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Function of the ATP-dependent Metalloprotease FtsH during sporulation in Bacillus subtilis
(2008)
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Thi Thuy Ai Le
- The analysis of the function of the ftsH gene of Bacillus subtilis started about ten years ago. It was shown at that time that an ftsH knockout was viable, but exhibited a pleiotropic phenotype. Cells are sensitive to salt and heat shock, exhibit filamentous growth, are difficult to be transformed and are almost unable to sporulate. Despite the severe phenotype caused by the absence of the ftsH gene, the precise functions of this protein remained unclear. This PhD thesis presents data to elucidate the function of ftsH during sporulation. Furthermore, it describes the construction of a cold-inducible expression system. The major finding of this thesis is that the FtsH protease interferes with the synthesis and/or phosphorylation of Spo0A, the master regulator during initiation of sporulation called phase 0. In the ftsH knockout, the amount of Spo0A is greatly reduced, and the small amounts present are inactive. When the wild-type spo0A allele was replaced by an IPTG-inducible allele coding for mutant Spo0A protein being fully active in the absence of phosphorylation (Spo0A-Sad67), spores were formed at a normal rate in an ftsH knockout. Again, this result indicates that FtsH is clearly involved in the formation of active Spo0A and that this protease is only essential during stage 0 of sporulation. To become active, Spo0A needs to be phosphorylated by the multi-component system called phosphorelay. Since no active Spo0A is present in an ftsH knockout, it was hypothesized that FtsH has to degrade one or more negative regulator(s) either preventing the phosphorylation of Spo0A or/and being involving in its rapid dephosphorylation. The further analysis focused on four antagonists of the phosphorelay, three Rap phosphatases being involved in the dephosphorylation of Spo0F~P, and Spo0E which targets Spo0A~P. When a null allele in any one of them was combined with the ftsH knockout, the wild-type amount of Spo0A was restored only in the case of the ftsH spo0E knockout and the sporulation frequency was increased by two to three orders of magnitude in all double knockouts, but remained below 1%. Since overexpression of Spo0E reduces the sporulation frequency and removal of the gene from the genome has an opposite effect, a direct interaction between FtsH and Spo0E was envisaged. In vitro proteolysis assays with purified GST-FtsH and GST-Spo0E showed that Spo0E is indeed a target of FtsH. In contrast, the two homologs of Spo0E, YisI and YnzD, remained stable upon incubation with FtsH. Since all three proteins are distinguished by a C-terminal extension of about 25 amino acids present in Spo0E, but not in the two other phosphatases, these additional amino acids could serve as a target for FtsH. When two mutant versions of Spo0E, Spo0E94 and Spo0E11, with truncated C-terminal ends were analyzed, they turned out to be stable in the presence of FtsH. When the C-terminal 25 amino acids was transferred to YnzD, this fusion protein became unstable when incubated with FtsH. In conclusion, the C-terminal end of Spo0E confers instability to this enzyme. Since a spo0E knockout in a wild-type background does not result in a sporulation frequency close to 100% and a combination of a spo0E and an ftsH knockout raises the sporulation frequency only close to 1%, it can be concluded that there are additional targets for FtsH interfering with the synthesis of active Spo0A. Moreover, it is likely that FtsH also exerts a function late during sporulation. It could be shown that SpoVM, a small peptide essential for spore morphogenesis, inhibits the proteolytic activity of the B. subtilis FtsH protease in vitro. It can be inferred that SpoVM also inhibits activity of FtsH during sporulation, and in the absence of SpoVM, FtsH will degrade at least one protein essential for successful completion of sporulation. When the intracellular proteomes of spoVM+ and spoVM- cells were compared, a total of 83 proteins were identified being either completely absent or present in reduced amounts in the absence of the peptide. Analysis of the expression of the spoVM gene revealed that cells started to synthesize the spoVM transcript at stage 2 while the SpoVM peptide accumulated at stage 4. The 5´ untranslated region of the spoVM transcript has been identified to act as a negative regulator of its own transcription or translation. Furthermore, a cold-inducible expression system has been constructed allowing intra- and extracellular production of recombinant proteins. This expression system makes use of a two-component signal transduction system, which senses changes in the fluidity of the cytoplasmic membrane.
