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Regulation of Progression through Unperturbed Mitosis and in the Presence of Environmental Stress
(2007)
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Rahul Pandey
- During mitosis, the replicated genome is distributed onto two daughter cells. Perfect regulation of progression through mitosis is essential for an error-free segregation and propagation of the genome. Surveillance pathways like the mitotic spindle checkpoint have evolved to prevent mitotic defects effectively. The molecular basis of these regulatory mechanisms is particularly well understood in budding yeast. It is not entirely clear to what extent these findings are valid for other eukaryotes as well. Therefore, in a first part, I have addressed the function of Drosophila Separase, a protease which has been implicated in several regulatory processes in budding yeast. Although an essential role of this protease for sister chromatid separation has been demonstrated in a wide range of eukaryotes, its involvement in additional processes still remains controversial. In budding yeast, separase promotes rapid exit from mitosis in a dedicated regulatory network known as FEAR. In Drosophila, a FEAR-like role could not be confirmed. Similarly, an essential involvement in the duplication of centrosomes, which form the poles of mitotic spindles in metazoan cells and are highly divergent from the functionally equivalent fungal spindle pole bodies, could not be demonstrated. In a second part I have analyzed the importance of surveillance mechanisms (in particular the mitotic spindle checkpoint) for progression through mitosis in the presence of environmental stress like anoxia and hypothermia. So far, the interaction of environmental stress with mitotic regulation has been largely neglected. However, oxygen deprivation leads to a rapid and reversible mitotic arrest. Here, anoxia is shown to have rapid effects on spindle and kinetochore function which are proposed to cause the observed efficient activation of the mitotic spindle checkpoint. Moreover, the consequences of anoxia were found to be very similar to those caused by inhibitors of oxidative phosphorylation. This suggests that the reduction in ATP levels is responsible for metaphase arrest in anoxia. Interestingly, the mitotic spindle checkpoint was also found to be important for survival in hypothermia, and the early syncytial stages which are characterized by an extremely rapid progression through mitotic cycles, were found to be the most cold-sensitive stages of Drosophila embryogenesis.
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Phosphate nutrition in the Ricinus communis L. seedling
(2007)
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Dang Khoa Tran
- Phosphate (Pi) is one of the essential macronutrients required for growth and development of plants. Pi plays an important role in various metabolic processes, such as photosynthesis, respiration, energy conservation, carbohydrate metabolism and signal transduction. Although various Pi starvation induced genes have been isolated from different plant species grown under conditions of Pi starvation, information about their functions during germination and growth of seedlings is still lacking. During germination Pi stored in the endosperm is mobilized and transported to growing organs of seedlings, thus a phosphate transporters and acid phosphatases are expected to be involved in these processes. The aim of this study was to clarify the translocation of Pi within the seedlings and to identify the involvement of phosphate transporters and acid phosphatases in the growth of seedlings. Uptake into the phloem was analyzed by incubating the cotyledons in Pi. The movement of 32P-labeled applied as an inorganic phosphate (Pi) was detected from the cotyledons to the hypocotyl, in particular to its apical hook near the cotyledons, suggesting that Pi moves from the Ricinus communis L. cotyledons through the hypocotyl via phloem and partially re-circulates in the xylem or leaks out through the roots. Therefore reducing the efflux could be as important for the plant as increasing the efficiency of the uptake mechanism. Following the Pi uptake into the roots, the translocation of 32P-labeled Pi to the cotyledons through the hypocotyl via the xylem showed that a high amount of radiotracer accumulated in the cotyledons. The accumulated Pi in the cotyledons can be retranslocated to the roots via phloem. This work describes the cloning of the phosphate transporter RcPT1 and the acid phosphatase RcPS1 genes by RT-PCR from Ricinus seedlings grown under Pi starvation conditions. Phosphate transporter RcPT1 contains an open reading frame encoding a 530 amino acid polypeptide with a calculated molecular mass of 59 kD. The expression of RcPT1 in the yeast high-affinity phosphate transporter mutant strain complemented the mutant and enhanced the cell growth significantly. Southern blot analysis showed that the RcPT1 gene is present as a single or low-copy gene in the Ricinus genome. The transcripts of RcPT1 were expressed in the endosperm, cotyledons, hypocotyl and roots during germination. In detail in situ hybridization studies revealed RcPT1 expression in the adjacent area of endosperm to cotyledon, in the phloem and in the lower epidermis of cotyledons; Immunolocalization analysis showed RcPT1 accumulation at the same sites as its mRNA. In addition, RcPT1 transcripts were also found in the phloem of hypocotyl, and the epidermis and the steles of roots. These results implicated that RcPT1 is involved in the movement of Pi from endosperms to cotyledons and the redistribution of Pi within seedlings via phloem during germination. Acid phosphatase RcPS1 shows a 747 bp open reading frame encoding a 248 amino acids polypeptide with a calculated molecular mass of 27,5 kD. The amino acid sequence of RcPS1 shares significant similarity with the acid phosphatase LePS2 from tomato and highly conserved motifs, which are typical for a member of haloacid dehalogenase and DDDD superfamilies of enzymes catalyzing a diverse number of hydrolytic and phosphotransferase reactions. The functional analysis after expression of RcPS1 in E.coli showed significant acid phosphatase activity. The high transcript level of RcPS1 in endosperms, cotyledons and roots at the first few days of germination suggested that this acid phosphatase gene might be expressed during mobilization of storage products. RcPT1 and RcPS1 mRNA are detectable in the seedlings grown under Pi starvation and Pi sufficient conditions, indicating that both genes were expressed independently from exogenous Pi supply during germination. Moreover, RcPT1 and RcPS1 were expressed in leaves, stems and roots of plants grown under Pi starvation; furthermore, in situ hybridization studies localized RcPT1 and RcPS1 mRNA in the epidermis and the stele of roots of Pi-starved plants, suggesting that these genes also play a role in response to Pi starvation. Thus, it is concluded that there are different signals regulating RcPT1 and RcPS1 expression in response to Pi starvation and during germination.
