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Analyse der Funktion und Regulation des ECF-Sigmafaktors YlaC aus Bacillus subtilis
(2005)
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Stephan Zellmeier
- Alternative Sigmafaktoren mit extracytoplasmatischer Funktion (ECF-Sigmafaktoren) repräsentieren eine sich kontinuierlich vergrößernde Gruppe an Regulatorproteinen, die an der differentiellen Genexpression in Bakterien beteiligt sind. Obwohl Gene, welche durch diese Regulatorproteine kontrolliert werden, ebenso wie die Regulationsmechanismen noch weitgehend unaufgeklärt sind, scheinen ECF-Sigmafaktoren in Bakterien eine Schlüsselrolle im Bereich der Stressantwort, der Differenzierung und der Pathogenese zu spielen. In dem Gram-positiven Modellorganismus B. subtilis konnten bislang sieben Gene mit Ähnlichkeiten zu ECF-Sigmafaktoren identifiziert werden (sigX, sigW, sigM, sigY, sigV, sigZ und ylaC), wobei hauptsächlich sigX, sigW und sigM im Zentrum durchgeführter Untersuchungen standen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle ECF-Sigmafaktor YlaC hinsichtlich seiner Funktion und Regulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ylaC Teil eines tetracistronischen Operons ist und mit dem Gen seines möglichen Anti-Sigmafaktors kotranskribiert wird. Zusätzlich kodiert das Operon für zwei weitere Membranproteine mit bislang unbekannter Funktion. Obgleich kein spezifischer Stressfaktor identifiziert werden konnte, wurde die positive Regulation des ylaA-Operons durch YlaC eindeutig gezeigt. Die Ergebnisse einer globalen Transkriptionsanalyse deuten darauf hin, dass YlaC ausschließlich sein eigenes Operon reguliert. Durch Primer-Extension konnte der Transkriptionsstartpunkt des ylaA-Operons bestimmt werden. Die ermittelte Promotorsequenz ähnelt bereits identifizierten Promotorsequenzen von ECF-Sigmafaktoren aus B. subtilis. Die für den ylaA-Promotor ermittelte Sequenz konnte vor keinem anderen Ges des B. subtilis-Genoms gefunden werden. Durch Northern-Blots und b-Galaktosidase-Tests mit einem DylaD-Stamm wurde gezeigt, dass YlaD als Anti-Sigmafaktor von YlaC wirkt. Gereinigtes YlaD bindet Zink in äquimolaren Mengen und wird deshalb einer neu-definierten Familie von Zink-bindenden Anti-Sigmafaktoren zugeordnet. YlaD ist ein Membranprotein, dessen C-terminus in der Cytoplasmamembran verankert ist. Nach Überexpression konnte YlaD in Western-Blots nur dann nachgewiesen werden, wenn das yluC-Gen, welches für eine intramembrane Protease kodiert, deletiert war. Eine YluC-Variante mit einer Mutation im aktiven Zentrum war nicht mehr in der Lage, das sW-Regulon aus B. subtilis zu aktivieren. In einer DyluC-Mutante reicherten sich auch verkürzte Formen der SigX und SigM Anti-Sigmafaktoren an, was auf eine generelle Rolle von YluC bzw. von intramembraner Proteolyse bei der Regulation von ECF-Sigmafaktoren in B. subtilis hindeutet. Eine mögliche Funktion der bislang uncharakterisierten Membranproteine YlaA und YlaB bei der Regulation der YlaC-Aktivität wurde durch die Konstruktion von Reporterstämmen, welche verschiedene Kombinationen aller vier Gene des ylaA-Operons enthielten, analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von YlaB einen Einfluss auf die Anti-Sigmafaktor-Aktivität von YlaD hat. Durch Western-Blots war ein stabilisierender Einfluss von YlaB auf YlaD nachweisbar. Eine direkte Interaktion zwischen YlaB und YlaD konnte durch in vitro-Experimente gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YlaD, zusammen mit YlaB und eventuell auch mit YlaA, Teil eines membrangebundenen Proteinkomplexes ist, der YlaD vor dem Abbau durch YluC schützt.