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Aktinabhängige Bewegung und Vererbung von Mitochondrien in Saccharomyces cerevisiae
(2008)
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Katrin Altmann
- Da Mitochondrien nicht de novo synthetisiert werden können, wird durch die koordinierte Vererbung von Mitochondrien und mitochondrialer DNA (mtDNA) sichergestellt, dass während der Zytokinese alle Zellen im Besitz funktioneller Organellen bleiben. Dabei ist bekannt, dass im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae das Aktinzytoskelett für diese mitochondrialen Transportereignisse verantwortlich ist. Weiterhin wird angenommen, dass über einen beide mitochondriale Membranen durchspannenden Komplex (TMS) die mtDNA während der Zytokinese an den Segregationsapparat im Zytosol gebunden wird. Allerdings sind der Mechanismus und die Komponenten der aktinabhängigen Bewegung genauso wie die Gesamtstruktur des TMS bisher nur wenig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein systematischer Screen nach essentiellen, mitochondrialen Morphologie- und Verteilungskomponenten durchgeführt. 119 Stämme einer Hefe-Bibliothek, in der die Genexpression über einen Fremd-Promotor reguliert wird, zeigten nach Abschalten des Promotors einen veränderten mitochondrialen Phänotyp. Dies ermöglichte die Identifizierung fünf zellulärer Prozesse, die für die mitochondriale Morphogenese von entscheidender Bedeutung sind: Ergosterol-Biosynthese, vesikulärer Transport, mitochondrialer Proteinimport, Ubiquitin/26S Proteasom-abhängiger Proteinabbau und aktinzytoskelettabhängiger Transport. Zwei Mitglieder der letzten Gruppe, das Klasse V Myosin Myo2 und seine leichte Kette Mlc1, wiesen dabei besonders interessante Phänotypen auf. Fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben eine ringähnliche mitochondriale Morphologie in den mutanten Zellen. Cristaestrukturen fehlten vollständig. Da diese Defekte in Zellen mit einem normal ausgeprägten Aktinzytoskelett beobachtet werden konnten, übt Myo2 wahrscheinlich einen primären Effekt auf die Interaktion zwischen Mitochondrien und den Aktinkabeln aus. Diese Vermutung wurde durch in vitro Aktinbindungs-Assays bestärkt. Dabei zeigten isolierte Mitochondrien aus Stämmen ohne Myo2 und Mlc1 und aus Stämmen mit spezifischen Punktmutationen in den Cargo-Bindungsdomänen von Myo2 eine stark beeinträchtigte Bindungskapazität. Zusätzlich ergab zeitauflösende Fluoreszenzmikroskopie der myo2-Punktmutanten, dass Myo2 auch für die knospengerichtete anterograde Bewegung von Mitochondrien verantwortlich ist. Diese Ergebnisse belegen zum ersten Mal die wichtige und direkte Beteiligung eines Myosins an der mitochondrialen Bewegung und Vererbung in S. cerevisiae. Darüber hinaus wurden Mdm31 und Mdm32, zwei funktionell unabhängige Untereinheiten zweier Komplexe der mitochondrialen Innenmembran (IM), als notwendige Komponenten der koordinierten Vererbung von mtDNA etabliert. In vorliegender Arbeit konnte dabei gezeigt werden, dass die Deletion beider Gene jeweils in dem Verlust der Interaktion zwischen mtDNA und Mmm1, einer Außenmembrankomponente des TMS, resultierte. Dies deutet auf eine Funktion von Mdm31 und Mdm32 als Innenmembrankomponenten des TMS hin.
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Assessment of grassland ecosystem functioning: Carbon dioxide exchange and the dynamics of carbon and nutrient pools in temperate and Mediterranean grasslands
(2008)
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Heydar Mirzaei
- The objectives of this study were to examine the influence of environmental variables, extreme weather events, management methods and ecosystem heterogeneity on grassland ecosystem functioning in the context of the variables CO2 exchange, nutrient dynamics, production, nitrogen and carbon pools. Two sites were selected in Central Europe, to represent temperate grassland, namely a grassland at Grillenburg and a controlled experimental grassland in the Botanical Garden of the University of Bayreuth, (both located in Germany) and additionally one site at Herdade da Mitra, Portugal, was studied as Mediterranean grassland. In the temperate grassland mowing reduced the leaf area index (LAI) as well as the biomass, with a subsequent impact on the overall assimilatory capacity of the grassland ecosystem. The pattern of root biomass development reflected seasonal variations in temperature and rainfall as well as the growth of the aboveground biomass showing peak root mass between DOY 180 and 210. Cutting increased the foliar N concentration, which came as a result of increased demand for N in the regenerating fresh tissue after the cut. During winter and early spring daily rates of net carbon exchange were low and the balance between net ecosystem CO2 exchange (NEE) and respiration was nearly zero. The gross primary productivity (GPP) at the cut site was higher than at the uncut site due to vegetation recovery at the former and senescing leaves at the latter site. Results from the artificially created grassland showed that drought altered the carbon fluxes in the grassland ecosystems without significantly changing the aboveground biomass production. A possible consequence of drought in these grass species could be an increase in the LAI due to shifts in aboveground carbon allocation from reproductive to vegetative structures. The results showed a crucial role played by species composition in regulating carbon fluxes and ecosystem productivity. The more diverse community exhibited higher potential for carbon uptake as well as increased ecosystem respiration. In the Mediterranean grassland, trees added considerable amounts of nutrients to the soil beneath their canopies, and have the potential to facilitate understory production. Although there was no significant difference in the total biomass accumulation between understory and open locations, analysis of soil N concentration revealed higher soil N under the trees. Although NEE was limited by light intensity in the understory, model projections of GPP showed no difference between the understory and the open locations in their potential assimilatory capacities. Significant differences, however, occurred between the two locations in ecosystem respiration. Depending on the location (open or understory), grazing influenced CO2 exchange processes differently. We found no significant differences in GPP between grazed and ungrazed sites in the open locations, while large differences occurred in the understory, with lower NEE in the grazed as compared to the ungrazed locations. Mean maximum foliar N concentration in the temperate grassland occurred in mid-May, coinciding with early growing season, with 3.4% nitrogen, whereas in the Mediterranean grassland, it reached a peak value in early April which was lower (2.3 %), averaged over the stand biomass. As in the case of the foliar N, the root N concentration was also lower in the Mediterranean grassland (ca. 1 %) as compared to the temperate grassland (1.5 %). In terms of available N in the soil solution, it was low at Mitra (ca. 0.2 micromol g-1 soil) in early spring while it remained near 0.6 micromol g-1 soil throughout the season at Grillenburg. Thus, the development of biomass is sensitive to fluctuations in temperature and radiation during the optimal period for growth, but the total biomass accumulation is at a lower level in the Portuguese grasslands (as well as in the botanical garden) due to greater nutrient limitation. Mediterranean and temperate grasslands were found to differ more strongly than expected due to nutrient availability, which depends on the prevailing higher temperatures, annual changes in water balance and possibly nutrient removal from the ecosystem in Mediterranean regions.
