5 search hits
-
Aktinabhängige Bewegung und Vererbung von Mitochondrien in Saccharomyces cerevisiae
(2008)
-
Katrin Altmann
- Da Mitochondrien nicht de novo synthetisiert werden können, wird durch die koordinierte Vererbung von Mitochondrien und mitochondrialer DNA (mtDNA) sichergestellt, dass während der Zytokinese alle Zellen im Besitz funktioneller Organellen bleiben. Dabei ist bekannt, dass im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae das Aktinzytoskelett für diese mitochondrialen Transportereignisse verantwortlich ist. Weiterhin wird angenommen, dass über einen beide mitochondriale Membranen durchspannenden Komplex (TMS) die mtDNA während der Zytokinese an den Segregationsapparat im Zytosol gebunden wird. Allerdings sind der Mechanismus und die Komponenten der aktinabhängigen Bewegung genauso wie die Gesamtstruktur des TMS bisher nur wenig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein systematischer Screen nach essentiellen, mitochondrialen Morphologie- und Verteilungskomponenten durchgeführt. 119 Stämme einer Hefe-Bibliothek, in der die Genexpression über einen Fremd-Promotor reguliert wird, zeigten nach Abschalten des Promotors einen veränderten mitochondrialen Phänotyp. Dies ermöglichte die Identifizierung fünf zellulärer Prozesse, die für die mitochondriale Morphogenese von entscheidender Bedeutung sind: Ergosterol-Biosynthese, vesikulärer Transport, mitochondrialer Proteinimport, Ubiquitin/26S Proteasom-abhängiger Proteinabbau und aktinzytoskelettabhängiger Transport. Zwei Mitglieder der letzten Gruppe, das Klasse V Myosin Myo2 und seine leichte Kette Mlc1, wiesen dabei besonders interessante Phänotypen auf. Fluoreszenz- und elektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben eine ringähnliche mitochondriale Morphologie in den mutanten Zellen. Cristaestrukturen fehlten vollständig. Da diese Defekte in Zellen mit einem normal ausgeprägten Aktinzytoskelett beobachtet werden konnten, übt Myo2 wahrscheinlich einen primären Effekt auf die Interaktion zwischen Mitochondrien und den Aktinkabeln aus. Diese Vermutung wurde durch in vitro Aktinbindungs-Assays bestärkt. Dabei zeigten isolierte Mitochondrien aus Stämmen ohne Myo2 und Mlc1 und aus Stämmen mit spezifischen Punktmutationen in den Cargo-Bindungsdomänen von Myo2 eine stark beeinträchtigte Bindungskapazität. Zusätzlich ergab zeitauflösende Fluoreszenzmikroskopie der myo2-Punktmutanten, dass Myo2 auch für die knospengerichtete anterograde Bewegung von Mitochondrien verantwortlich ist. Diese Ergebnisse belegen zum ersten Mal die wichtige und direkte Beteiligung eines Myosins an der mitochondrialen Bewegung und Vererbung in S. cerevisiae. Darüber hinaus wurden Mdm31 und Mdm32, zwei funktionell unabhängige Untereinheiten zweier Komplexe der mitochondrialen Innenmembran (IM), als notwendige Komponenten der koordinierten Vererbung von mtDNA etabliert. In vorliegender Arbeit konnte dabei gezeigt werden, dass die Deletion beider Gene jeweils in dem Verlust der Interaktion zwischen mtDNA und Mmm1, einer Außenmembrankomponente des TMS, resultierte. Dies deutet auf eine Funktion von Mdm31 und Mdm32 als Innenmembrankomponenten des TMS hin.
