte Cytokininkonzentration hindeutet. Das Chl a/b-Verhältnis war höher als bei den Kontrollen, da das Chl a während der Seneszenz-Verzögerung langsamer als das Chl b abgebaut wird.
Der Gehalt der dominierenden Cytokinine und der O-Glucoside, wurde in seneszierenden Fahnenblättern von T1- und T2-Pfanzen der drei pS40-IPT Linien analysiert. Eine beinahe Verdopplung des Cytokinin-Gesamtgehaltes gegenüber der Azygoten konnte in Extrakten der seneszierenden Fahnenblätter nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der RT-PCR Analyse der transgenen Pflanzen zeigten eine höhere Expression des ipt-Gens während der Kornfüllungsphase verglichen mit der Anthese. Allerdings war der Cytokiningehalt in intakten Pflanzen trotz des Promoters aus Gerste nicht ausreichend, um eine deutliche Seneszenz-Verzögerung hervorzurufen. Dieser Effekt von ipt-Expression kann durch den schwachen Promotor oder durch eine partielle Fremdgenstilllegung des übertragenen Gens zustande gekommen sein.
Die homozygoten T2-Pflanzen der vier Klein Brujo-Linien wurden mit den entsprechenden azygoten Pflanzen verglichen. Bei der Sorte „Klein Brujo“ wurde in allen vier transgenen Linien keine deutlich sichtbare Seneszenz-Verzögerung sowohl während der sequenziellen Seneszenz der Blattorgane als auch während der monokarpischen Seneszenz der ganzen Pflanze festgestellt. Allerdings zeigten zwei Linien gegenüber den Azygoten bei den Parametern Körner pro Ähre, Korngewicht insgesamt sowie durchschnittliches Korngewicht höhere Ergebnisse. Die Steigerung der Kornanzahl wurde durch ein niedrigeres Korngewicht nicht aufgewogen. Es ist heutzutage allgemein akzeptiert, dass die Photosynthese der Ähre einen wichtigen Beitrag zum Kornertrag liefert. Die höhere Blattanzahl sowie die längere Lebenszeit der Fahnenblätter und Ähren der zwei homozygoten Linien könnte die bessere Versorgung ihrer Körner erklären. Neben einer Bestätigung der Expression des ipt-Gens könnte sowohl die Steigerung des Cytokinin-Gehalts in der Weizenähre als auch in Endosperm-Zellen des Weizenkorns eine weitere Erklärung für die bessere Ertragsleistung der zwei transgenen Linien sein. Denn es wurde gezeigt, dass Cytokinin die Kornanzahl steigert und die Kornentwicklung stimuliert, wenn es auf die Ähre oder auf die oberirdischen Teile der Weizenpflanze aufgetragen wird.
Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sollte versucht werden, eine Seneszenzverzögerung in den Blättern durch den Transfer des ipt-Gens unter Kontrolle des homologen Seneszenz-assoziierten Promotors zu erreichen, der aber nicht in Fahnenblatt aktiv ist. Dies könnte sich letztlich günstig auf das Ährenwachstum auswirken, so dass Ähren mit einer größeren Kornzahl und somit einem höheren Kornertrag entstehen würden.
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Mineral sequestration of CO2 by reaction with alkaline residues
(2012)
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Martin Back
- With the onset of industrialization within the last 150 years, a significant increase in the concentration of the greenhouse gas carbon dioxide (CO2) is recorded in the atmosphere. According to current scientific understanding the rising atmospheric CO2 levels can be linked with high probability to the observed phenomenon of global warming. Consequently, the reduction of anthropogenic greenhouse gas emissions has become a global challenge of environmental research and policy.
In this thesis, a novel approach to achieve a long-term mineral sequestration of CO2 was studied, using alkaline residue materials. This study examined for the first time a process that allows for rapid removal of CO2 from flue gas through reaction with lignite fly ashes in aqueous solution.