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Gating of water channels (aquaporins) in plants: effects of osmotic and oxidative stresses and the role of unstirred layers
(2006)
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Qing Ye
- There is accumulating evidence that water channels (aquaporins; AQPs) play an important role in plant water relations at the levels of cells, tissues, organs, and whole plants. AQPs facilitate the rapid, passive exchange of water across cell membranes. Most of the water permeability of plasma membranes is due to AQP activity, i.e. the open/closed state of AQPs can be ‘gated’ in order to regulate water movement. Many internal (metabolic) factors or external (environmental) stresses have been found to cause a gating of AQPs, but the precise gating mechanisms are not well understood. Using pressure probe techniques, water and solute flows across cell membranes (internodes of giant green alga Chara and of cortical cells of corn root) and across an entire organ (roots of young corn seedlings) were studied. Based on detailed information on the function of AQPs, two new gating mechanisms of AQPs have been proposed. One is the ‘cohesion/tension (C/T) mechanism’ for the osmotic gating of AQPs, which is used to interpret the effect of high concentration on cell hydraulic conductivity (Lp) during osmotic stress. The other one is the ‘oxidative gating mechanism’ of AQPs in the presence of hydroxyl radicals (*OH) or of hydrogen peroxide (H2O2). Evidence for an osmotic gating of AQPs was provided from measurements of effects of high concentration on cell Lp in Chara internodes. The osmotic dehydration is thought to be caused by the fact that the exclusion of solutes from AQPs creates tensions (negative pressures) within the water channel pores, when the osmolyte is present on both sides of the membrane. This should have affected the open/closed state by changing the free energy between states favouring a reversible distorted/collapsed state rather than the open. As expected from the C/T model, effects increased with increasing both the concentration and size of osmolytes. Pore volumes of AQPs in the plasma membrane of Chara internodes were estimated from exponential ‘dehydration curves’. The analysis of osmotic responses showed that there were narrow pores with a volume of 2.3 ± 0.2 nm3 and bigger ones with a volume of between 5.5 ± 0.8 and 6.1 ± 0.8 nm3. Alternatively, pore volumes were estimated from ratios between osmotic ( ) and diffusional (Pd) water flow as derived from measurements of hydraulic and isotopic water flows, which represent the number of water molecules (N) in a single-file pore transporting water. Values of N ranged between 35 and 60, which referred to volumes of 0.51 and 0.88 nm3/pore. This value was substantially smaller than that obtained during osmotic dehydration, but bigger than values from literature. The difference may be due to an underestimation caused by unstirred layers (USLs), which would affect Pd rather than Pf (Lp). Based on analytical solutions from diffusion kinetics and measured experimental results, even for the most rapidly permeating solute heavy water (HDO), USLs should have resulted in an underestimation of Pd by less than 30 %. Evidence for an ‘oxidative gating’ of AQPs was derived from experiments with Chara internodes, which was then tested for higher plant tissue cells as well (root cortical cells of corn). In the presence of hydroxyl radicals (*OH) as produced during the Fenton reaction (Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + *OH), cell Lp of Chara internodes was dramatically but reversibly reduced. In experiments with young corn roots, in the presence of hydrogen peroxide (H2O2), half times of water flows increased at the level of both entire roots and individual cortical cells by factors of 3 and 9, respectively, i.e., hydraulic conductivity decreased by the same factors. Results indicated that there might be a common interaction between the redox state (oxidative stress) and water relations (water stress) in plants. For solutes rapidly permeating through cell membranes, closure of water channel resulted in anomalous osmosis (negative reflection coefficients), i.e., in the striking situation that a cell did not shrink but swelled in a hypertonic medium. For the first time, anomalous osmosis has been demonstrated in roots as well, i.e., for an entire organ and in the presence of a rather complicated osmotic barrier. The phenomenon has been interpreted in terms of the composite transport structure of both the cell membrane and the root. In the presence of a rapidly permeating solute like acetone, channel closure resulted in a situation that the solute moved faster than the water, and the reflection coefficient (ss) reversed its sign.
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In situ studies of sugar metabolism in Ricinus communis L. and Saccharum officinarum L.