-
Die mitochondriale Biogenese in Saccharomyces cerevisiae: Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der mitochondrialen Funktion und Morphogenese
(2009)
-
Sandra Merz-Jakob
- Deletionsbibliotheken sind heutzutage ein wertvolles Werkzeug, um Genfunktionen zu entschlüsseln und das Verständnis zellulärer Abläufe zu komplettieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von der ~4800 Deletionsmutanten nicht-essentieller Hefegene umfassenden MATalpha-Deletionsbibliothek large-scale Analysen durchgeführt, um das Verständnis zweier wichtiger Teilbereiche der mitochondrialen Biogenese zu erweitern, nämlich (1) dem Erhalt der Atmungsfähigkeit und (2) der mitochondriale Teilung als zentraler Bestandteil der Morphogenese. Die Biogenese der Atmungskette erfordert die koordinierte Expression des Kerngenoms und des mitochondrialen Genoms, wobei im Zellkern der Großteil der mitochondrialen Proteine kodiert wird und die mitochondriale DNA (mtDNA) nur wenige Gene enthält. Im ersten Teilabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde ein systematischer, genomweiter Screen durchgeführt, um den Satz an kernkodierten Genen zu ermitteln, der für die respiratorische Aktivität sowie den Erhalt und die Expression der mtDNA in Hefe erforderlich ist. Durch vergleichende Gendeletionsanalysen konnte eine unerwartet große phänotypische Plastizität festgestellt werden. Darüber hinaus wurden zehn bisher uncharakterisierte Gene identifiziert, die essentiell für den Erhalt des respiratorischen Wachstums sind (RRG1 bis RRG10). Systematische funktionelle Analysen der 319 respiratorisch inkompetenten Mutanten enthüllten 16 Gene, die essentiell für den Erhalt mitochondrialer DNA sind, 88 Gene, die für die allgemeine mitochondriale Proteintranslation benötigt werden, und zehn Gene, die für die Expression bestimmter mitochondrialer Genprodukte erforderlich sind. In einer Gruppe von 23 Mutanten spielen vermutlich auch extragenomische Faktoren eine Rolle für mitochondriale Funktionen. Darunter waren vier Deletionsstämme mit fehlerhafter Assemblierung der Cytochrom c Oxidase. Diese akkumulieren verstärkt reaktive Sauerstoffspezies (ROS), was zu einer schnelleren Alterung führt. Insgesamt verbessern die gewonnenen Daten das Verständnis der molekularen Prozesse, die zum Erhalt der mtDNA, zur mitochondrialen Proteintranslation und zur Assemblierung der Atmungskette beitragen. Sie deckten mehrere bisher uncharakterisierte Komponenten auf und liefern ein umfassendes Bild der molekularen Prozesse, die für die respiratorische Kompetenz in einer relativ einfachen eukaryotischen Zelle benötigt werden. Die zentrale Bedeutung der Mitochondrien in der Zelle beschränkt sich jedoch nicht nur auf die Atmungsfähigkeit. Mitochondrien sind vielmehr wichtige Bestandteile zahlreicher physiologischer Prozesse, deren Funktionalität maßgeblich von der mitochondrialen Dynamik, insbesondere der Fusion und Teilung, abhängt. Der zweite Teilabschnitt der Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der mitochondrialen Teilung. Mdm33, ein integrales Innenmembranprotein der Hefemitochondrien, ist die bisher einzige bekannte Komponente der Innenmembranteilung. Seine Überexpression bedingt eine mitochondriale Fragmentierung, die mit einem starken Wachstumsdefekt einher geht. Mögliche Wechselwirkungspartner waren nicht bekannt. Deshalb wurde ein genetischer Screen durchgeführt, um direkte oder indirekte Wechselwirkungspartner von Mdm33 zu identifizieren. MDM33 wurde in einer Auswahl von 164 Hefedeletionsmutanten überexprimiert, in denen vor allem mitochondrial lokalisierte Proteine fehlten. Anhand der Kriterien Wachstumsfähigkeit und blockierte mitochondriale Fragmentierung bei Überexpression von MDM33 wurden sieben bisher uncharakterisierte genetische Interaktions-partner identifiziert, die möglicherweise mit Mdm33 funktionell wechselwirken. Dnm1 und Mdv1 sind Komponenten der mitochondrialen Außenmembranteilungsmaschinerie. Die Detektion der Deletionsstämme deltadnm1 und deltamdv1 im Screen als MDM33-überexpressions-tolerant weist auf eine Funktion der Außenmembranteilungsmaschinerie bei der Entstehung des MDM33-Überexpressionsphänotyps hin und zeigt gleichzeitig, dass die Funktion von Mdm33 upstream der Außenmembranteilungsmaschinerie liegt. Dnm1 kann auch in Abwesenheit von Mdm33 auf der mitochondrialen Oberfläche assemblieren. Die Mdm33-abhängige Modulation der Teilungsaktivität erfolgt also nicht durch eine verhinderte Assemblierung, sondern wahrscheinlich durch eine veränderte Aktivierung der Außenmembranteilungsmaschinerie. Diese Ergebnisse liefern weitere Einblicke in den Zusammenhang zwischen der Mdm33-Funktion und der Außenmembranteilungsmaschinerie und untermauern damit die Gültigkeit des bestehenden Mdm33-Wirkmodells, in dem Mdm33 als Voraussetzung für die Außenmembranteilung die Innenmembranteilung/Einschnürung des Mitochondrientubulus vermittelt. Damit wurde ein weiterer Schritt zur Komplettierung des Bilds der mitochondrialen Teilungsmaschinerie getan.