In this process the basicity of the residues is utilized for mineral trapping of CO2 by precipitating stable calcite. Lignite fly ashes are a cheap, inexpensive, highly reactive byproduct of coal combustion. Due to the exposure to heat, these waste streams generally contain high amounts of reactive Ca/Mg (hydr)oxides and thus offer a high alkalinity. The alkaline residues were therefore not considered as an environmental problem, but rather as useful reactants for technical CO2 neutralization in the context of combustion processes.
Carbonates are end-products of weathering processes at the earth surface and mineral carbonation is thus assessed to be a permanent and safe storage option of CO2. Compared to alternative forms of carbon storage (e.g. the injection into gas reservoirs) cost-intensive monitoring programs for safety reasons can be omitted. Also, the carbonation generally leads to heavy metal fixation in the residues, allowing for an environmentally less problematic disposal of the products or even their industrial re-use (e.g. road construction, cement industry). Due to the common high reactivity of alkaline fly ashes no pre-treatment (e.g. grinding, using chemical additives) is needed compared to the use of natural silicate minerals as feedstock material. For these reasons mineral carbonation of alkaline residues can be considered as a process with low costs and low energy consumption, thus making it an interesting CO2 reduction pathway from an economical point of view.
In Chapter 1, the mechanisms and rates of reactions between alkaline lignite fly ash and CO2 in aqueous suspensions were evaluated. Aqueous laboratory experiments showed that CO2 from flue gas can be bound directly as carbonate. Additionally, solutions with high dissolved inorganic carbon content are formed, which can be injected into aquifers for mineral CO2 sequestration. As the dissolution rates of the alkaline mineral phases are high, gas phase CO2 transfer into the aqueous phase is mostly the limiting factor for the overall carbonation process. CO2 dissolution is controlled by the solution pH, by the available surface area of the gas/water interface and by the gradient at that interface.
The maximum conversion of 5.2 moles of CO2 per kg fly ash (≈ 0.23 kg kg-1) obtained at 75 °C demonstrates the high potential of alkaline fly ashes to sequester CO2. This value accounts for a CO2 sequestration capacity of nearly 3.5 million t of CO2 in Germany alone based on the available lignite fly ash, which corresponds to 2 percents of the CO2 emissions from lignite power combustion (168 million t a-1 in 2009).
In Chapter 2, laboratory carbonation experiments are described, which were carried out with the individual mineral phases CaO and MgO in aqueous solution. The process showed parallels with the reactions observed during carbonation of lignite fly ashes, suggesting that Ca and Mg (hydr)oxides can be used as proxies to estimate alkaline waste reaction with CO2 in general.
The carbonation of CaO happens fast, occurs at high pH values > 12 and is controlled at the mineral surface by the dissolution of Ca(OH)2. As long as Ca(OH)2 is available CO2 uptake by the system is high and leads to the simultaneous precipitation of calcite (CaCO3). Under similar conditions MgO carbonation is a slower and much more complex process. In the presence of MgO an initial pH of ~ 10.8, indicating solubility equilibrium, was reached. Subsequently, TDIC concentrations and EC increased almost linearly. The pool of MgO based alkalinity can be made available for mineral trapping if the kinetic restrictions for precipitation of Mg-carbonate can be overcome, e. g. by running the processes at higher temperature (> 50 °C) and higher s/l-ratio. Corresponding to related work the precipitation of hydromagnesite (Mg5(CO3)4 (OH)2 ∙ 4H2O) is found for temperatures above 50 ° C already at a suspended amount of 4 g L-1. Precipitation of nesquehonite (MgCO3 ∙ 3H2O)) starts upon a suspended amount of MgO of more than 10 g L-1 at 25 ° C.
In Chapter 3 the setup and the results of a model are shown, which was used to simulate and evaluate the process of alkaline material carbonation over time. Experimentally derived specific dissolution rates for CaO/MgO and CO2 are used for the development of a kinetic geochemical model based on the freely available PHREEQC algorithm. The software offers the access to databases, which containing thermodynamic constants of all common dissolved species in natural and industrial processes.
Experimental assays conducted in an aqueous carbonation reactor (see Chapter 1 and 2) were used as reference to test the model and evaluate its robustness and sensitivity.