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P1/HC-Pro aus dem Weizenstrichelmosaikvirus als Suppressoren des RNA silencing in Weizen
(2008)
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Ulrich Sentner
- Die Expression von Transgenen in Weizen ist oft schwach und instabil. Dies wird auf die Fähigkeit des Weizens zurückgeführt, die Expression eingebrachter Gene durch RNA silencing vermindern zu können. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Expression von Transgenen und möglicherweise auch die Transformationseffizienz (d.h. Anzahl transgener Pflanzen pro verwendetem Explantat) in Weizen durch Suppressoren des RNA silencing aus pflanzlichen Viren erhöht werden kann. Einer der bekanntesten Suppressoren ist P1/HC-Pro (protein1/helper-component-proteinase) aus Potyviren (Fam. Potyviridae), dessen Wirkung in Tabak und Arabidopsis thaliana beschrieben wurde. P1/HC-Pro ist als amino-terminaler Teil des viralen Polyproteins definiert, der durch autokatalytische Spaltung in die reifen Proteine P1 und HC-Pro prozessiert wird. Die Expression von p1/hc-pro in Tabak bewirkt eine erhöhte Expression des Reportergens glucuronidase (gus), gleichzeitig allerdings auch Kümmerwuchs und Entwicklungsstörungen der transgenen Pflanzen. Analog zu dem verwendeten P1/HC-Pro des jeweiligen pathogenen Virus, nämlich Tobacco etch virus in Tabak und Turnip mosaic virus in A. thaliana, sollte untersucht werden, ob das ähnliche P1/HC-Pro aus dem Weizenstrichelmosaikvirus (WSMV, einem Tritimovirus ebenfalls aus der Familie Potyviridae) als Suppressor des RNA silencing in Weizen wirkt. Zu diesem Zweck wurden Weizenembryonen mit p1/hc-pro aus WSMV sowie gleichzeitig mit dem Reportergen green fluorescent protein (gfp), beide unter Kontrolle des konstitutiven Ubiquitin-Promotors, transformiert und die Wirkung von P1/HC-Pro auf die gfp-Expression verfolgt. In Gegenwart von P1/HC-Pro konnte im Vergleich zur Kontrolle (d.h. nur mit gfp transformierten Embryonen) eine statistisch sehr signifikante, um den Faktor zwei erhöhte gfp-Expression beobachet werden. Überraschenderweise wurde eine gleichermaßen erhöhte gfp-Expression auch in Gegenwart von P1 alleine beobachtet, nicht jedoch in Gegenwart von HC-Pro alleine. Nicht nur die Suppressorfunktion an sich scheint sich von HC-Pro aus Potyviren auf P1 aus WSMV verlagert zu haben, auch einzelne Motive von P1 scheinen eine andere Funktion erhalten zu haben. Eine Insertionsmutation des konservierten FIVRG-Motivs in P1 aus TEV bewirkt in p1/hc-pro-transgenen Tabakpflanzen beispielsweise einen attenuierten Phänotyp, ohne die Aktivität des Suppressors P1/HC-Pro bezüglich der erhöhten Expression des Reportergens gus zu beeinträchtigen. Die Zerstörung des homologen FIVMG-Motivs durch eine Insertionsmutation in P1 aus WSMV führte zu einem vollständigen Verlust der Suppressoraktivität, unabhängig davon, ob p1 alleine oder als Teil des Polyproteins P1/HC-Pro exprimiert wurde. Das FIVMG-Motiv hat vermutlich entweder eine direkte Wirkung auf die Suppressoraktivität von P1 aus WSMV oder stabilisiert die dreidimensionale Struktur einer darin involvierten Domäne. Aufgrund der schädlichen Wirkung viraler Suppressoren wie P1/HC-Pro auf die pflanzliche Entwicklung war es trotz großer Bemühungen auch an dem weltweit in der stabilen Transformation von Weizen führenden Institut, dem International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT) in Mexiko, nicht möglich, konstitutiv p1/hc-pro- oder p1-exprimierende Weizenpflanzen zu erhalten. Es konnten jedoch elf transgene Weizenlinien zur Estradiol-induzierbaren Expression von p1 erhalten werden. Die beobachtete, verzögert einsetzende und gehemmte Keimung von Embryonen aus p1-transgenen Pflanzen nach Estradiol-Induktion unterstützt die Vermutung, dass der Suppressor P1 eine schädliche Wirkung auf das Wachstum der Weizenpflanzen hat. Dies könnte bei konstitutiver Expression eine Regeneration transgener Pflanzen verhindern. Des Weiteren konnte eine um bis zu dem Faktor zwei erhöhte Expression des Reportergens gus nach Estradiol-Induktion der Expression von p1 beobachtet werden. Die anhand transient und stabil transformierter Pflanzen gewonnenen Erkenntnisse unterstützen die Vermutung, dass P1 aus WSMV als Suppressor des RNA silencing in Weizen wirkt und dass das Zusammenwirken mit HC-Pro für die Aktivität des Suppressors nicht notwendig ist. Die Strategie, konstitutiv exprimierte Suppressoren zur Steigerung der Expression von Transgenen zu nutzen, scheint aufgrund schädlicher Wirkungen auf die pflanzliche Entwicklung nicht erfolgversprechend. Stattdessen könnte man an eine zeitlich begrenzte Expression im Rahmen eines induzierbaren Systems denken. Der Suppressor P1 könnte in neuen, kommerziellen Weizenkultivaren verwendet werden und dort eine hohe Expression von Transgenen zur Erhöhung der Stresstoleranz (insbesondere Trockenheits- und Salztoleranz), Pilzresistenz, Herbizidresistenz oder zur Verbesserung der Kornqualität gewährleisten. Hauptpunkte dieser Arbeit sind der Nachweis von P1 aus WSMV als neuer Suppressor des RNA silencing in Weizen und die Etablierung eines funktionellen, chemisch-induzierbaren Systems für Weizen.