-
Funktionale Charakterisierung neuer Komponenten der mitochondrialen Morphogenese in Saccharomyces cerevisiae
(2010)
-
Miriam Hammermeister
- Die Morphologie und die Dynamik von Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion und Vererbung dieser Organellen. Zum besseren Verständnis der beteiligten Prozesse müssen alle dazugehörigen Komponenten identifiziert und charakterisiert werden. Die Erforschung von zwei Proteinen, Mdm35 und Mdm36, die die mitochondriale Morphologie und Verteilung beeinflussen, und ihre mögliche Eingliederung in den Morphogenesapparat der Mitochondrien war Gegenstand dieser Arbeit. Der erste Teilabschnitt der Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung und Ermittlung der Funktion von Mdm36 in der Gestaltgebung von Mitochondrien. Die Dynamik der Mitochondrien wird maßgeblich von den beiden antagonistischen Prozessen Fusion und Teilung bestimmt. Dnm1, eine Dynamin-verwandte GTPase, stellt die Schlüsselkomponente der mitochondrialen Teilung in Hefe dar, die in Zusammenarbeit mit weiteren Komponenten agiert. Teilungsmutanten besitzen netzartige Mitochondrien, die aufgrund der gestörten Teilung bei fortlaufender Fusion entstehen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Deletionsmutanten von MDM36 stark verzweigte mitochondriale Netzwerke aufweisen, die denen der Teilungsmutanten sehr ähneln. Doppeldeletionsstudien mit den Fusionskomponenten Fzo1 und Mdm30 lassen annehmen, dass Mdm36 der Fusion entgegengesetzt wirkt. Außerdem ist in delta-mdm36-Mutanten die durch die Depolymerisation des Aktinzytoskeletts induzierte mitochondriale Teilung blockiert und die Anzahl an teilungsaktiven Dnm1-Komplexen reduziert. Das Zellkortex-assoziierte Protein Num1 interagiert mit mitochondrial assembliertem Dnm1 und fördert über die dadurch geschaffene Verankerung der Mitochondrien am Zellkortex die mitochondriale Teilung. Der mitochondriale Phänotyp der delta-mdm36-Mutanten und delta-num1-Mutanten ist fast identisch. Beide Mutanten besitzen netzähnliche, kompakte Mitochondrien, die wenig Nähe zur Zellperipherie aufweisen und hoch dynamisch sind. Durch die Abwesenheit von Mdm36 wird die Kolokalisation von Dnm1 und Num1 aufgehoben. Diese Ergebnisse liefern weitere Einblicke in die mitochondriale Teilungsmaschinerie und legen ein Modell nahe, in dem Mdm36 für die Bildung des Num1/Dnm1-Komplexes und folglich für die Verankerung der Mitochondrien am Zellkortex benötigt wird. Über diesen wird dann die notwendige Spannung entlang des Mitochondrientubulus für die Dnm1-abhängige Teilung erzeugt. Im zweiten Teilabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die mitochondriale Morphologie der Mutanten der kürzlich identifizierten Twin Cx9C-Protein-Familie analysiert. Anschließend wurde das dabei und durch eine vorhergehende systematische Durchmusterung einer Hefedeletionsstammsammlung auffällig gewordene Protein Mdm35 näher untersucht. Mdm35 ist ein mitochondriales Protein des Intermembranraums, dessen Deletionsmutante zum Großteil sphärische Mitochondrien besitzt und einen Wachstumsdefekt bedingt durch den Verlust von mitochondrialer DNA aufweist. Die Mitochondrien und das instabile mitochondriale Genom der delta-mdm35-Mutante zeigen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen entweder die mitochondrialen Innenmembranproteine Mdm31 bzw. Mdm32 fehlen, oder die mitochondrialen Außenmembranproteine Mmm2, Mdm10, Mdm12 bzw. das integrale Membranprotein des Endoplasmatischen Retikulums Mmm1. Die gleichzeitige Deletion von MDM35 und MDM31 bzw. MDM32 ist synthetisch letal, was ein Hinweis darauf ist, dass die Proteine an demselben zellulären Prozess beteiligt sind. Für die Deletion von MDM31 und MDM32 konnte bereits eine synthetische Letalität mit MMM1, MMM2, MDM10 und MDM12 gezeigt werden. Mmm1, Mmm2, Mdm10 und Mdm12 bilden einen Komplex aus, der eine Bindung zwischen dem Endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien herstellt und vermutlich für den Austausch von Calcium und Phospholipiden zuständig ist. Dieser Komplex befindet sich außerdem in Nachbarschaft aktiv replizierender mitochondrialer DNA. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mdm35 möglicherweise als Protein des Intermembranraums eine Funktion bei der Vermittlung zwischen dem Mmm1/Mmm2/Mdm10/Mdm12-Proteinkomplex und den Innenmembranproteinen Mdm31/Mdm32 besitzt und so ein koordiniertes mitochondriales Wachstum ermöglicht durch Kopplung der Replikation des mitochondrialen Genoms und der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Membranen über den Lipidtransport.