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Sekundäre Bergregenwälder in Südecuador:Der Einfluss der Art der Störung auf das Spektrum der Pflanzenarten und die Waldstruktur, eine vegetationskundliche Analyse
(2007)
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Juan Alfredo Martínez Jerves
- In der Reserva Biológica San Francisco, in der extrem humiden Ostkordillere Südecuadors wurden 7 Sekundärwäldchen mit einer Grundfläche zwischen 1450 und 2000 m² ausgewählt, alle in ca. 2000 m Höhe gelegen, die nach Luftbildern und Aussagen der Bevölkerung zwischen 10 und (50 +x) Jahre alt sind und aus unterschiedlichen (Zer)Störungen des ursprünglichen Bergregenwalds hervorgingen. Das jüngste dieser Wäldchen (Plot D5, ca. 10 Jahre alt) steht auf Murengelände, resultiert also – als einziges – aus einer „natürlichen“ Störung, während die anderen 6 auf anthropogene Störungen, wie Waldbrand (die Plots F1 und F2, ca. 15 Jahre Regenerationszeit) und Abholzung (die Plots C1 bis C4, zwischen 30 und 50 +x Jahre alt) zurückgehen. Zur Erstellung von „Releves“ wurden die Wäldchen mit abgespannten Seilen in 5 x 5m Parzellen unterteilt (zwischen 60 und 91 Parzellen pro Wäldchen), deren Gefäßpflanzen-Vegetation dann nach Braun-Blanquet und Müller-Dombois quantitativ erhoben wurde. Die Arten wurden 4 verschiedenen pflanzlichen Lebensformen zugeschrieben, die im Idealfall Strata repräsentieren können: Bäume, Sträucher, krautige Pflanzen und Lianen. Insgesamt wurden 457 Parzellen analysiert. In den 7 Wäldchen wurden insgesamt 779 Gefäßpflanzenarten registriert, von denen allerdings nur ein Fünftel sicher bis zur Art identifiziert werden konnte. 50% konnten sicher bis zur Gattung, und 92% bis zur Familie bestimmt werden. Acht Prozent blieben unbestimmbar; vermutlich sind noch unbeschriebene Arten darunter. Nach der Lebensform weisen die Bäume mit einem Anteil von 30% die größte Diversität der Arten auf. Danach folgen die krautigen Pflanzen (28%), Sträucher (26%) und Lianen (14%). Die artenreichsten Familien der untersuchten Sekundärwäldchen sind die Asteraceen, Melastomataceen, Piperaceen, Araceen und Lauraceen. Die artenreichsten Gattungen sind Anthurium (Araceae), Mikania (Asteraceae), Piper und Peperomia (Piperaceae), und Miconia (Melastomataceae). Eine besondere Bedeutung für die Indikation der Sekundärwälder haben der Bambus (Chusquea spec.1), der Adlerfarn (Pteridium arachnoideum) und die Sträucher Baccharis latifolia und Ageratina dendroides (Asteraceae) als Brandzeiger, sowie unter den Bäumen die Pioniere Viburnum obtectum (Caprifoliaceae), Piptocoma discolor (Asteraceae), Myrica pubescens (Myricaceae) und Tapirira guianensis (Anacardiaceae). Die Vegetation der Plots wird zahlenmäßig bestimmt von Arten mit einem geringen Deckungsgrad und einer geringen Häufigkeit. Entsprechend ist die Zahl der häufigen und dominanten Arten klein. Der Fortschritt der Sukzession lässt sich deshalb auch nicht an bestimmten Arten festmachen. Eher möglich ist dies im Hinblick auf den ursprünglichen Störungsfaktor, wo sich Feuer, mechanische Rodung und Bergrutsche an Indikatorarten erkennen lassen. Die größte Herausforderung bei der Auswertung der Daten stellte die Heterogenität der Vegetation (niedrige Sœrensen-Index) in den einzelnen Wäldchen („Plots“) im Zusammenhang mit der hohen a-Diversität der Gefäßpflanzen dar. Dazu wurden in dieser Arbeit die Jaccard Indices der Parzellen mit der nicht linearen „Isometric Feature Mapping“-Methode (ISOMAP) bearbeitet, mit deren Hilfe man ökologische Erkenntnisse aus der a- und der ß-Diversität der Parzellen und der gesamten Plots ableiten kann. Dabei ergaben sich 2 hauptsächliche Ordinationslinien: Die Regenerationszeit der Wäldchen und die Nährstoffverfügbarkeit des Bodens: Niedriges Nährstoffangebot auf Murenboden, hohes auf Brandflächen. Die Reihung der Wäldchen entlang der Ordinationsachse der Regenerationszeit deckt sich mit dem Ergebnis der Luftbildauswertung. Allerdings wurde kein Zusammenhang zwischen der Artenzahl der Wäldchen und ihrem Regenerationsalter festgestellt. Für die Ähnlichkeitsanalyse auf Parzellen- und Plotebene wurde der Sœrensen-Index verwendet. Dabei wurde zum einen die Ähnlichkeit der Artenzusammensetzung („ß-Diversität“) aller Parzellen eines Plots mit einer ausgewählten Referenzparzelle bestimmt, zum anderen die „ß-Diversität“ der Nachbarparzellen berechnet. Diese Art der Datenanalyse zeigte die große Heterogenität der Sekundärwaldvegetation, wie sie sich bereits in den Arten-Areal-Kurven andeutete, wo innerhalb der Grenzen dieser Wäldchen keine Sättigungswerte („Minimum-Areale“) erkennbar sind. Der jüngste Plot in der unechten Zeitreihe der mechanisch gerodeten Flächen hat mit einem Median von 0,4 noch die größte Ähnlichkeit der Einzelparzellen. Allerdings war dies auch der Plot mit einer negativen Korrelation zwischen der Artenzahl („a-Diversität“) der Parzellen und dem Sœrensen-Index, während sonst dieser Ähnlichkeits-Index mit der Artenzahl der Parzellen erwartungsgemäß zunahm. Weiterhin wurde geprüft, ob es eine (negative) Ähnlichkeits-Korrelation der „ß-Diversität“ der Parzellen mit zunehmender Entfernung der Parzellen gibt. Abnehmende Ähnlichkeit mit zunehmender Entfernung wurde aber nur in 2 Plots registriert.