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Einfluss unterschiedlicher Stickstoffdüngung auf die Aminosäurekonzentration und -zusammensetzung des Phloemsaftes von Tanacetum vulgare (L.) und auf das Such- und Saugverhalten der monophagen Blattlausarten Uroleucon tanaceti (Mordv.) und Macrosiphoniella tanacetaria (Kalt.)
(2008)
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Heike Nowak
- Der Einfluss von unterschiedlicher Stickstoffdüngung auf die Aminosäurekonzentration und -zusammensetzung des Phloemsaftes von Tanacetum vulgare L. wurde untersucht sowie Verhaltensbeobachtungen an den Blattlausarten Uroleucon tanaceti (Mordv.) und Macrosiphoniella tanacetaria (Kalt.) durchgeführt, um zu klären, ob die Aphiden Unterschiede zwischen verschieden stickstoffversorgten Pflanzen wahrnehmen und Präferenzen für bestimmte Pflanzen zeigen. Für die Bearbeitung dieser Fragestellung wurden genetisch identische Pflanzen 1 - 3 Monate mit Nährlösungen angezogen, welche alle benötigten Mikro- und Makronährstoffe in gleichen Mengen enthielten, sich jedoch in der N-Konzentration unterschieden (1, 3, 6, 12 mM NH4NO3). Die ansteigende N-Konzentration in den Nährlösungen führte zu einer Zunahme der oberirdischen Biomasse und den Blattflächen sowie zu einer Abnahme der Wurzel/Spross- und C/N-Verhältnisse. Ein Vergleich der C/N-Verhältnisse von Freilandpflanzen mit denen im Gewächshaus mit Nährlösung angezogenen Pflanzen und die Bestimmung von Nitrat- und Ammoniumkonzentrationen in den Bodenlösungen von Rainfarnhabitaten zeigten, dass die 1 und 3 mM Nährlösungen den Stickstoffbedingungen natürlicher Standorte entsprachen. Zur Gewinnung des reinen Phloemsaftes wurde die Methode der Stylektomie oder Aphidentechnik durchgeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Aminosäurekonzentration im Phloemsaft positiv mit der zunehmenden N-Versorgung korrelierte. Ein Einfluss auf die Phloemsaftzusammensetzung konnte für folgende Aminosäuren gezeigt werden: Arginin, Aspartat, Asparagin, Glutamat, Glutamin, Isoleucin, Methionin + Tryptophan, Phenylalanin und Valin. Allerdings hatten die für die Stylektomie verwendeten Blattlausarten einen zusätzlichen Einfluss auf die Zusammensetzung des Phloemsaftes. So war der prozentuale Anteil der Aminosäuren Valin, Phenylalanin Leucin und Methionin + Tryptophan bei Befall mit U. tanaceti erhöht, während der Befall der Pflanzen mit M. tanacetaria einen prozentualen Anstieg von Serin verursachte. Weiterhin wurde die zeitliche und örtliche Variabilität des Phloemsaftes untersucht. Dazu wurden Phloemsaftproben verschiedener Siebröhren eines Blattes sowie mehrere aufeinander folgende Proben einer Exsudation gesammelt und verglichen. Es zeigten sich starke zeitliche Schwankungen in der Zusammensetzung des Spektrums. Die Sammelstelle am Blatt beeinflusste die Zusammensetzung des Phloemsaftes nur geringfügig, da signifikante Unterschiede zwischen zwei Siebröhren nur für ein Blatt festgestellt wurden. Die Gesamtkonzentration der Aminosäuren war allerdings zwischen den Siebröhren eines Blattes zum Teil sehr unterschiedlich. Diese lag im Durchschnitt bei 91 - 655 mM. Die Saccharosekonzentration war mit 1,3 ± 0,5 M hingegen relativ konstant, wobei ein durch Verdunstungseffekte bedingter Anstieg der Konzentration im Verlauf der Sammelzeit beobachtet wurde. Parallel zu Analysen des Phloemsaftes wurden auch Konzentration und Zusammensetzung der Aminosäuren im Honigtau von Blattläusen bestimmt, welche an den für die Stylektomie verwendeten Pflanzen saugten. Es zeigte sich, dass alle in den Phloemsaftproben vorhandenen Aminosäuren auch im Honigtau nachgewiesen werden konnten, allerdings waren die Konzentrationen der Aminosäuren im Honigtau signifikant niedriger als im Phloemsaft. Die am höchsten konzentrierten Aminosäuren im Honigtau waren Aspartat, Asparagin, Glutamat, Glutamin und Serin. Der Vergleich der Aminosäurespektren beider Probenarten zeigte, dass Arginin, Glutamat, Glutamin sowie Methionin + Tryptophan im Honigtau gegenüber dem Phloemsaft signifikant reduziert waren, während der Gehalt von Phenylalanin im Honigtau signifikant höher war als im Phloemsaft. Die unterschiedliche N-Versorgung hatte auch einen Einfluss auf die Saugaktivität von U. tanaceti und M. tanacetaria, die mittels Electrical Penetration Graph (EPG) beobachtet werden konnte. Dabei wurde das Verhalten