-
Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen mitochondrialer Morphologie, Alterung und Apoptose in Saccharomyces cerevisiae
(2010)
-
Mark Dürr
- Mitochondrien üben viele essentielle Funktionen in eukaryotischen Organismen aus. Ihre Aufgaben bestehen zum Beispiel in der Bereitstellung von Energie in Form von ATP durch die oxidative Phosphorylierung sowie in der Bildung von Eisen-Schwefel-Clustern. Mitochondrien bilden ein Netzwerk, dessen Form sich hochdynamisch an spezifische Bedingungen und Änderungen im Metabolismus anpassen kann. Die Bedeutung einer intakten Dynamik wird dann offensichtlich, wenn man die Auswirkungen der Fehlregulierung dieses Prozesses betrachtet. Die Störung der mitochondrialen Fusion geht in Säugern mit einer Reihe von schweren Erkrankungen, wie Charcot-Marie-Tooth Neuropathie Typ 2A oder Dominanter Optischer Atrophie einher. Zudem spielen Mitochondrien und die mitochondriale Dynamik eine zentrale Rolle beim programmierten Zelltod (Apoptose). Die Fragmentierung der Mitochondrien ist dabei ein entscheidender Schritt beim Ablauf dieses Prozesses. Auch in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, einem fakultativ anaeroben eukaryotischen Organismus, spielen mitochondriale Teilung und Fusion eine wichtige Rolle bei der Apoptose. Bis heute sind jedoch kaum negative Auswirkungen fehlgesteuerter mitochondrialer Dynamik auf andere Prozesse wie Zelldifferenzierung oder Alterung in Hefezellen bekannt. In dieser Arbeit wurde der Effekt von gestörter mitochondrialer Teilung und Fusion auf die Sporulation von Hefezellen sowie auf deren Lebensdauer untersucht. Dabei wurde auch der Zusammenhang zwischen Apoptose und Zellalterung in Hefekulturen näher betrachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Deletion von Mdm30 (mitochondrial distribution und morphology protein 30), einem Regulator des mitochondrialen Fusionsproteins Fzo1 (fuzzy onions homolog 1), zu einer eingeschränkten Sporulationseffizienz sowie zu mitochondrialen Vererbungsdefekten in den einzelnen Sporen führt. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen, dass eine intakte mitochondriale Dynamik ausschlaggebend für die Alterung von Hefekulturen ist. Die gleichzeitige Blockade der mitochondrialen Fusion und Teilung durch Deletion der Fusionskomponente Fzo1 und des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1 (dynamin-related protein 1) hat negative Auswirkungen auf das Wachstum und die Fitness der Hefekulturen. Der mitochondriale Fusionsdefekt führt zudem zu einer stark herabgesetzten chronologischen Lebensdauer verbunden mit verstärkter Apoptose der Hefezellen. Eine direkte Blockade der Apoptose durch die Deletion des proapoptotischen Faktors Yca1 (yeast caspase 1) führt ebenfalls zu einer Reduktion der chronologischen Lebensdauer von Hefekulturen. Interessanterweise verlängert die gleichzeitige Inkubation der Mutante mit wildtypischen Zellen die Lebensdauer der Δyca1-Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Hefekulturen vom programmierten Zelltod einzelner Zellen profitieren können, was zu einer Verlängerung der chronologischen Lebensspanne führt. Obwohl Sinn und Nutzen des programmierten Zelltodes für S. cerevisiae immer noch kontrovers diskutiert werden, liefern die in dieser Arbeit erzielten Erkenntnisse weitere Argumente für die Notwendigkeit der Apoptose für diese einzelligen Organismen.