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Construction and analysis of novel controllable expression vectors for Bacillus subtilis
(2007)
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Thi Phuong Trang Phan
- Summary The gram-positive bacterium Bacillus subtilis is well-known for its contributions to agricultural, medical, and food biotechnology and for the production of recombinant proteins. At present, about 60% of the commercially available technical enzymes are produced by Bacillus species. Furthermore, a large body of information concerning transcription, translation, protein folding and secretion mechanisms, genetic manipulation, and large-scale fermentation has been acquired. But so far, efficient and inexpensive expression vectors for B. subtilis are still missing. To fill this gap, a glycine-inducible expression system and a lysine-autoinducible one were explored and IPTG-inducible expression plasmids that allow overexpression and purification of proteins were constructed and analyzed. Furthermore, a technique with a useful promoter-probe plasmid to analyze strong promoters in B. subtilis was established, which allowed to study promoter and mRNA stabilizing elements to enhance the transcript level and mRNA stability leading to higher production of recombinant protein. During the development of the glycine-inducible and lysine-autoinducible expression plasmids, the presence of a small transcript termed riboswitch corresponding to the 5´ UTR in the absence of L-glycine or presence of L-lysine and its conversion into the full-length transcript after addition of the L-glycine or removal of L-lysine was confirmed by Northern blot. Next, the promoter and downstream riboswitch was fused to the lacZ reporter gene to measure glycine or lysine-dependent induction. The production potential for the glycine system was analyzed in detail, and the promoter strength improved by using HtpG, Pbp4 and alpha-amylase as model proteins. In summary, the glycine riboswitch can be used successfully for regulatable production of both intra- and extracellular proteins, and the lysine riboswitch can be applied as an auto-inducible expression system allowing production of recombinant proteins when the L-lysine concentration within the growth medium falls below a threshold value. Six commercially available novel plasmid-based IPTG-inducible expression plasmids for B. subtilis were constructed, too. While the first vector allows intracellular production of recombinant proteins (pHT01), the second provides a strong secretion signal (pHT43). The third vector allows addition of the c-Myc epitope tag (pHT10), and the remaining three vectors provide the purification tags His (pHT08) and Strep (pHT09 and pHT24). The versatility of all six vectors was verified by insertion of appropriate reporter genes and by demonstrating high level production of their proteins. A total of 85 different synthetic and groE-modified sigmaA-dependent promoters were introduced into pHT06 and analyzed. Sequences around the transcriptional start site, the -10 region, the -15 region, the -35 region and the upstream region turned out to influence the promoter strength. BgaB activities and Northern blot analyses were used to measure the activity of the different promoters. The measurements of some new combinations of core promoters and UP elements on gene expression revealed that the beta-galactosidase activity expression levels could be increased up to 13-fold and the mRNA levels up to 43-fold as compared to the strong Pgrac promoter. If both elements were combined, an activity roughly 690 times higher than that obtained with the Pspac promoter were obtained, and synthesis of BgaB, under control of these promoters, could reach up to 30% of the total cellular protein. The mRNA stabilizing elements were also analyzed by using a similar experimental approach. First, seven-teen different 3´-mRNA terminal stem-loops have been investigated, which did not significantly influence neither the amount of protein produced nor the mRNA stability. Second, the 5´-mRNA stabilizing elements including a strong RBS, the lacO Controllable Stabilizing Element (CoSE) and the spacer between the RBS and CoSE were examined. The results demonstrated that CoSE together with an appropriate spacer and a strong RBS could increase gene expression 9-fold as compared to the Pgrac promoter, reaching up to 26% of total cellular protein and a half-life of the mRNA of more than 60 min. A combination of strong promoters and stabilizing elements showed that recombinant protein synthesis levels of up to 42% of the total cellular protein could be obtained.
