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Funktionale Analyse des ATPase- und des Zn2+-Bindungs-Motivs der Bacillus subtilis Protease FtsH und deren Einfluss auf die Sporulation
(2004)
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Matthias Kotschwar
- Die membrangebundene, ATP- und Zn2+- abhängige Metalloprotease FtsH ist in E. coli bereits gut untersucht. Es handelt sich um ein multifunktionales Protein mit ATPase- und Protease-Aktivität. Dort wurden eine Vielzahl von E. coli ftsH-Mutanten mit pleiotropen Phänotyp charakterisiert und die Auswirkung von gezielten Mutationen in vivo und in vitro analysiert (Akiyama et al., 1994; Akiyama et al., 1996). Über FtsH aus B. subtilis ist hingegen noch wenig bekannt. Bisher wurden erst die Phänotypen einer ftsH-Nullmutante und einer Insertionsmutante beschrieben, die zu einem pleiotropen Phänotyp führen. Die Rolle bestimmter Bereiche oder Aminosäuren von FtsH wurden hier nicht untersucht (Deuerling et al., 1995; Deuerling et al., 1997; Lysenko et al., 1997). In ihrer Diplomarbeit konstruierte Eva Harfst 1999 vier B. subtilis ftsH-Allele, indem sie gezielt Aminosäuren in der Walker-A-Box und im Zinkbindungsmotiv austauschte, wie sie bereits für E. coli und Hefe FtsH beschrieben wurden. Diese mutierten ftsH-Gene und ein wildtypisches zur Kontrolle brachte sie in den pX-Vector ein, wodurch sie unter die Kotrolle eines Xylose-induzierbaren Promotors gestellt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die mutierten ftsH-Allele in das B. subtilis-Chromosom integriert und in einem zweiten Schritt das wildtypische ftsH deletiert. Die Phänotypen der so erzeugten Mutanten (sowohl die aus dem ersten Schritt, die noch das wildtypische ftsH tragen, als auch die aus dem zweiten Schritt, die nur noch das mutierte Allel tragen) wurden hinsichtlich des filamentösen Wachstums, der Sporulation, der Sensitivität gegenüber Hitzeschock und hyperosmotischen Bedingungen analysiert. Dabei stellte sich heraus, das die mutierten Allele keinen Einfluss auf den Phänotyp der Stämme haben, die das wildtypische ftsH noch tragen, und in den Knockout-Stämmen das wildtypische ftsH nicht ersetzen können, also den Phänotyp einer ftsH- Nullmutante zeigen. Des weiteren sind die mutierten ftsH-Allele ebenfalls nicht in der Lage, die Defizienz in der Subtilisin-Sekretion zu kompensieren. ATPase-Tests zeigten, dass die eine Mutation im Walker-A-Motiv die ATPase-Aktivität der beiden betroffenen Proteine ausschaltete. Protease-Tests ergaben, dass keines der mutierten FtsH-Proteine noch eine Protease-Aktivität aufweist. Das bedeutet, dass einerseits die Basenaustausche im Zinkbindungsmotiv die Protease-Aktivität ausschalten, andererseits aber auch keine Protease-Aktivität ohne ATPase- Aktivität möglich ist. Daraus folgt weiterhin, dass die ATPase-Aktivität des FtsH-Proteins allein nicht ausreicht, um einen der untersuchten pleiotropen Phänotypen einer ftsH--Mutante zu kompensieren. Die Funktionalität sowohl der ATPase- als auch der Protease-Domäne ist also für FtsH und somit für B. subtilis hinsichtlich des filamentösen Wachstums, der Sporulation, der Sensitivität gegenüber Hitzeschock und hyperosmotischen Bedingungen essentiell. Anhand von Northern-Blot-Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass FtsH eine essentielle Rolle bei der Phosphorylierung von Spo0A haben muss, da ohne FtsH kein aktives Spo0A gebildet wird. Die daraus resultierende Sporulationsdefizienz kann aber durch eine Spo0A-Mutante, die ohne Phosphorylierung aktiv ist, fast vollständig kompensiert werden. FtsH ist also während der Sporulation nur für die Phosphorylierung von Spo0A essentiell.