-
Untersuchungen zur anterograden Bewegung und Vererbung von Mitochondrien in Saccharomyces cerevisiae
(2012)
-
Johannes König
- Mitochondrien können nicht de novo synthetisiert werden und müssen daher aktiv in die Tochterzelle vererbt werden. In Saccharomyces cerevisiae bewegen sich die Mitochondrien entlang des Aktinzytoskeletts. Dabei werden zwei mögliche Mechanismen für den anterograden Transport diskutiert. In einem Modell wird die anterograde Bewegung von Mitochondrien durch das Myo2 Motorprotein vermittelt. Im Gegensatz dazu wird in einem zweiten Modell vorgeschlagen, dass Aktinpolymerisation durch den Arp2/3-Komplex an der mitochondrialen Oberfläche die Mitochondrien in die Knospe transportiert.
Durch Analyse einer temperatursensitiven Mutante von ARC40, das für einen essentiellen Bestandteil des Arp2/3-Komplex kodiert, konnte die Rolle der Arp2/3-abhängigen Aktinpolymerisation bei der Bewegung von Mitochondrien überprüft werden. Die Ergebnisse der Versuche bei nichtpermissiver Temperatur deuten jedoch nicht auf eine direkte Rolle von Arc40 beim mitochondrialen Transport hin. Desweiteren wurde die Beteiligung von Myo2 bei der mitochondrialen Vererbung genauer untersucht. Der Austausch bestimmter Aminosäuren in der Cargo-Bindedomäne von Myo2 führt zu einer Veränderung der Morphologie und des Transportes von Mitochondrien. In dieser Arbeit konnte der Bereich der Myo2 Cargo-Bindedomäne näher charakterisiert werden, der für die Vererbung von Mitochondrien von Bedeutung ist. So führen Aminosäureaustausche in dieser Region von Myo2 zu einem Transport- und Morphologiedefekt von Mitochondrien, der durch artifizielle Verankerung des Myo2 Motorproteins in der mitochondrialen Außenmembran gerettet werden konnte. Auch die negativ synthetischen Effekte von Mutationen in der Cargo-Bindedomäne von Myo2 mit der Deletion des Gens für die am Transport der Mitochondrien beteiligte Rab-GTPase Ypt11 konnten durch Expression dieser Mitochondrien-spezifischen Variante von Myo2 aufgehoben werden. Mittels Immuno-Elektronenmikroskopie gelang es, Myo2 auf der Oberfläche von isolierten Mitochondrien nachzuweisen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Myo2 entscheidend und direkt an der Vererbung von Mitochondrien in S. cerevisiae beteiligt ist.
Um einen Rücktransport in die Mutterzelle zu verhindern, müssen Mitochondrien nach ihrem Transport in die Knospe dort verankert werden. Die genetischen Daten dieser Arbeit sprechen dabei für eine Rolle von Mmr1, einem mitochondrialen Außenmembranprotein, das die Vererbung von Mitochondrien beeinflusst. Mit Hilfe von pulldown-Experimenten wurde in dieser Arbeit versucht, weitere Kandidaten für ein mitochondriales Myo2 Adapterprotein zu finden.
Ausgehend von den genetischen Daten zum Transport von Mitochondrien wurde ein Modell entwickelt, bei dem die mitochondriale Morphologie, Ypt11 sowie eine Retention von Mitochondrien in der Knospe zum anterograden Transport durch Myo2 beitragen.