(2004)
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Shih-Long Yan
- In order to find the sucrose efflux transporter of the endosperm of Ricinus communis L., the yeast complementation selection method was used, but it was unsuccessful. Mutation was occurred on the nSC4+ plasmid during the selection. Maybe the stress of the yeast cells was too strong and then induced the mutation in the yeast cells. Using a weak promoter and reducing the copy number of the plasmid may avoid the mutation occur during the selection. The endosperm of Ricinus communis L. stores lipid and converts it to sucrose for the growth of seedlings. Sucrose phosphate phosphatase gene, RcSPP1, was cloned from the endosperm of the germinating seedling of Ricinus communis L. The endosperm cells synthesize sucrose by using SPS and SPP rather than sucrose synthase. Northern blot analysis indicated that the RcSPP1 expression level of the germinating endosperm was very similar from day 2 to day 6. The expression of nsLTPc1 is cotyledon-specific. It is also confirmed by in situ hybridization. The results of nsLTPc1 in situ hybridization indicate that the expression of nsLTPc1 was a cell-specific. The expression of nsLTPc1 was found only in the lower side of the cotyledons of Ricinus communis L. The expression of RcSCR1 is found in the endosperm, hypocotyl and cotyledons of the Ricinus communis L. germinating seeds. By northern blot analysis of the RNA from different days old endosperm, it indicates that the RcSCR1 has a highest expression level at day 5. By in situ hybridization and immunolocalization, the results illustrate that the mRNA and protein can be found in the lower epidermis of cotyledons from day 2 to day 5. In the 6-day-old cotyledons, the mRNA and protein of RcSCR1 are predominantly found in palisade parenchyma cells, but they are also found in the lower epidermis of cotyledons. The results of in situ hybridization indicate that the transcript of RcSCR1 can be found in most of the endosperm cells. RcSCR1 can be found in the middle layer of the endosperm from day 2 to day 5, no transcript of RcSCR1 is found in the cell layers near the seed coat. On the day 6, no RcSCR1 transcript can be detected in the endosperm cells. It is suggest that the function of RcSCR1 protein is to retrieve the sucrose from apoplastic space to avoid sucrose escape. Compared to the amino acid sequence of known sucrose transporters, the putative sucrose transporter of Ricinus communis , RcSCR2, belongs to SUT4 subfamily. The transcript of RcSCR2 is found in the endosperm, hypocotyl and cotyledons of the Ricinus communis L. germinating seeds. The expression of RcSCR2 is very weak. The expression level of RcSCR2 cannot be detected by northern analysis. By quantitative real time RTPCR, it indicates that the RcSCR2 has a highest expression level at 3 day. By in situ hybridization, the results illustrate that the mRNA cannot be found in the endosperm, cotyledons and hypocotyl. The results of in situ RTPCR indicate that the transcript of RcSCR2 can be found in most of the endosperm cells. RcSCR2 can be found in the middle layer of the endosperm from day 2 to day 5, no transcript of RcSCR2 is found in the cell layers near the seed coat. On the day 6, no RcSCR2 transcript can be detected in the endosperm cells. Although RcSCR2 in yeast does not function properly, but it shares high homology to other SUT4 type transporters, so they may have the same function to take up sucrose into cells. It is suggest that the function of RcSCR2 protein is to retrieve the sucrose from the apoplastic space to avoid sucrose escape. How the expression of RcSCR1 and RcSCR2 is regulated in the endosperm is still unknown. Sugarcane is a very important food crop. Sugarcane yellow leaf virus leads to sugarcane yellow syndrome and reduces the sugar production. Starch accumulation was found in the virus-infected plants. Within the starch staining, the results indicate that starch is accumulated in bundle sheath cells and mesophyll cells of virus -infected plants, however, starch can be found only in the bundle-sheath cells of virus-free plants. The in situ hybridization study indicates that the expression of ADP-glucose pyrophosphorylase in the mesophyll cells of virus-infected plant is stronger than it in virus-free plants. The results of in situ hybridization of starch branching enzyme indicates that no significant difference between the virus-free-plants and virus-infected. The results are different to it of starch staining. The mechanisms are still unclear, more carbohydrate metabolism related genes must be studied.
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Mikrobielle Kohlenstoff- und Stickstofftransformationen im Verdauungstrakt von Regenwürmern (Oligochaeta)
(2010)
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Pia Katharina Wüst