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Evolutionary and proximate constraints on egg size in butterflies
(2007)
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Stephanie Sandra Bauerfeind
- Arthropod egg and thus progeny size is an evolutionary and ecologically significant trait, showing tremendous variation within and across species. The high variation found is caused by a complex set of interacting proximate and evolutionary factors, but despite increasing effort this network is still only partially resolved. Using butterflies as model organisms, this study focuses on two main factors that are assumed to strongly shape variation in offspring size and number: maternal size and maternal nutrition. Both are assumed to affect reproductive traits and thereby maternal and offspring fitness. Phenotypic correlations between maternal size and egg size within various butterfly species as well as a two-trait selection experiment on simultaneous changes in both traits in the butterfly Bicyclus anynana clearly demonstrated that the importance of maternal size in shaping variation in egg size is limited, both in sense of a morphological as well as an evolutionary constraint. These results strongly contrast to the general assumption of a positive scaling relationship between both traits. This is one of the few studies addressing the issue of evolutionary constraints directly, employing artificial two-trait selection which has been proven to be a powerful tool to unravel genetic variances and covariances that underlie the evolution of traits. While the importance of maternal size in shaping variation in egg size is limited, proximate factors including larval and adult crowding as well as the quantity and quality of available food during the larval and adult stage affect variation in reproductive traits to a high degree. In the butterfly B. anynana, larval and adult densities had surprisingly little effects on female reproduction, whereas dietary limitations yielded strong responses in female reproductive output. Larval food stress reduced fecundity and reproductive investment (mediated through a reduction in body size), but effects on egg size were overall marginal. Additional negative effects of adult food stress on fecundity were largely confined to females being fed as larvae ad libitum, while those being previously starved showed reduced performance regardless of adult income. When abundantly fed during the larval stage, a limitation of adult resources reduced reproductive output, proving the need for adult feeding in B. anynana for egg production. Thus, restricted food access in different developmental stages of B. anynana sets different limits to reproduction, either posed by shortage of larval-derived storage reserves (i.e. nitrogenous compounds) or adult income (i.e. carbohydrates). Consequently, restrictions in both, larval- and adult-derived resources, limit reproduction in B. anynana. Further, this study deals with questions regarding effects of different adult dietary compounds for a fruit-feeding butterfly being novel in its reductionist approach and in the breadth of different nutrient classes considered. This study demonstrates that B. anynana relies to a large extent on adult feeding in order to realise full reproductive output. Female B. anynana require adult-derived carbohydrates for egg production and exhibit a tremendous gain in reproductive output when fed on fruit as compared to sucrose solutions. Contrary to initial expectations, I could not pinpoint a single pivotal substance (in addition to sucrose) that was able to elicit a comparably high reproductive performance as banana, although I tested the micronutrients being most abundantly available in banana (minerals: potassium and magnesium chloride; a mixture of vitamins and a combination of both) and all major substances known to be involved in insect egg production (amino acids, cholesterol, polyunsaturated fatty acids). Further, it is also excluded that the growth of microorganisms and fungi (associated with the production of fermentative products like organic acids and alcohols, thereby providing access to additional resources) explains the found results. In conclusion, reproduction does not only depend on a small number of adult-derived nutrients, but on a larger number having relatively small effects each. Thus, resource congruence (the use of nutrient types in a specified ratio) rather than any specific component may be the key to answer the question.
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Methyljasmonat induzierte Seneszenz in Chloroplasten aus Primärblättern der Gerste (Hordeum vulgare L.): Analyse der Ultrastruktur und des Proteinimports
(2007)
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Armin Springer
- Die Seneszenz eines Blattes umfasst dessen abschließende Phase im pflanzlichen Entwicklungsprozess und stellt somit eine der wichtigsten Schlüsselpositionen im Lebens- und Entwicklungszyklus des Individuums dar. Es sind damit dramatische Veränderungen auf molekularem, biochemischem und strukturellem Niveau untrennbar mit der Seneszenz verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten seneszenzbedingte Veränderungen an Plastiden untersucht werden, wobei der Frage, ob die Plastidenhüllmembran bis in relativ späte Phasen der Seneszenz unverändert bleibt, speziell Rechnung getragen werden. Dazu wurde zunächst ein experimentelles System etabliert, bei dem es möglich war, Seneszenz in Primärblättern der Gerste gezielt zu induzieren und deren Ablauf, im Vergleich zur natürlichen Seneszenz, zu beschleunigen. Von vier getesteten seneszenz-auslösenden Faktoren, zeigte einzig die Behandlung mit Methyljasmonat beide der erwarteten seneszenz-spezifischen Veränderungen (Chlorophyllverlust und Bildung von Gerontoplasten). Das experimentelle System „Methyljasmonat-induzierte Seneszenz“ zeigte in Bezug auf die seneszens-spezifischen Marker (Chlorophyllabbau, strukturelle Veränderungen) eine hohe Übereinstimmung mit der natürlichen Seneszenz. Seneszenzspezifische Veränderungen der Plastidenhülle sollten sich v. a. auch auf den Import von kernkodierten, chloroplastidären Proteinen auswirken und somit am veränderten Gehalt dieser Proteine im Plastiden messbar sein. So war eine Methyljasmonatinkubation abgeschnittener Gerstenprimärblätter in der Lage, innerhalb von nur 24 Stunden eine quantitativ messbare Abnahme der Menge zweier wichtiger Proteine (Rubisco und LHC II) des Plastiden zu bewirken. Für diese beobachtete Abnahme könnten aber sowohl verminderte Synthese-, als auch erhöhte Abbauraten der betroffenen Proteine verantwortlich sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionsmuster von chloroplastidären Proteinen, insbesondere des Proteinimports, analysiert. Die Analyse der Genexpressionsmuster der chloroplastidären Proteine Rbcs und LHC II ergaben nun, dass unter Methyljasmonateinfluss die jeweiligen korrespondierenden mRNA-Mengen dieser Proteine abnahmen. Es handelte sich aber nicht um einen generellen RNA-Abbau, da die rRNA Mengen gleich blieben. Die Abnahme der Konzentration dieser plastidären Proteine war zumindest zum Teil durch eine Abnahme ihrer Synthese bedingt. Bei einem an Chlorophyllabbau beteiligten Protein, LLS1, wurde demgegenüber bei Methyljasmonatinkubation ein Ansteigen der Proteinmenge im Chloroplasten beobachtet, was zu der Annahme führt, dass es auch während der Methyljasmonat-induzierten Seneszenz einen