The reaction course of the experiments based on the use of the pure phases (CaO and MgO) was successfully reproduced by our simulations. The developed model may thus be used as a valuable tool for the optimization of technical scenarios/facilities for CO2 sequestration. In order to study different mineral sequestration scenarios for calcite precipitation, we used the simulation to test the variation of process parameters and the addition of chemical additives (CaCl2, CaSO4). Finally, the simulation of the carbonation of lignite fly ash was tested using our simplified model based on CaO, MgO, calcite, anhydrite as kinetic reactants. It was shown that advanced techniques to determine the exact mineralogy of combustion residues and the extension of the availability of thermodynamic data of specific mineral phases are necessary to improve geochemical modelling in future work.
In Chapter 4, the potential contribution of lignite fly ash to mineral CO2 trapping in a high anhydrite (CaSO4) containing aquifer were analyzed. The study examined the possibility of combining underground CO2 storage and geothermal heat/energy production from an anhydrite rich aquifer. In such a scenario Ca2+ for the precipitation of calcite could be provided from the dissolution of the calcium sulfate. The dissolution of anhydrite concurrently releases acid, being counterproductive with respect to the formation of carbonates. The possibility of pH buffering by the addition of alkaline lignite fly ash is therefore appraised to optimize the conditions of carbonate precipitation.
The performed laboratory experiments, as basis for thermodynamic simulations with PHREEC, confirmed that the buffering capacity derived from the fly ashes is essential for calcite precipitation in such a system. Already with an addition of 0.1 weight percent of fly ash per volume of the injection solution the amount of precipitated calcite was maximized. The dissolution of anhydrite is associated with a concurrent increase in pore space and can balance the porespace reduction by precipitation of carbonates and secondary silicates in the geothermal reservoir.
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Untersuchungen zur anterograden Bewegung und Vererbung von Mitochondrien in Saccharomyces cerevisiae
(2012)
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Johannes König
- Mitochondrien können nicht de novo synthetisiert werden und müssen daher aktiv in die Tochterzelle vererbt werden. In Saccharomyces cerevisiae bewegen sich die Mitochondrien entlang des Aktinzytoskeletts. Dabei werden zwei mögliche Mechanismen für den anterograden Transport diskutiert. In einem Modell wird die anterograde Bewegung von Mitochondrien durch das Myo2 Motorprotein vermittelt. Im Gegensatz dazu wird in einem zweiten Modell vorgeschlagen, dass Aktinpolymerisation durch den Arp2/3-Komplex an der mitochondrialen Oberfläche die Mitochondrien in die Knospe transportiert.
Durch Analyse einer temperatursensitiven Mutante von ARC40, das für einen essentiellen Bestandteil des Arp2/3-Komplex kodiert, konnte die Rolle der Arp2/3-abhängigen Aktinpolymerisation bei der Bewegung von Mitochondrien überprüft werden. Die Ergebnisse der Versuche bei nichtpermissiver Temperatur deuten jedoch nicht auf eine direkte Rolle von Arc40 beim mitochondrialen Transport hin. Desweiteren wurde die Beteiligung von Myo2 bei der mitochondrialen Vererbung genauer untersucht. Der Austausch bestimmter Aminosäuren in der Cargo-Bindedomäne von Myo2 führt zu einer Veränderung der Morphologie und des Transportes von Mitochondrien. In dieser Arbeit konnte der Bereich der Myo2 Cargo-Bindedomäne näher charakterisiert werden, der für die Vererbung von Mitochondrien von Bedeutung ist. So führen Aminosäureaustausche in dieser Region von Myo2 zu einem Transport- und Morphologiedefekt von Mitochondrien, der durch artifizielle Verankerung des Myo2 Motorproteins in der mitochondrialen Außenmembran gerettet werden konnte. Auch die negativ synthetischen Effekte von Mutationen in der Cargo-Bindedomäne von Myo2 mit der Deletion des Gens für die am Transport der Mitochondrien beteiligte Rab-GTPase Ypt11 konnten durch Expression dieser Mitochondrien-spezifischen Variante von Myo2 aufgehoben werden. Mittels Immuno-Elektronenmikroskopie gelang es, Myo2 auf der Oberfläche von isolierten Mitochondrien nachzuweisen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Myo2 entscheidend und direkt an der Vererbung von Mitochondrien in S. cerevisiae beteiligt ist.