- Der Regenwurmverdauungstrakt ist eine einzigartige Mikrozone in belüfteten Böden, die ideale Bedingungen für mit der Nahrung aufgenommene Bodenmikroorganismen bietet. In vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass die Emission von N2O durch europäische Regenwürmer auf die Aktivierung von aufgenommenen Boden-Denitrifikanten zurückzuführen ist. Bisher ist nicht bekannt, ob die Emission von N2O ein universelles Merkmal von Regenwürmern ist. Zudem ist nicht vollständig geklärt, welche Gärungsprozesse im Verdauungstrakt des Regenwurms relevant und welche gärenden Taxa dort aktiv sind. Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit zur N2O-Emission bei neuseeländischen Regenwurmarten zu untersuchen sowie die Diversität potentieller Denitrifikanten im Verdauungstrakt und im umgebenden Boden zu bestimmen. Weitere Ziele waren, die in situ-Bedingungen entlang des Verdauungstrakts von Lumbricus terrestris mit den mikrobiellen C- und N-Transformationen in Verbindung zu setzen sowie metabolisch aktive und Glucose-verwertende Bacteria im Verdauungstraktinhalt zu identifizieren. Die in Neuseeland eingeführten Arten Lumbricus rubellus und Aporrectodea rosea (beide Familie Lumbricidae) emittierten N2O, während die eingeführte Art Octolasion cyaneum (Familie Lumbricidae) nur teilweise und die einheimische Art Octochaetus multiporus (Familie Megascolecidae) kein N2O unter in situ-Bedingungen emittierten. Das N2O-Emissionspotential des einheimischen Wurms war deutlich schwächer ausgeprägt als das der eingeführten Würmer. Die Diversität der Denitrifikantenpopulationen in Verdauungstrakten und umgebenden Böden von L. rubellus und O. multiporus wurden anhand der Analyse von N2O-Reduktasegenen (nosZ) bestimmt. NosZ Sequenzen aus den Verdauungstrakten waren sehr ähnlich zu nosZ Sequenzen aus den umgebenden Böden und verwandt zu unkultivierten Bodenbakterien. N2O und H2 wurden von europäischen Würmern emittiert. Höchste in situ-Konzentrationen von N2O wurden im Kropf/Magen und im Enddarm detektiert, während H2 im Vorder- und Mitteldarm höchste Konzentrationen aufwies. Analog dazu waren eine hohe N2O-Bildung von Wurmabschnitten der Kropf/Magen- und Enddarmregion und eine hohe H2-Bildung von Abschnitten der Mitteldarmregion zu verzeichnen. Diese Ergebnisse deuten an, dass Denitrifikation vornehmlich im Kropf/Magen und Enddarm stattfindet, während H2-freisetzende Gärungen im Vorder- und Mitteldarm dominieren. In situ-Mikrosensormessungen wiesen darauf hin, dass der komplette Verdauungstrakt sauerstofffrei ist. Das Redoxpotential lag im Verdauungstrakt zwischen -203 und +388 mV. Im Verdauungstraktinhalt kamen Saccharide und organische Säuren in hohen Konzentrationen vor. Monosaccharide nahmen entlang des Verdauungstrakts ab. Die höchste Konzentration und die größte Diversität an organischen Säuren wurden im Mitteldarm nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit der Nahrung aufgenommene Mikroorganismen während der Darmpassage sich ändernden Bedingungen ausgesetzt sind und unterstützen die Annahme, dass im Verdauungstrakt verschiedene anaerobe mikrobielle Prozesse in räumlicher und damit auch in zeitlicher Abfolge aktiv sind. In anoxischen Inkubationen von Verdauungstraktinhalt mit Glucose wurden Gase und lösliche organische Verbindungen gebildet, was auf die Aktivität verschiedener Gärungsprozesse im Verdauungstrakt hinweist. Mit Hilfe der 16S rRNA basierten Stabilen-Isotopenbeprobung wurden Clostridiaceae und Enterobacteriaceae als dominante Glucose-Verwerter des Regenwurmverdauungstrakts identifiziert. Weiterhin ergab die Analyse von 16S rRNA aus frisch entnommenem Darminhalt, dass 79 Familien metabolisch aktiv waren, wovon 17 als neue Familien-ähnliche Gruppen definiert wurden. Diese Ergebnisse (a) bestätigen frühere Erkenntnisse, welche die Emission von N2O und N2 durch Regenwürmer auf aktive Denitrifikation in deren Verdauungstrakt zurückführen und (b) zeigen, dass die Fähigkeit zur N2O-Emission auch bei Regenwürmern der südlichen Hemisphäre auftritt, jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt sein kann. Weiterhin wurde demonstriert, (c) dass diverse und teilweise unbekannte Taxa im Regenwurmverdauungstrakt aktiv sind, (d) dass dort Clostridiaceae und Enterobacteriaceae sehr wahrscheinlich an der Verwertung von Sacchariden beteiligt sind und (e) dass aufgenommene obligate Anaerobier und fakultative Aerobier gleichzeitig dieselbe Kohlenstoffquelle nutzen können. Prozessorientierte Inkubationsversuche, in situ-Messungen mit Mikrosensoren, die Charakterisierung der in situ-Bedingungen entlang des Verdauungstrakts sowie die molekularbiologische Analyse der Glucose-verwertenden und denitrifizierenden Bakterien aus dem Verdauungstrakt legen die Schlussfolgerung nahe, dass Regenwürmer durch anaerobe mikrobielle Aktivitäten in ihrem Verdauungstrakt zum terrestrischen C- und N-Kreislauf in belüfteten Böden beitragen und eine bedeutende mobile Elektronenquelle (in Form von emittiertem H2) für die Mikrobiota in diesen Böden darstellen.