von insgesamt 206 Blattläusen innerhalb der ersten 8 Stunden nach dem Ansetzen an unterschiedlich N-versorgten Pflanzen analysiert. Die Blattläuse beider Arten benötigten durchschnittlich 3 Stunden um die Siebröhren zu finden, zeigten dann aber signifikant längere Phloemsaugphasen bei Pflanzen höherer N-Versorgung. Die Individuen der Art U. tanaceti zeigten die längsten Phloemaufnahmephasen an 6 mM NH4NO3-versorgten Pflanzen, während die Aphiden der Art M. tanacetaria nur an den 1 mM Pflanzen signifikant kürzere Saugphasen aufwiesen. Zusätzlich zu den EPGs wurden Präferenzversuche mit den beiden Blattlausarten durchgeführt, bei denen die Tiere zwischen Blättern unterschiedlich N-versorgter Pflanzen frei wählen konnten. Die Verteilung der Blattläuse sowie deren Reproduktionsrate wurden nach 48 Stunden ausgezählt. Auch bei diesen Versuchen zeigte sich, dass beide Arten die Pflanzenqualität offenbar wahrnehmen konnten, da sie Pflanzen höherer N-Düngung bevorzugten und auf diesen mehr Larven absetzten.
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Schülerzentrierte drogenspezifische Primärprävention an bayerischen Hauptschulen: Wirkungen auf Wissenserwerb, Selbstwertgefühl und Selbstwirksamkeit
(2008)
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Thomas Heyne
- Suchtprävention ist für Lehrer/innen an bayerischen Hauptschulen eine besondere Herausforderung. Neben generellen Unsicherheiten in der Bestimmung der Inhalte und Auswahl geeigneter Unterrichtsmethoden muss das vergleichsweise niedrige kognitive Leistungsniveau dieser Schüler/innen beachtet werden. Zusätzlich gibt es zwei differente Leistungsebenen, zum einen die ursprünglichen Regelklassen, zum anderen die so genannten Mittlere-Reife-Züge, die jenseits des Qualifizierenden Hauptschulabschlusses einen Mittleren Bildungsabschluss ermöglichen. Zentraler Schwerpunkt dieser Studie war die Konzeption, Implementierung und Evaluation eines an den engen zeitlichen Vorgaben des Hauptschullehrplans angepassten suchtpräventiven Lebenskompetenzprogramms für achte Jahrgangsstufen. Die pädagogische Wirksamkeit wurde in Abhängigkeit von vier Konsumgruppen untersucht, die mittels einer Clusteranalyse extrahiert wurden. Als Indikatoren dienten die psychologischen Konstrukte Selbstwertgefühl und Selbstwirksamkeitserwartung im Umgang mit drogenspezifischen Gruppendrucksituationen. Die empirische Untersuchung beschäftigte sich zunächst mit der Entwicklung einer speziell für leistungsschwache Hauptschüler geeigneten offenen, konstruktivistischen Unterrichtsmethode, die einen hochwertigen Wissenszuwachs für die aktuell gängige Einstiegsdroge Cannabis sicherstellen sollte. So sollten bereits vorhandene, den Drogenkonsum ablehnende Meinungen verstärkt bzw. bestehendes Konsuminteresse abgeschwächt werden und in der Folge die Jugendlichen positiv auf die Selbstwertgefühls- und Selbstwirksamkeits-stärkung ansprechen. Das Ergebnis war ein "Geführtes Stationenlernen", welches zur Beurteilung des kognitiven Lernerfolges dem "Konventionellen Stationenlernen" und einem "Lehrerzentrierten Unterricht" gegenübergestellt wurde. Hauptschüler/innen erzielten mit der neu entwickelten Unterrichtsmethode kurz- und langfristig einen signifikant höheren kognitiven Wissenszuwachs, auch leistungsschwächere Regelschüler/innen erreichten das Leistungsniveau der Mittleren-Reife-Klassen. Bei der sich anschließenden Selbstwertgefühls- und Selbstwirksamkeitsschulung konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich nur die Gruppe auf die eingeleiteten Maßnahmen reagierte, die kein Interesse am Drogenkonsum aufwies. Langfristig konnte bei dieser Gruppe unabhängig von den drei vorangestellten Unterrichtsmethoden positive Veränderungen erzielt werden. Entscheidend waren demnach die gewählten Unterrichtsinhalte. Die Betrachtung der Veränderungszeitpunkte bestätigte aber dem neuen Unterrichtsansatz Vorteile. Nur bei dieser Methode konnten bei der Selbstwirksamkeitserwartung direkt nach der Intervention beide Geschlechter erreicht werden. Beim Selbstwertgefühl kam es bereits mittelfristig zu Fortschritten. Kurzfristig wurden auch die Jugendlichen in ihrer Selbstwirksamkeit beeinflusst, die als Konsumgruppe ein sehr hohes Interesse an einem Erstkonsum aufwiesen. "Probierer" und regelmäßige Konsumenten wurden von der primärpräventiven Intervention nicht angesprochen.