funktionierenden Proteinimportapparat geben sollte. Zum Vergleich von Proteinimportkapazitäten von Chloroplasten unterschiedlicher Entwicklungsstufen wurden die Isoenzyme der NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase verwendet, wobei gezeigt werden konnte, dass der Import von pPORB durch den Standardproteinimportapparat (TIC-TOC Maschinerie) und der Import von pPORA entwicklungsabhängig - über einen pPORA-spezifischen Importapparat (PTC) in Abhängigkeit vom Substrat Protochlorophyllid (Pchlid) - erfolgte. Untersuchungen des Importverhaltens von pPORB in Chloroplasten ergab, dass sowohl in Plastiden aus frischen Blättern als auch nach Flotation auf Wasser, ein Import erfolgte. pPORA wurde nur in Pchlid-haltige, nicht jedoch Pchlid-freie Chloroplasten der Frischkontrolle importiert (außer bei Flotation auf Wasser). Eine Behandlung von Blättern mit Methyljasmonat wirkte sich immer hemmend auf den Import beider Präkursoren aus. Mit den angeschlossenen Crosslinking-Experimente zeigten sich weder Proteine der TIC-TOC-Maschinerie noch des PTC-Komplexes. Es kann also davon ausgegangen werden, dass es jedenfalls zu Veränderungen des ganzen oder zu Teilen des Standardproteinimportapparates kommen muss. Diese Veränderungen des Standardproteinimportapparates in der äußeren Plastidenhülle wurden mit Hilfe von speziellen elektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf dem integralen Teil des Standardproteinimportapparates, der den zentralen Kanal durch die äußere Hüllmembran bildet (TOC 75) und den eigentlichen Durchtritt kerncodierter Proteine in den Plastiden vermittelt. Eine Kombination der konventionellen Gefrierbruchtechnik mit der SDS-FRL, gelang es, seneszenzbedingte Veränderungen der Hüllmembran zu detektieren. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Dichte des TOC 75 Proteins, in der äußeren Plastidenhülle unter Methyljasmonateinfluss innerhalb von 24 Stunden dramatisch abnimmt (Verlust der TOC 75 Immunsignaldichte gegenüber dem Ausgangswert um mehr als 85 %). Dieser deutliche Verlust von TOC 75 in der Plastidenhülle nach Methyljasmonatbehandlung deutet darauf hin, dass eine spezifische Regulation des Imports photosynthetisch wichtiger Proteine während der künstlich induzierten Seneszenz auftritt.
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New delimitations and phylogenetic relationships of Sabiceeae (Ixoroideae, Rubiaceae) and revision of the Neotropical species of Sabicea Aubl.
(2007)
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Saleh Ahamad Khan
- The pantropical tribe Sabiceeae (Ixoroideae s.l., Rubiaceae) has been variously circumscribed previously with strong conflicts. The monophyly of Sabiceeae including its all established genera or the monophyly of any non-monotypic genus traditionally included in this tribe has never been examined using molecular data sets. Sabicea, the type and most species rich genus of the tribe has not been revised to any extent after its first monographic treatment (Wernham, 1914), mostly based on typological concept. The present study reveals for the first time that neither the tribe Virectarieae, currently established as the associated tribe of Sabiceeae, nor the subtribe Virectariinae is monophyletic; rather, the tribe Sabiceeae including the genera of Virectarieae or Virectariinae is strongly resolved as a monophyletic group in trnT-F and combined ITS-trnT-F trees. This study suggests the broad circumscription of the tribe Sabiceeae (Sabiceeae s.l.) consisting of eight genera: Ecpoma, Hekistocarpa, Pseudosabicea, Sabicea, Schizostigma, Stipularia, Tamridaea, and Virectaria. Additionally, this study suggests the placement of both Pentaloncha and Temnopteryx, in subfamily Rubioideae. The monophyly of the newly delimited Sabiceeae s.l. is entirely based on molecular data. This study reveals that the genera Ecpoma, Pseudosabicea, Sabicea, Schizostigma, and Stipularia, traditionally associated with the tribe Sabiceeae, together form a monophyletic group and their morphological distinctions are not clear-cut. Therefore, all of these genera are merged under Sabicea s.l., and finally the tribe Sabiceeae s.l. is recognized with four genera: Hekistocarpa, Sabicea s.l., Tamridaea, and Virectaria. The resolved clades of combined ITS-trnT-F tree (Chapter 6.1, Fig. 3) indicate that the São Tomean, Malagasy, and all Neotropical Sabicea presumably originated from African ancestors. They reached São Tomé & Principe, Madagascar, and the Neotropics independently via four dispersal events. This study also indicates that most probably the major diversification of Sabicea s.l. started in mainland Africa and the second major radiation occurred in the Neotropics. The presence of only one species– Sabicea ceylanica in Sri Lanka indicates the unsuccessful diversification of the genus in Asia. The results of combined ITS-rpoC1-trnT-F analysis (Chapter 6.2, Fig. 1) suggest that the monotypic genus Hekistocarpa is closely related with the genus Virectaria, the monotypic Tamridaea and the Pantropical Sabicea s.l. The clade of all Virectaria accessions strongly resolved in the ITS-rpoC1-trnT-F tree supports the monophyly of the genus Virectaria. The combined ETS-ITS-rpoC-trnT-F tree (Chapter 6.2, Fig. 2) exhibits the close relationships within the genus under two highly resolved groups, and the monophyly of the six sampled species of Virectaria in correspondence to their morphological characters. The resolved clades of the combined ITS-rpoC1-trnT-F tree suggest the tropical African, possibly Guineo-Congolian, origin for the whole Sabiceeae as Hekistocarpa, constantly resolved as sister to the clade of Tamridaea, Virectaria and Sabicea s.l., is Lower-Guinean. The high number of both molecular and morphological autapomorphies of Tamridaea testifies its long isolated evolution. The resolved clades of Virectaria (Chapter 6.2, Fig. 2) indicate the floral exchange between Lower- and Upper-Guinean, Guineo-Congolian and Zambezian regions. The ETS-ITS-rpoC-trnT-F tree indicates the presence of at least three (V. herbacoursi and V. multiflora, V. angustifolia, and V. procumbens, V. major and V. belingana) vicariant couples within the Guineo-Congolian and Zambezian regional center of endemism. The taxonomic revision of Neotropical Sabicea, based on a large bulk of specimens, recognizes 37 species from the previously described 54 species and merges the remaining 17 with other well-defined species of the genus, as no reason was found for their recognition. Additionally six new species (S. boyacana, S. chiapensis, S. cochabambensis, S. liedeae, S. noelii, and S. tayloriae) are reported. Finally, this revisionary study provides a comprehensive taxonomic treatment of 43 species, 37 from South America and five from Mesoamerica, with distribution maps and 30 illustrations. All descriptions are originally generated from DELTA (Dallwitz & al., 1999) using 620 vegetative and reproductive characters. A detailed indented key to all of 43 species is provided. Lectotypes are designated for six species. This study reveals that the highest degree of endemism of the genus in the Neotropics occurs in Brazil, Bolivia, Venezuela, and Colombia with four species each. Mexico harbors three endemic species, Peru two and Jamaica and Surinam one each. Lastly, this study is an excellent base for the completion of the reclassification within the tribe Sabiceeae, especially within the genera Virectaria and Sabicea s.l. in Africa.