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Pollination Biology of Gentianales in a Southern Ecuadorian Montane Forest
(2005)
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Doris Anne Wolff
- The pollination and reproductive biology of mostly small flowered, taxonomically related species of the monophyletic order Gentianales (Apocynaceae including Asclepiadoideae, Gentianaceae, and Rubiaceae) was investigated in a tropical montane forest in southern Ecuador. This study is part of an interdisciplinary project on the diversity and functioning of a montane ecosystem, and provides important results with respect to pollination biology. Such data are rarely collected for such a large number of taxa in a way that permits asking questions concerning both community ecology and evolution. This thesis investigates the contribution of diurnal floral visitors to the reproductive success of the night flowering "sphingophilous" Isertia laevis (Rubiaceae), and discusses the value of pollination syndromes in characterizing the pollinator spectrum of a given plant. Isertia laevis possesses flowers that are morphologically adapted to pollination by sphingids, but diurnal flower observation showed that nine different hummingbirds (Trochilidae) were frequent visitors. At night, only a few sphingid individuals were observed. Pollination experiments showed that flowers exclusively presented to nocturnal pollinators had a low fruit set (14%) but a high seed set (59%). Flowers accessible only to diurnal floral visitors showed a high fruit set of 63%, but a low seed set of 14%. Efficiency of pollination (fruit set X seed set) was equal for both diurnal and nocturnal pollinators. This shows that frequently occurring, but not very effective pollinators contribute substantially to seed production when the expected pollinators are scarce. This study is one of the first examining the pollination biology of Apocynaceae-Asclepiadoideae, tribe Asclepiadeae (other than the temperate genus Asclepias), providing basic information on a plant's reproductive biology, focusing on animal-plant interactions of these mostly twining, highly scattered inhabitants of forests and forest margins, possessing very small, inconspicuous flowers. A large variety of floral visitors was observed on the flowers, however, pollinaria were carried by only four insect species. The flowers showed a comparatively low pollinaria removal rate with an average of 0.32 ± 0.13, and an even lower average was recorded for the pollinia insertion rate at 0.13 ± 0.07. The percentage of inserted pollinia to removed pollinaria was comparatively high with an average of 42.7% ± 22.3%. This shows that if an insect achieves pollinia transfer, it does so very effectively. The derived floral structure and pollinating system in the Apocynaceae-Asclepiadoideae has often been characterized as a very close flower-pollinator interaction. The present study, however, suggests limited specialization, with some degree of generalization. Sucrose is the predominant floral nectar sugar in the order Gentianales (although the order possesses flowers morphologically adapted to ornithophily, sphingophily, chiropterophily, melittophily, and myiophily), suggesting that nectar sugar composition is a conservative characteristic. The only significant differences in sugar composition were found in chiropterophilous and myiophilous flowers, which had a significantly lower sugar ratio than sphingophilous flowers. A separation of chiropterophilous and myiophilous flowers from the other pollination syndromes was further substantiated by non-metric, multidimensional scaling using the CNESS index of dissimilarity, based on nectar sugar compositions. Further, matrix tests revealed no correlation of observed floral visitors to nectar concentrations, whereas a weak significant correlation was found between floral visitors and nectar sugar compositions. Therefore, some degree of adaptive convergence of floral nectar compositions to principal pollinator type within the constraints set by phylogenetic history is likely. Matrix tests revealed a correlation between floral visitors and nectar volume of covered flowers, and to a lesser extent, of uncovered flowers. The nectar volumes of covered and uncovered flowers were related to, and differ significantly among, pollination syndromes. Therefore, the driving force to visitation appears to be the volume of nectar the visitor can expect to consume. A phylogenetic study of Arcytophyllum (Rubiaceae) based on Internal Transcribed Spacer (ITS) was conducted and compared with an earlier study based on cpDNA. To understand the expression of heterostyly in the genus, we analyzed the inter- and intraspecific variation in floral morphology, nectar, pollen-ovule ratio, and seed set of ten species in eleven populations. Stigma and anther levels differed significantly between the morphs in the species/populations investigated except in A. filiforme. Different expressions of heterostyly in Arcytophyllum seemed independent of phylogenetic relationships, however, there was a tendency towards a higher percentage of sucrose in the more derived species of the genus. Nectar sugar composition was similar between the morphs. Pollen dimorphism, both with regard to number (long-styled > short-styled) and to size (short-styled > long-styled) was observed in all taxa investigated except for A. filiforme. This shows that both features in the expression of heterostyly and the reproductive system may vary among closely related species.