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Hormonal regulation and environmental influences in the reproduction of the butterfly Bicyclus anynana
(2008)
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Thorin Lukas Geister
- Regarding hormonal control of reproduction, the butterfly Bicyclus anynana belongs to a group of the Lepidoptera, in which egg maturation starts after eclosion, and thus vitellogenesis and choriogenesis seem to depend exclusively on juvenile hormones (JH). Using a JH mimic (pyriproxyfen) and an antagonist of JH biosynthesis (MK-801), reproduction in B. anynana could be successfully manipulated towards either a higher or lower fecundity. Especially early fecundity responded to manipulations. Furthermore, both JH III and JH II were found in the hemolymph throughout lifetime. Nevertheless, fecundity and vitellogenin titres were not clearly related to JH titres, as both decreased continuously with age, although JH III titres stayed constant and JH II titres increased. Thus, reproduction in B. anynana is at least to some extent under hormonal control, with JH being probably an important signal especially for the initiation of reproduction. Oviposition temperature induces a plastic response in egg size and number in B. anynana. While more but smaller eggs are laid at high temperatures representing wet season conditions, larger but fewer eggs are oviposited at lower temperatures, which are experienced in the dry season. This plasticity is thought to be adaptive in this species inhabiting seasonal environments. Vitellogenins are representing a major part of eggs and consequently, JH dynamics represents an obvious target for changes in egg size, as vitellogenin synthesis and/or incorporation into developing eggs might increase or decrease through changes in JH titres. Female B. anynana butterflies exposed to different oviposition temperatures showed the expected response to adult temperature, producing fewer but larger eggs at the colder temperature, but more and smaller eggs at the warmer temperature. However, no evidence was found that this striking example of phenotypic plasticity is under hormonal control, as JH III, JH II, vitellogenin titres and egg proteins showed no significant variations across temperatures. Based on these similar patterns across temperatures, the results in this thesis suggest that the temperature-mediated reproductive plasticity is not mediated through JH in B. anynana. The known fitness advantage of the larger eggs produced at lower temperatures in B. anynana may be related to size per se, to a larger absolute amount of nutrients or to relative changes in egg composition. Therefore, this thesis explored the consequences of temperature variation on egg and hatchling composition, and the associated use and turnover of energy and egg compounds in relation to temperature. Overall, larger eggs produced at the lower temperature were achieved by providing these eggs with larger quantities of all compounds investigated and thus more energy, whilst relative egg composition was rather similar to that of smaller eggs laid at the higher temperature. Turnover rates during embryonic development differed across developmental temperatures, suggesting an emphasis on hatchling quality (i.e. protein content) at the more stressful lower temperature, but on storage reserves (i.e. lipids) at the higher temperature. These observed differences may consequently represent adaptive maternal effects. The availability of adequate adult nutrition is essential for successful reproduction in B. anynana, as without access to carbohydrates in the adult stage no eggs will be produced. A commonly used method for estimating the fitness effects of diets is determining the number and sometimes sizes of eggs produced and often not including offspring viability. Five different nutritional treatments were used for female B. anynana butterflies ranging from moist banana, plain sucrose solution, to sucrose solution enriched with lipids, yeast and finally minerals and vitamins. These treatments were analyzed with regard to their effects on egg composition as well as egg hatchling success. Adult diet was demonstrated to have pronounced effects on fecundity, egg composition and egg hatching success, with butterflies feeding on the complex nutrition of banana fruit performing best. Vitamins and minerals in a sucrose-based diet increased fecundity, but did not affect offspring hatching success. Effects of adult diet on egg composition were not straightforward, indicating complex interactions among specific compounds. Total egg energy and water content seemed to be related to hatching success of progeny. The results of this thesis demonstrate that egg composition should be taken into account in such studies, as egg size and number does not necessarily represent a reliable proxy for reproductive energetic investment.