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Silene otites (Caryophyllaceae): Attraction of nectar-seeking mosquitoes to inflorescence odours, and temporal variation of flower scent and flower visitors
(2007)
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Umma Salma Jhumur
- In this investigation the role of flower odours in attracting mosquitoes to Silene otites were evaluated. Although mosquitoes are known to visit diverse flowers for nectaring, S. otites is one of only two plant species world-wide in which mosquitoes have been described as pollinators. In several investigations flower odours were described as effective attractants for mosquitoes, however, in none of the studies the compounds responsible for attraction were identified. Therefore, in the present study the aim was to investigate the chemical components in Silene otites that play a role in the attraction of mosquitoes. The information obtained can be useful in developing odour-baited traps for monitoring and controlling mosquito populations. Inflorescence odour composition of 63 Silene otites samples of nine populations was determined. There was variability in scent composition among populations and between sexes (Chapter 1). Most populations and samples were dominated by phenyl acetaldehyde, but in some samples high relative amounts of lilac aldehyde or (Z)-3-hexen-1-ol and (Z)-3-hexenyl acetate were present. Populations geographically close to each other were not more similar in their scent than distant populations. Nevertheless, in wind tunnel bioassay experiments with inflorescence odours of S. otites of six populations and Culex pipiens molestus, no differences in attractivity of different populations were observed. Therefore, different scent spectra seem to have the same attractiveness for mosquitoes. In electroantennographic studies with the 13 most common and abundant odour compounds of S. otites, Culex pipiens molestus males and females responded similarly to dilution series but the strength of the responses differed among compounds. Linalool oxide (furanoid) and linalool evoked the strongest responses in male and female mosquitoes, and (Z)-3-hexenyl acetate was strongly active in females. Further, the differences in antennal responses between night- and crepuscular-active Culex pipiens molestus and day-active Aedes aegypti to headspace flower odour samples of S. otites were investigated using coupled gas chromatographic–electroantennographic detection (GC-EAD). No striking differences in antennal responses to the odour compounds have been found between the two mosquito species (Chapter 2). To identify the compounds responsible for attraction of mosquitoes to S. otites, wind tunnel bioassays with antennal sensitive compounds and C. p. molestus were conducted. Mosquitoes responded to 14 compounds in different magnitudes (65-20%) and acetophenone, linalool oxide (pyranoid), phenyl acetaldehyde and phenylethyl alcohol were found as more attractive in comparison to the least attractive compound, hexanol (Chapter 2). Further, in two-stimulus choice tests, mosquitoes were significantly more attracted to the mixture of the four most attractive compounds (all typical flower scent compounds) than the mixture of all 14 compounds (including flower and vegetative scents of S. otites). Therefore, it seems that mosquitoes prefer flower scent over a combination of flower and vegetative scents when searching for flowers. Wind tunnel bioassays were not only conducted with naïve mosquitoes but also with conditioned mosquitoes to test the hypothesis that mosquitoes can learn flower scent compounds (Chapter 3). Learning may help the mosquitoes to find the most suitable host-plant that they visit more frequently thereafter. Though Silene otites is described as night-pollinated, preliminary observations revealed that this plant species is also visited by several insects during day-time. Therefore, the temporal variations of flower scent and flower visitors were investigated in more detail (Chapter 4). Although S. otites emits highest amounts of floral volatiles at night, just after sunset, it also emits a smaller amount of volatiles during day-time. Interestingly, the temporal variations differed among scent compounds where five different emission patterns of compounds could be categorized. During day and night, a total of 60 flower-visiting insect species were recorded. During day beetles, brachyceran flies and hymenopteran species were found, whereas, at night the nocturnal Lepidoptera, nematoceran flies, and neuropteran individuals were found to visit the flowers. Insect species visiting the flowers during daytime may be attracted by the scent compounds emitted during day, while nocturnal insects may be attracted by compounds emitted during night. These differences in scent in the course of the day might be the results of pollinator mediated selection, and the ‘fine tuned’ odour emission of this plant seems to be an adaptation to the olfactory abilities and preferences of the day- and night-active pollinators, respectively.