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Biologieunterricht im Naturkundemuseum im Spannungsfeld zwischen Instruktion und Konstruktion – eine empirische Untersuchung zu kognitiven und affektiven Lerneffekten (am Beispiel des Umweltschutz-Informationszentrums Lindenhof in Bayreuth)
(2004)
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Matthias Wilde
- 1. Auf der Erkenntnistheorie des Konstruktivismus basierend, existieren unterschiedliche Lerntheorien des Konstruktivismus. Nach der Position des gemäßigten Konstruktivismus von Reinmann-Rothmeier & Mandl (2001) wird das „Prozessmerkmal“ Selbstbestimmung als besonders wesentlich identifiziert und in einer empirischen Studie kontrolliert variiert. Die Untersuchung findet in einem außerschulischen Lernort, einem Naturkundemuseum, das beschrieben und in seiner didaktischen Bedeutung (einschließlich Lernziele) charakterisiert wird, statt. An 366 Gymnasiasten der fünften Jahrgangsstufe wird auf kognitiver und affektiver Ebene die Lernwirkung dieses Faktors in einer eintägigen Intervention evaluiert. Die Schüler durchlaufen im „Museumsunterricht“ entweder ein weitgehend selbstbestimmtes (S-Gruppe), ein fremdbestimmtes (F-Gruppe) Treatment oder eine Mischform aus Selbst- und Fremdbestimmung (SF-Gruppe). 2. In einem Vortest-Nachtest-Design mit Follow-up-Test nach 40 Tagen (Vortest, Nachtest I und II) werden die kognitiven Leistungen der Probanden mit zwei Messinstrumenten, einem Haupttest aus Items mit Antwortvorgaben (Multiple-Choice Test) und einem Nebentest mit Items ohne Antwortvorgaben (offener Test) bestimmt. Die affektiven Bewertungen der Schüler werden in den Nachtests ebenfalls mit geschlossenen und offenen Formaten erfasst. 3. Die zentralen Fragen nach der affektiven Wirkung und dem kognitiven Lernerfolg sind differenziert zu beantworten: a) Auf affektiver Ebene unterscheiden sich die Schülereinschätzungen der drei Treatments unabhängig vom Messinstrument kaum. In allen Gruppen (Gesamt- und Treatmentgruppen) sind die Bewertungen zu Museumsbesuch insgesamt und Elementen dieses Unterrichts im Nachtest I sehr positiv, im Nachtest II kaum geringer. b) Auf kognitiver Ebene zeigen beide Messinstrumente für die Gesamtgruppe aller Schüler Erwerb, Persistenz aber auch Vergessen von Wissen an. Der Museumsbesuch führt somit zu bleibendem Lernerfolg. Bei der Betrachtung der Treatmentgruppen unterscheiden sich die Ergebnisse der beiden Messinstrumente grundlegend: - Im offenen kognitiven Test sind die Schüler des selbstgesteuerten Treatments am besten. Die beiden anderen Gruppen fallen dagegen deutlich ab, unterscheiden sich untereinander jedoch nicht. Im Nachtest II verschwinden alle Unterschiede zwischen den Treatmentgruppen. - Im Multiple-Choice Test führt das mittlere Treatment in beiden Nachtests zu den besten Resultaten. Die fremdbestimmten Probanden zeigen nur im Nachtest I akzeptablen Lernerfolg, im Nachtest II dagegen schlechtere Ergebnisse. Auch das selbstgesteuerte Treatment schneidet in beiden Nachtests relativ schwach ab. Eine entsprechende Analyse deutet darauf hin, dass hier eine Beeinträchtigung dieser Treatmentergebnisse resultierend aus Itemkonstruktion und einem der Grundfrage der Untersuchung immanenten Dilemma zurückzuführen sein könnte. c) Entscheidende Auswirkung hat der Faktor Bekanntheit des Lindenhofs auf die Lernergebnisse des Multiple-Choice Tests. Obwohl die Schüler, die den Lindenhof schon vor diesem Museumsbesuch kannten, von einem höheren Kenntnisstand starten, ist das Niveau des Wissenszuwachses von Kennern und Nicht-Kennern in beiden Nachtests gleich hoch. Die Lindenhof-Nicht-Kenner reagieren in allen entscheidenden Punkten wie die Gesamtgruppe, die Kenner dagegen lassen kein Vergessen nachweisen, nicht in der Gruppe aller Kenner und nicht in den entsprechenden Gruppen der S-, SF- und F- Schüler. Besonders verwunderlich ist ein Fehlen von Treatmentunterschieden. Möglicherweise verfügen Lindenhof-Kenner über andere Strategien, sich das Museum zu erschließen, und werden darum von den Treatmentaufgaben weniger beeinflusst. 4. Unterrichtliche Konsequenzen der Untersuchung: a) Exkursionen zu einem Naturkundemuseum lohnen sich. Unabhängig von der Treatmentaufgabe führt der Unterrichtsbesuch zu dauerhaftem Lernerfolg und zu anhaltender positiver affektiver Gestimmtheit bezüglich dieses Besuchs. b) Je nach Absicht, sollte man für den Museumsbesuch ein passendes Treatment wählen: Soll es um planbaren Wissenserwerb gehen, einem Unterricht nach operationalisierbaren vorher festgelegten Anforderungen, so ist eine Mischform zwischen Selbstbestimmung und Fremdbestimmung zu empfehlen. Ein sehr deutlich gelenktes Vorgehen kann zu schlechten Behaltensleistungen führen. Ist die Vorbedingung der Planbarkeit verzichtbar, so kann selbstgesteuertes Lernen zu guten Ergebnissen führen und ist bedingt zu empfehlen. c) Die vorherige Bekanntheit des Museums bei Schülern sollte nicht von einem weiteren Besuch abhalten. Gerade in dieser Situation lernen Schüler besonders gut. Das Treatment spielt für diese Situation eine untergeordnete Rolle.