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Thermal adaptation in butterflies: patterns, significance and mechanisms
(2008)
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Isabell Karl
- Temperature is one of the most important ecological factors affecting biological organization directly and indirectly on nearly all spatial and temporal scales. As in nature organisms are often faced with variation in mean temperatures as well as in temperature extremes, they have to adapt plastically and/or genetically to their respective environmental conditions or will otherwise risk extinction. Using the Copper butterfly Lycaena tityrus as model organism, this study focuses on the patterns, significance and mechanisms of thermal adaptation in ectotherms on three main issues: (1) the mechanistic basis of the temperature-size rule (TSR), (2) altitudinal patterns potentially related to thermal performance and (3) the genetic background of such variation. Following the TSR (being bigger at colder rearing temperatures) in L. tityrus is mainly caused by two different components: a behavioural and a physiological one. During the prolonged development at colder temperatures, larvae showed an increased food intake, a lower assimilation, but a higher efficiency in converting the ingested food into body matter (chapter 5). Sexual differences in body mass, however, were caused by another mechanism. The males’ higher growth rates are evidently combined by a higher daily food consumption, while total food consumption and assimilation was higher in females. And, in contrast to temperature-induced variation in body size, sexes did not differ in the efficiency of converting ingested food into body matter. In addition to such phenotypic patterns, a contribution of directional selection on traits related to fitness is inferred from clinal variation in such traits, and analyzing such variation has consequently become a key element in investigating adaptive evolution. In L. tityrus, altitudinal variation in life-history traits, temperature-stress resistance and flight performance (chapter 6.1), but also in the expression of heat-shock proteins (chapter 6.2), is present. While longer developmental times in high-altitude populations can be explained by a change in voltinism, reduced heat resistance and plasticity in the expression of heat-shock proteins, but increased cold resistance and flight duration across a range of ambient temperatures demonstrate local adaptations to regional climates. Furthermore, by rearing butterflies in both studies at different temperatures, environmentally-induced plasticity is demonstrated to be as important as genetic factors in mediating adaptive responses. Consequently both sources of variation need to be considered when trying to predict responses to short- (such as particularly hot or cold days / nights) or long-term temperature variation (such as global warming). Finally, this thesis also deals with answering the genetic background of such altitudinal variation. Butterflies from L. tityrus populations varying in altitude are clearly separated into an alpine (high-altitude) and a non-alpine (low-altitude) cluster (chapter 7.1). This geographic differentiation is primarily caused by variation at one single locus, the PGI locus, with one homozygote genotype, PGI-2-2, dominating in all alpine populations, while low-altitude populations show much more heterogeneous distributions with many heterozygotes. Interestingly, the genotype dominating in high-altitude populations (PGI 2-2) exhibited the shortest chill-coma recovery times compared to all other genotypes, and also shows intermediate to long development times, thus showing characters typical of high-altitude populations (chapter 7.2). These findings support the notion that the PGI locus is involved in thermal adaptation in L. tityrus and possibly other arthropods.
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Water permeability of plant cells measured by pressure probes: effects of light and turgor, and the role of unstirred layers
(2008)
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Yangmin Kim
- The dissertation focuses (i) on an analysis of effects of unstirred layers (USLs) during measurements of water permeability (hydraulic conductivity) at the level of single cells, during measurements with the cell pressure probe (CPP) and (ii) on the use of the latter technique to investigate changes in water permeability of leaf cells in response to light. Internodes of the giant green alga Chara corallina and parenchyma cells of corn leaves were used in the studies. Besides the water, the CPP has been employed to study solute flows across cell membranes. This allowed evaluating the role of different types of USLs. In response to claims, recently raised by Tyree et al. (2005) that USLs play a significant or even dominating role in measurements of transport coefficients with the cell pressure probe, a rigorous re-examination of effects of USLs with Chara internodes has been performed indicating a minor role of USLs. For the first time, responses of cell water relations to light have been worked in some detail. Light effects have been separated from those of turgor in intact tissue cells by compensating for transpiration. At low light (LL) intensity (100 to 650 micromol m-2 s-1), hydraulic conductivity of a cell (cell Lp) increased with increasing light intensity by a factor of 2 to 6 in 10 min. However, at high light (HL) intensities of 800 and 1800 micromol m-2 s-1, there was a decline of cell Lp with increasing light intensity at constant cell turgor by factors of 14 and 35, respectively. The effects of LL refer to literature data of overall measurements of the leaf conductances (Kleaf). Decreases of Kleaf at HL have not yet been separated for effects of turgor or light intensity, respectively (as done here). The responses to HL were most likely caused by an oxidative gating of water channels (aquaporins; AQPs), as indicated by the fact that (i) application of reactive oxygen species (ROS) resulted in responses similar to those of HL and (ii) HL effects could be reversed in the presence of the antioxidant glutathione. For the first time, the data indicate an interaction between water relations and light intensity/photosynthesis, which is most likely related to changes in the redox status of leaves.
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Adaptation or physiological constraint: Temperature-mediated plasticity in Reproduction.