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Construction of an efficient secretion system for recombinant proteins in Bacillus subtilis
(2011)
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Kelly Cristina Leite
- All proteins being translocated through the cytoplasmic membrane of bacteria cells as well as some proteins that are inserted into the cytoplasmic membrane contain a signal sequence at their N-terminus that is recognized by and targeted to the translocation machinery. Three translocation pathways have been described, so far in E. coli to allow secretion of proteins: The Sec, the Tat and the SRP (Signal Recognition Particle) pathway. While the Sec and the Tat pathway act post-translationally and accept unfolded and correctly folded polypeptides, respectively, the SRP pathway acts co-translationally. For proteins secreted through the cytoplasmic membrane via the Sec pathway, the ATP-dependent motor protein SecA is required for translocation. The translocation process of some proteins following the SRP pathway has also shown to be enhanced by the presence of SecA. The Sec and the SRP pathway share the heterotrimeric protein-conducting channel translocon complex composed of the SecYEG proteins. Based on the known characteristics of both pathways, the goal of this PhD project was to construct an efficient secretion system for recombinant proteins in Bacillus subtilis using an a-amylase as a reporter enzyme, which is secreted into the medium using the Sec pathway. Its gene amyQ was fused to an IPTG-inducible promoter. It turned out that increasing amounts of IPTG did not result in a concomitant increase of secreted a-amylase. Overproduction either formed aggregates within the cytoplasm or preproteins targeted to the translocon jammed the membrane. To release the accumulated protein within the cells two different experiments were carried out: i) a co-production and overexpression of SecA, and; ii) overexpression of an artificial secYEG operon. First, increased production of SecA showed significantly decrease in the total synthesis and secretion of a-amylase and did not reduce cytoplasmatic accumulation or membrane jamming. Second, the artificial operon enhanced expression of secY, secE and secG genes resulted in a higher amount of reporter enzyme secreted into the medium. Furthermore, two different experiments using the transposon mutagenesis strategy were carried out in order to screen for B. subtilis mutants able to increase secretion of α-amylase. Transposon mutagenesis was performed with the mariner-based transposon to inactivate gene(s) whose product might regulate directly or indirectly the secretion of α-amylase. No mutant strain presenting a higher secretion of α-amylase on indicator plates was found. In addition, I devised a modified transposon containing a xylose-expression cassette. To test the efficiency of the modified transposon, the promoter-less cat gene was used as a reporter gene and integrated into the B. subtilis chromosomal DNA. After transposon mutagenesis, mutants expressing the promoter-less cat gene were isolated. This result indicates that the modified transposon might lead to increased production of a gene in the presence of xylose and that this product might then enhance secretion of α-amylase to be detected on indicator plates. In the third part of my thesis, a terminator-test vector was constructed which should allow the identification of strong terminators acting as 5'-stabilizing element. This vector consists of an artificial bicistronic operon containing the two reporter genes bgaB and gfp allowing the insertion of the terminators between the two genes. Insertion of a terminator should lead to a reduction of the amount of GFP. The system was verified with the known sinIR transcriptional terminator. It turned out that the vector with the two reporter genes already exhibited instability in E. coli.
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Identification of substrate proteins of FtsH during sporulation of Bacillus subtilis
(2012)
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Hue Bach Thi Nguyen
- FtsH is an ATP- and Zn2+-dependent metalloprotease anchored in the cytoplasmic membrane by two transmembrane segments. It is the unique membrane-bound AAA-protease in bacteria that performs a variety of regulatory functions. In B. subtilis, an ftsH knockout exhibits a pleiotropic phenotype such as filamentous growth, sensitivity towards heat, osmotic shock and cells are unable to sporulate. Recently, it has been shown that ftsH knockout cells fail to entry sporulation stage II due to lack of a sufficient amount of Spo0A~P and the first substrate of FtsH identified in B. subtilis is the Spo0E phosphatase, a negative regulator that dephosphorylates Spo0A~P. However, the sporulation frequency in a spo0E ftsH double mutant strain was only partly restored, we hypothesized that FtsH might degrade additional substrate proteins involved in sporulation. To identify these proteins, two different strategies were applied. By using the 2D gel technique, the proteomes of an ftsH wild-type strain was compared with an ftsH null mutant. Several proteins were identified to be either up- or down-regulated in the absence of FtsH. One of them up-regulated about 4-fold was identified as Spo0M. Since ftsH did not interfere with transcription of spo0M, an in vitro proteolysis assay was established using purified components. It was shown that Spo0M was degraded by FtsH in an ATP- and time-dependent way. In the second strategy, an ftsHtrap mutant was constructed and tested for loss of its proteolytic activity. Protease trap mutants are still able to bind substrate proteins, but are unable to degrade them. By using FtsHtrap fused to a GST-tag, YwnF, a membrane protein, was trapped and identified as a substrate of FtsH by mass spectrometry. However, further experiments will be required to confirm YwnF as a target of FtsH. The last part of this thesis was focused on the eag gene, which forms a bicistronic operon with Spo0E. Construction and analysis of an eag insertion mutant exhibited a slight increase in the sporulation frequency and in the amount of Spo0A. A transcriptional fusion between the promoter of the spo0E-eag operon and the lacZ reporter gene revealed an increase in the beta-galactosidase activity from t0 when the cells were grown in sporulation medium. Since the Eag protein may be an integral membrane protein, it may bind excess Spo0E thereby preventing it from dephosphorylating Spo0A~P. Alternatively, Eag may bind Spo0E and present it as a modulator to FtsH for degradation.