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Behavior and Ecology of Wild Slow Lorises (Nycticebus coucang): Social Organization, Infant Care System, and Diet
(2002)
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Frank Wiens
- In this thesis I describe the social organization, infant care system, and diet of the slow loris Nycticebus coucang, a nocturnal arboreal prosimian primate, in the Malaysian rainforest. Data collected are locational data obtained during 1,000 h of radio-tracking slow lorises, behavioral data from visually observing radio-collared individuals, morphometric data, and records on food remains from fecal analysis. Though close-range encounters were very rare, I observed slow lorises to form stable social units ('social groups') characterized by home range overlap and friendly interactions among members and nonoverlap between groups. Four groups were observed, each consisting of a single adult female, a single adult male and a varying number of younger individuals. Group composition, together with relatively small testis volume and natal dispersal occuring in both sexes, hints towards a monogamous mating system. In one case an extended family group formed by delayed dispersal of a primary pair's offspring. Friendly interactions among group members included allogrooming, following, alternate click-calls, and sleeping in contact. Yet, members did not engage in any co-operative behaviour of the types usually thought to be responsible for group formation in gregarious mammals. One important factor contributing to the sharing of space between slow lorises is probably that chances of successful dispersal are low. However, subtle benefits arising from the presence of conspecifics (allogrooming, transfer of information on food resources) may also be crucial for the formation or maintenance of slow loris spatial groups. The infant care system was also notable for the very low frequency of direct encounters between animals. Active maternal care seemed to be limited to carrying the young to the sleeping place and regular suckling, and grooming of the infant. Non-maternal infant care appeared to be restricted to occasional infant grooming and infant carrying. It has been suggested that young lorises depend on their mothers for information on diet and that they obtain this information by watching their mothers feeding or interacting directly with their mothers over food. I tested this hypothesis on a group including one infant and four older individuals. The infant of the focus group only took food items to the mouth which were also part of its social group's diet and showed concordance in the frequency of use of feeding sites with other members of its group. These results speak against diet learning by trial and error. They indicate that diet learning by infants probably does depend on information obtained from older conspecifics. However, the infant of the focus group was not involved in direct interactions with conspecifics over food and fed mostly alone. It was not within a distance where it could see older conspecifics feeding more often than expected from the configuration and utilization of the individuals` home ranges. When feeding in vicinity of other slow lorises the infant never looked at them. This suggests that, contrary to expectations, visual observation or direct interaction over food are not the mechanisms by which information on food resources is passed from older individuals to young, but that other ways of obtaining such information are used by immature wild slow lorises. The slow loris is a slow-moving animal known to have a very low basal metabolic rate relative to other eutherian species of its body mass. A slow pace of life has been causally linked to a low intake rate of usable energy due to a diet that (1) is generally low in energy, (2) is unpredictably periodically scarce, and (3) contains high amounts of toxins or digestion inhibitors. In order to assess whether the slow loris faces any of these three kinds of limitation in energy supply I studied its dietary habits by direct observations of feeding behavior and by fecal analysis. The diet was composed of five distinct types of food: floral nectar and nectar-producing parts, phloem sap, fruits, gums (another group of plant exudates), and arthropods. The largest proportion of feeding time was spent on phloem sap (34.9%), floral nectar and nectar-producing parts (31.7%), and fruits (22.5%). These food types should provide the slow lorises with high amounts of easily digestible sugars indicating that slow lorises did not face an energy-poor diet. Furthermore, I found no evidence for seasonal food shortages: dietary habits were indistinguishable between rainy- and dry seasons, even though most dry season data were collected during periods of extreme drought induced by the 1997-1998 El Nino Southern-Oscillation event. However, many genera of food plants are known to contain secondary compounds that are toxic or reduce digestibility. I suggest that low metabolism in slow lorises is at least partly related to the need to detoxify secondary compounds in high-energy plant diet.