(2008)
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Marc Johan Steigenga
- Da Lebewesen in der Natur oft mit Temperatur variation konfrontiert werden, sind sie gezwungen, sich entweder plastisch oder genetisch an diese wechselnden Umweltbedingungen anzupassen. Weil die Eigröße von Arthropoden, und damit auch die Größe ihrer Nachkommen, aus evolutionärer sowie ökologischer Sicht eine wichtige Eigenschaft darstellt, zeigt die Fortpflanzung von Arthropoden häufig eine durch die Temperatur vermittelte phänotypische Plastizität. Die vorliegende Studie, in welcher der tropische Schmetterling Bicyclus anynana als Modellorganismus verwendet wird, konzentriert sich auf die Mechanismen, welche der temperaturvermittelten reproduktiven Plastizität zu Grunde liegen. Ein Halbgeschwister-Verpaarungsexperiment (Kapitel 5.2) zeigte, dass die Eigröße von B. anynana in Abhängigkeit von der Temperatur schwankt. Weiterhin ergab sich, dass die Plastizität von Eigröße eine erbliche Komponente aufweist. Die additiven genetischen Effekte auf die Eigröße waren jedoch schwach ausgeprägt und unterschieden sich ziemlich stark von anderen Studien, welche sich der Eigrößenerblichkeit von Bicyclus anynana widmeten. Im Gegensatz zur additiven genetischen Varianz waren die mütterlichen Effekte in dieser Untersuchung durchgehend hochsignifikant, was eine relativ hohe Erblichkeit der mütterlichen Anteile zur Folge hatte. Die naheliegendste Erklärung ist, dass die maternalen Effekte vom weiblichen Genotyp stammen. Diese Resultate implizieren, dass die durch die Temperatur vermittelte Eigrößenplastizität bei dieser Art adaptiv sein könnte, da die notwendigen Bedingungen für das Auftreten evolutiver Veränderungen von phänotypischer Plastizität erfüllt sind. Nicht-genetische parentale Effekte können den Phänotyp ebenfalls stark beeinflussen und sind möglicherweise adaptiv. Maternale Effekte könnten in der Lebensgeschichte von B. anynana eine erhebliche Rolle spielen. Mit Hilfe eines Temperaturtransfer-Experimentes (Kapitel 5.2) wurden beträchtliche generationenübergreifende, parentale Effekte festgestellt, welche in der Frühentwicklung am stärksten ausgeprägt waren und sich mit der Zeit verringerten. Höhere Temperaturen während der Entwicklung verminderten Entwicklungszeiten und Eigröße und ließen die Eizahl ansteigen, wirkten sich jedoch nicht auf das Puppengewicht aus. Die Temperaturbedingungen in der vorhergehenden Generation beeinflussten, ähnlich der Entwicklungstemperatur, die Entwicklungszeit der Puppen und Larven, die larvale Wachstumsrate sowie die Eigröße. Darüberhinaus wirkten sie sich auf das Gewicht der Puppen aus, nicht jedoch auf die Eizahl. Parentale Effekte sind daher wichtige Vermittler der phänotypischen Plastizität von B anynana und können antagonistisch auf verschiedene Fitnesskomponenten wirken, welche die Evolution der generationenübergreifenden adaptiven Plastizität bei dieser Schmetterlingsart einschränken könnten. Derartige phänotypische Plastizität könnte auf Variation in Juvenilhormon-Titern zurückzuführen sein, vor allem wegen seiner weitverbreiteten regulatorischen Rolle in der Lebensgeschichte von Insekten. Weibliche B. anynana-Schmetterlinge, denen am 4. oder 5. Tag ihres adulten Lebens Pyriproxifen (Kapitel 6.1), ein Analog von Juvenilhormon, verabreicht wurde, wiesen, verglichen mit den Kontrolltieren, gesteigerte Eiablageraten bei verkürzter Lebensdauer auf. Die Auswirkungen von Pyriproxifen waren vorübergehend und auf einige Tage nach der Anwendung beschränkt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Weibchen zu Beginn ihrer Eiablageperiode am sensibelsten auf Pyriproxifen reagieren. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass der Juvenilhormontiter bei anderen Lepidopteren in dieser Zeit von Natur aus ansteigt. Weiterhin könnte durch Juvenilhormon ein möglicher ‚Trade-off‘ zwischen gegenwärtiger und zukünftiger Fortpflanzung gesteuert werden. Effekte der Temperatur auf die Eireifung wurden bislang wenig untersucht, wobei verschiedene alternative Hypothesen versuchen, phänotypische Plastizität bei der Fortpflanzung zu erklären. Ein Temperaturtransfer-Experiment mit anschließender Ovarienpräparierung bei B. anynana-Weibchen (Kapitel 6.2) ergab einen gesteigerten Fortpflanzungsaufwand mit einer höheren Anzahl kleinerer Eier bei der höheren Temperatur und einer kleineren Anzahl größerer Eier bei der niedrigeren Temperatur. Die Anzahl unchorionisierter Oozyten fällt während der Eiablage von einem anfänglichen Höhepunkt zu einer geringeren Zahl hin ab, wobei die Anzahl chorionisierter Oozyten während den Tagen 0-6 der Eiablage am höchsten war. Der prozentuale Anteil stieg zu Beginn der Eiablage aufgrund von Chorionisierung, gefolgt von einem späteren Rückgang. Die Zahl der Oozyten unterschied sich nicht zwischen den Temperaturen, aber die Größe der terminalen Oozyten stieg bei niedrigerer Temperatur eindeutig an. Paarung minderte die Anzahl chorionisierter und unchorionisierter Oozyten. Dies lässt darauf schließen, dass die Paarung einen wichtigen Stimulus für die Eiablage darstellt, ohne den unverpaarte Weibchen ihre Eier so lange wie möglich zurückbehalten. Angesichts gleichbleibender Oozytenzahlen in den Ovarien über alle Temperaturen zu jedem Zeitpunkt, aber stark verminderter Eiablageraten bei niedrigeren Temperaturen, deuten die Daten auf verminderte Raten der Oozytenproduktion bzw. Differenzierung bei niedrigeren Temperaturen hin.