Um einen Rücktransport in die Mutterzelle zu verhindern, müssen Mitochondrien nach ihrem Transport in die Knospe dort verankert werden. Die genetischen Daten dieser Arbeit sprechen dabei für eine Rolle von Mmr1, einem mitochondrialen Außenmembranprotein, das die Vererbung von Mitochondrien beeinflusst. Mit Hilfe von pulldown-Experimenten wurde in dieser Arbeit versucht, weitere Kandidaten für ein mitochondriales Myo2 Adapterprotein zu finden.
Ausgehend von den genetischen Daten zum Transport von Mitochondrien wurde ein Modell entwickelt, bei dem die mitochondriale Morphologie, Ypt11 sowie eine Retention von Mitochondrien in der Knospe zum anterograden Transport durch Myo2 beitragen.
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The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 is required for maintenance of the spindle assembly checkpoint
(2012)
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Andreas Brown
- Chromosomes are replicated during S-phase and segregated during M-phase of the eukaryotic cell cycle. The two sister chromatids of each duplicated chromosome are topologically entrapped and, thus, paired by the ring-shaped protein complex cohesin. They are separated in anaphase of mitosis when cohesin is endoproteolytically cleaved by separase. Activation of this giant protease requires the degradation of its two inhibitors, securin and cyclin B1, which is mediated by the anaphase promoting complex or cyclosome (APC/C), a multisubunit ubiquitin ligase, in conjunction with its essential co-activator Cdc20.
The spindle assembly checkpoint (SAC) is a surveillance mechanism that monitors the chromosomes' interactions with the microtubules of the mitotic spindle apparatus. In response to even one erroneous attachment the affected kinetochore emits a "wait anaphase" signal, which is amplified and culminates in the quantitative sequestration of Cdc20 by the SAC components Mad2 and BubR1. The consequent inactivation of the APC/C causes a metaphase arrest and gives the cell time to correct the error. Given its great importance for chromosome segregation fidelity, it comes at no surprise that loss of the SAC causes cell death while its curtailing is associated with tumour formation.
Pin1 is a peptidyl-prolyl-isomerase with strong preference for phosphorylated Ser-Pro or Thr-Pro motives within its protein substrates. In the present thesis, evidence for the involvement of Pin1 in the maintenance of a robust SAC response is presented.
Antibodies against Pin1 were raised and used to establish the effective immunodepletion of Pin1 from extracts of Xenopus laevis eggs. While the SAC could readily be activated in mock-treated samples of this cell free system, securin was degraded despite the presence of unattached kinetochores when Pin1 had previously been removed. Proving the specificity of this effect, a SAC mediated arrest could be rescued by adding back recombinant Pin1 to depleted extracts. Similarly, addition of dominant negative but not of wild-type Pin1 to SAC-arrested extracts resulted in a checkpoint override.
Chemical inhibition of human Pin1 with two different molecules in two different cancer cells lines invariably forced the cells to exit mitosis in the absence of spindles. This resulted in the premature disappearance of securin, cyclin B1 and a mitosis-specific phosphorylation on Ser10 of histone H3. Thus, Pin1's role as a checkpoint component is conserved in mammals.
In search for the relevant target, Cdc20 was identified as a novel interaction partner of vertebrate Pin1. This association requires phosphorylation of Cdc20 on Ser-Pro/Thr-Pro sites and occurs only during mitosis. Importantly, the Pin1-Cdc20 interaction is direct and not bridged via another checkpoint component or a subunit of the core APC/C. The experimental data suggest that Pin1-dependent isomerization of Cdc20 might bias it to preferentially associate with Mad2 and BubR1 instead of APC/C.
Taken together, these findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involved in SAC signalling and unravel a previously unappreciated role of Pin1 for genome integrity.