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Fischökologische Funktionalität von Fließgewässerrenaturierungen im oberfränkischen Mainsystem
(2007)
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Thomas Speierl
- 1. Im oberen Mainsystem, an Main und Rodach (Oberfranken) wurden seit 1992 ausgedehnte Fließgewässerrenaturierungen durchgeführt (Wasserwirtschaftsamt Bamberg). Aktuell umfassen die Maßnahmen 25 Flussbereiche mit mehr als 15 km Länge. Die Maßnahmen verbesserten die natürliche Flussdynamik und Habitatvielfalt (Flussaufweitungen, neue Seitenarme, Anbindung der Aue und lateraler Gewässer). 2. Die Untersuchung (1999, 2002-2004) erfasste die fischökologische Funktionalität unterschiedlicher Renaturierungsmaßnahmen. Die Zusammensetzung und zeitliche Veränderung von Fischgemeinschaften wurde zwischen drei regulierten und renaturierten Flussbereichen verglichen (Monitoring-Bereiche). Der Einfluss morphologischer und hydrologischer Faktoren erfasst (Breiten- und Tiefenvarianz, Abfluss). Verhaltensökologische Mechanismen wurden analysiert (Migrationsverhalten, Drift). Für die Leitart Barbe (Barbus barbus) wurden Bestandsdynamik und Populationsaufbau ermittelt. Aktive Fangmethoden waren die Elektrofischerei und das Zugnetz, passive Methoden Forney- und Lichtfallen, Drift- und Trappnetze. 3. Insgesamt wurden 32 Fischarten erfasst, 70% der Fischarten Oberfrankens. 15 Arten waren in der RL Deutschlands geführt, von denen wiederum 13 Arten in der RL Bayerns vorkamen. Aus naturschutzfachlicher Sicht war der Nachweis von 8 kieslaichenden und bundesweit gefährdeten Fischarten hoch zu bewerten (Äsche, Thymallus thymallus; Bachforelle, Salmo trutta; Barbe, Barbus barbus; Hasel, Leuciscus leuciscus; Lachs, Salmo salar; Nase, Chondrostoma nasus; Nerfling, Leuciscus idus und Rapfen, Aspius aspius). 4. Es gab keine einheitlichen, charakteristischen Fischgemeinschaften der regulierten und renaturierten Flussstrecken. Die renaturierten Flussbereiche waren insgesamt produktivere Fischbezirke. 5. In den regulierten und renaturierten Flussbereichen aller Monitoring-Bereiche dominierten die euryöken Cyprinidenarten Aitel (Leuciscus leuciscus), Laube (Alburnus alburnus) und Rotauge (Rutilus rutilus) die adulte und juvenile Fischgemeinschaft. In den renaturierten Flussbereichen bildeten sich mit den Jahren spezialisiertere Fischgemeinschaften aus, während die regulierten Bereiche zunehmend von euryöken Arten bestimmt wurden. In den regulierten Flussbereichen waren die Jungfischbestände gering. 6. Die renaturierten Seitengewässer waren wichtige Winterstandorte für die adulten und juvenilen Fischbestände. Die Variabilität der Gewässertiefe war das wichtigste Strukturmerkmal für die Qualität der Winterhabitate. Im Winter stiegen die Artenvielfalt, Diversität, Evenness und das durchschnittliche Körpergewicht der Jungfische bei zunehmender Tiefenvarianz signifikant an. 7. Die renaturierten Flussbereiche waren für die Driftstadien der larvalen und juvenilen Fische Refugien mit günstigen Wachstumsbedingungen. Sie waren wichtige Ausgangspunkte für deren Verbreitung im Flusssystem. Die Drift zeigte ein saisonales und tageszeitliches Muster. Das Driftaufkommen nahm mit steigenden Wassertemperaturen zu. Hydrologische Parameter bestimmten die Driftintensität. 8. Eine neu gestaltete Altwasser-Kiesseeanbindung zum Main war ein wichtiges Laichgebiet und Jungfischhabitat. Sie wurde von den juvenilen und adulten Fischen als Nahrungshabitat und Wintereinstand genutzt. Es kam zu umfangreichen saisonalen und tagesrhythmischen Wanderbewegungen zwischen Fluss und Seitengewässer. Für die phythophilen Arten Hecht (Esox lucius), Schleie (Tinca tinca) und Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) waren die Laichbedingungen im Seitengewässer günstig. Die Anbindung war ein hochwertiges Jungfischhabitat. Das reiche Zooplanktonangebot in der Anbindung führte zu tageszeitabhängigen „feeding migrations“ juveniler und adulter Fische. Im Oktober begannen die juvenilen und adulten Fische ihre Wintermigration in das Seitengewässer. 9. Die Renaturierungsmaßnahmen verbesserten für die Leitart Barbe das Angebot, die Größe und die Verknüpfung lebenswichtiger Habitattypen. In 5 Jahren (1999-2004) stieg der Anteil der Barbe am gesamten Fischbestand um 25%. Die Erträge erreichten natürliche Bestandswerte. 10. Die Untersuchung an Flutmulden zeigte, dass neu geschaffene Auengewässer eine wichtige Funktion als Refugien und Jungfischhabitate haben und folglich den natürlichen Fischbestand stabilisieren. 11. Die Abflussdynamik beeinflusste die Fischgemeinschaften. Während Hochwasserwellen konzentrierten sich die Fischbestände kurzfristig entlang der Ufer, in den Seitengewässern und den Überflutungszonen der Aue. Das bessere Angebot an Refugien in renaturierten Flussbereichen erleichterte den Fischen ein schnelles Ausweichen. 12. Die aktuell ausgeführten Renaturierungsmaßnahmen konzentrieren sich vorrangig auf den Hauptstrom. Von ihnen profitieren v.a. die strömungsliebenden (rheophilen) Fischarten. In Zukunft muss die laterale Gewässerverknüpfung verbessert werden, um die Situation der phythophilen Fischarten zu stärken und das Angebot an Refugialräumen zu erhöhen.