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Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis
(2011)
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Katharina Schäfer
- Der Gram-positive Modellorganismus Bacillus subtilis besitzt 17 alternative Sigmafaktoren, von denen 7 zur Gruppe der ECF (extra-cytoplasmic function) -Sigmafaktoren gehören. Einer dieser ECF-Sigmafaktoren, SigX, und sein entsprechender Anti-Sigmafaktor, RsiX, sind Gegenstand dieser Arbeit. Dabei handelt es sich bei RsiX um ein Transmembranprotein, während SigX im Cytoplasma lokalisiert ist und von der N-terminalen RsiX-Domäne von einer Interaktion mit der RNA-Polymerase abgehalten wird. SigW, ein weiterer ECF-Sigmafaktor, und RsiW, der dazugehörende Anti-Sigmafaktor, sind bereits sehr gut untersucht. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten zwischen SigX/RsiX und SigW/RsiW wurde angenommen, dass die Aktivierung des SigX-Regulons in vergleichbarer Weise erfolgt, wie es für das SigW-Regulon aufgrund intensiver Analysen sehr gut untersucht ist. Die in dieser Arbeit verwendete Methode der Transposonmutagenese lieferte entscheidende Hinweise über die Regulation des sigX-rsiX-Operons. Es konnte gezeigt werden, dass das sigX-rsiX-Operon einer Regulation durch den Transkriptionsterminator Rho unterliegt. Damit wurde das erst dritte Beispiel für eine Termination der Transkription durch den Faktor Rho in B. subtilis bekannt. Als wichtiges Element für die faktorabhängige Termination der Transkription gilt das Vorhandensein einer rut-site, der Bindestelle des Faktors Rho in der naszierenden mRNA. In dieser Arbeit wurden verschiedene Analysetechniken angewandt, um mit Hilfe eines GFP-RsiX-Reporters erstmals eine rut-site in B. subtilis zu kartieren. Die hier identifizierte rut-site von rsiX ist am 5´-Ende dieses Gens lokalisiert. Bei diesen Analysen wurde außerdem deutlich, dass es im sigX-rsiX-Operon zu einer faktorabhängigen intragenischen Termination der Transkription kommt, bei welcher nicht nur die Transkription von rsiX, sondern auch die Expression des stromaufwärts liegenden sigX beeinflusst wird. Punktmutationen in der Sequenz für die rut-site von rsiX zerstörten den Einfluss des Faktors Rho auf das sigX-rsiX-Operon, so dass keine Termination der Transkription mehr stattfand und die detektierbare Menge an sigX-rsiX-Transkript deutlich anstieg. Nur so war es möglich, einen rsiX-Knockout zu komplementieren. Messungen der beta-Galaktosidase-Aktivität eines lacZ-Reporters belegten zudem die Funktion von RsiX als Anti-Sigmafaktor von SigX. Der Verlust des Einflusses von Rho auf das sigX-rsiX-Operon aufgrund einer mutierten rut site machte auch immunologische Nachweise des Anti-Sigmafaktors möglich. Infolgedessen konnte der Frage einer möglichen RsiX-Proteolyse nach dem Vorbild der RsiW-Proteolyse nachgegangen werden. Für RsiW wurde bereits gezeigt, dass ein bestimmtes Stress-Signal den Abbau des Anti-Sigmafaktors einleitet. Die Proteolyse von RsiW erfolgt dann nach dem Mechanismus der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) unter der Beteiligung mehrerer Proteasen. Neben der Beteiligung der Protease RasP an der RsiW-Proteolyse konnte hier auch die Beteiligung von RasP an der RsiX-Proteolyse nachgewiesen werden. Gleichzeitig wurde aber ausgeschlossen, dass die Protease PrsW, welche auch an der RsiW-Proteolyse beteiligt ist, in die RsiX-Proteolyse involviert ist. Demnach können die einzelnen Schritte der RsiW-Proteolyse nicht einfach auf die RsiX-Proteolyse übertragen werden, obwohl es sich bei beiden Transmembranproteinen um Anti-Sigmafaktoren ihrer jeweiligen ECF-Sigmafaktoren handelt.