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Lokalisierung und molekulare Charakterisierung eines Pederin produzierenden Endosymbionten der Gattung Pseudomonas aus dem Kurzflügler Paederus riparius(Coleoptera: Staphylinidae)
(2007)
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Kador Matthias
- Weibliche Kurzflügelkäfer der Gattung Paederus beherbergen einen mit Pseudomonas aeruginosa sehr nahe verwandten Endosymbionten, der für die Synthese des stark cytotoxischen Naturstoffs Pederin verantwortlich ist. Die ökologische Bedeutung dieses Giftstoffs für die Käfer liegt dabei offenbar in einer Abwehrfunktion gegenüber potentiellen Prädatoren, wie z. B. Wolfsspinnen, begründet. Aufgrund einer sehr hohen tumorhemmenden und antiviralen Wirksamkeit ist Pederin in erster Linie für die medizinische Forschung interessant. Ziel dieser Arbeit war es, den Endosymbionten von Paederus riparius mit verschiedenen mikrobiologischen und molekularen Methoden in den Käfern bzw. auf deren Eiern exakt zu lokalisieren, um somit die Organisation dieser Bakterien im Wirtsinneren näher zu beleuchten und deren Übertragungsweg auf die Nachkommenschaft aufklären zu können. Durch eine gezielte Isolierung des Pederin-Symbionten sollte dieser schließlich auf exakt abgestimmten, Agar basierten Kulturmedien angezüchtet werden, um letztlich eine Produktion dieses komplizierten Polyketids außerhalb der Käfer in ökologisch nachhaltiger Weise gewährleisten zu können. 1. Mit Hilfe von Pederin-Gen-spezifischen Primern konnte der Endosymbiont in den Abdominalspitzen der Käfer detektiert werden. Eine sich anschließende molekulare Untersuchung verschiedener abdominaler Organe zeigte, dass das Vorhandensein des symbiontischen Bakteriums ausschließlich auf die am weiblichen Geschlechtsapparat paarig angelegten Anhangsdrüsen und den Ausführgang begrenzt ist. Über eine in situ-Färbung dieser Drüsen mit dem Nucleinsäurefarbstoff DAPI konnte daraufhin zum ersten Mal das Vorhandensein einer morphologisch einheitlichen, stark an Pseudomonas erinnernden Kolonie gezeigt werden. 2. Der Einsatz einer fluoreszenzmarkierten Gensonde ermöglichte es, das endosymbiontische Bakterium in Serien-Dünnschnitten von Abdomina und Eiern gezielt sichtbar zu machen. Dabei zeigte sich im Falle der Abdominalschnitte, dass der Pederin-Produzent in einer enorm hohen Dichte als Reinkultur in den Anhangsdrüsen und in etwas geringerer Menge in bestimmten Bereichen des Ausführgangs lokalisiert ist, in den die beiden Symbionten-Drüsen münden. Im Falle der Ei-Dünnschnitte konnte der Endosymbiont auf einer die Eischale umgebenden warzenartigen Schicht detektiert werden, auf die das Bakterium in einer biofilmartigen, festen Matrix aufgebracht ist. Die Verteilung der Symbionten-Zellen erstreckte sich dabei stets über die gesamte Ei-Oberfläche. Ein möglicher Weg der Übertragung vom Weibchen auf die Eier wäre die aktive oder passive Abgabe einer definierten Menge Bakterienmaterial über einen Schleusenmechanismus, der die Anhangsdrüsen gegenüber dem Inneren des Ausführgangs während der Ei-Passage öffnen und verschließen kann. 3. Mit einer speziellen Sektionstechnik gelang es, den Endosymbionten von seinem Insekten-Wirt zu isolieren. Die lichtmikroskopische Untersuchung der Bakterienlösung zeigte dabei das Vorhandensein einer Pseudomonas aeruginosa sehr ähnlichen, offenbar kontaminationsfreien Zellkolonie. Den endgültigen Beweis, dass es sich dabei um eine Reinkultur des Paederus-Endosymbionten handelte, erbrachte jedoch erst die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der mit der spezifischen Gensonde hybridisierten Zellen. 4. Anhand der isolierten Reinkultur des Pederin produzierenden Symbionten konnte über verschiedene Enzymtests gezeigt werden, dass es sich um ein gramnegatives Bakterium mit einem aeroben oder mikroaerophilen Stoffwechsel handelt, das jedoch im Gegensatz zu den Pseudomonaden vollständig unbegeißelt ist. Die dafür benötigten Gene sind offenbar im Zuge der endosymbiontischen Anpassung an den Käfer-Wirt durch zahlreiche Genomreduktionen verloren gegangen. Dies gilt wahrscheinlich ebenso für die Gene, die Pseudomonas aeruginosa die Fähigkeit zur Denitrifikation verleihen. Diese Gene konnten im Rahmen spezifischer PCR-Experimente in den Endosymbionten nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus erbrachte eine vergleichende RFLP-Analyse der endosymbiontischen 16S rDNAs der beiden voneinander kontinental getrennten Paederus-Arten P. riparius und P. sabeus die Erkenntnis, dass eine genetische Aufspaltung des Pederin-Symbionten in eigenständige Arten noch nicht stattgefunden hat. 5. Ein mögliches Wachstum des Endosymbionten konnte mit den Pederin-Gen-spezifischen Primern in einem flüssigen Anreicherungsmedium nachgewiesen werden. Durch eine Beimpfung der verschiedensten universellen und selektiven Nährböden mit Ei- bzw. Käfer-Homogenisat konnte im Laufe der Kultivierungsexperimente eine Vielzahl grampositiver und gramnegativer Bakterien kultiviert werden. Eine gezielte Anzucht des Paederus-Endosymbionten auf diesen Medien konnte jedoch nicht erreicht werden, was nicht zuletzt auch auf einen zu geringen Kenntnisstand über die möglicherweise sehr speziellen Nährstoffanforderungen der Pederin-Produzenten außerhalb ihrer Käfer-Wirte zurückgeführt werden kann.