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Measuring juvenile hormone and ecdysteroid titers in insect haemolymph simultaneously by LC-MS: The basis for determining the effectiveness of plant-derived alkaloids as insect growth regulators
(2004)
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Stephanie Westerlund
- Aim of this thesis was to develop a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method to monitor hormones and their metabolites in the haemolymph of insects simultaneously. Furthermore, some plant-derived alkaloids were structurally elucidated, which may be used as insect growth regulators thus affecting haemolymph hormone titers in putative pest species. Juvenile hormones (JHs), JH diols and ecdysteroids were easily separated by high performance-liquid chromatography (HPLC) in less than 20 min using a reversed-phase C18 column and a methanol-water gradient. Subjecting the JH-JHBP (juvenile hormone binding protein) complex to HPLC was sufficient in releasing JH from the JHBP. In order to prevent JH from binding to glass surfaces, it was necessary to include a carrier in the solvent. JHs have a high affinity to polypropylene vials and should therefore be avoided, if no carrier is being used, such as triton X-100. The darkening of the haemolymph due to eumelanin production by phenol oxidases served as a visual indicator of general enzyme activity in the haemolymph. Isooctane:MeOH (1:1, v/v) inactivated the phenol oxidase system when used at a solvent-haemolymph ratio of 10. An isooctane:MeOH extract of haemolymph was most efficient in keeping JH distributed evenly in solution and prevented JH from adhering to the glass vessel. JH concentration in standard solutions was reduced with increasing sonication time. Highest ionization of JH was achieved in MeOH for MS compared to ACN or by using formic acid as an additive. In the positive ESI (electrospray ionization) mode the most abundant ions formed in haemolymph extract of Gryllus bimaculatus was the sodium adduct for JHs, JH diols and JH acids. At higher JH concentrations, the potassium adduct was also observed. The sodium and the potassium adducts were present in ecdysteroid analysis. The same ionization pattern was observed in Spodoptera frugiperda, Myrmicaria eumenoides and Acyrthosiphon pisum haemolymph. Method validation of the LC-MS method confirmed reproducibility and repeatability. The LODs for JHs and JH diols were between 6 to 12 pg, and 93 pg for ecdysteroids. 72 haemolymph samples can be processed per day by the LC-ESI-MS method using an autosampler. JH and ecdysteroid titer measurements showed good agreement between haemolymph titers and developmental events in Spodoptera frugiperda and Gryllus bimaculatus larvae and Gryllus bimaculatus adults. In Gryllus bimaculatus female and male last instar larvae, the JH titers were low and steady until day 6. The ecdysone peak maximum shifted from day 3 to a 20-hydroxyecdysone maximum peak on day 5, coinciding with the onset of adult ecdysis. JH III titers increased on day 3 in paired Gryllus bimaculatus males, occurring simultaneously with spermatophore maturation and deposition. A similar response was seen with ecdysone titers. Mated female crickets experienced a JH III titer increase on day 4 which coincides with egg deposit on day 4. Ecdysone titers reach a maximum on day 3 and ovary weights on day 4. Besides JH III, JH I was found in 5 to 8-day old female adult crickets, and in 6 and 7-day old male adult crickets. 20-Hydroxyecdysone was found neither in female nor in male Gryllus bimaculatus mated adults. The “classical” interplay between JHs and ecdysteroids was observed in 5th instar Spodoptera frugiperda larvae. JH titers decreased towards the end of the larval stadium and 20-hydroxyecdysone gave a sharp peak on the last day of the 5th instar. Extremely low levels of JH were measured in 6th instar larvae. 20-Hydroxyecdysone and ecdysone titers increased simultaneously in prepupae. The already known alkaloids arborinine and arborine, and the for the first time isolated 4-methoxy-1-methyl-2(1H)-quinolinone from Glycosmis pentaphylla, were extracted from Glycosmis pentaphylla leaves and are discussed as possible insect growth regulators affecting hormone titers in the haemolymph of insect pest species.
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Fouragierstrategien, Ressourcennutzung und Mortalitätsrisiken von Blattlausparasitoiden: Der Einfluss von Habitatsdiversität und Wirtsvorkommen
(2004)
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Manuela Weinbrenner
- Die Wirtssuche und das Eiablageverhalten von Blattlausparasitoiden (Hymenoptera: Braconidae) auf höherer räumlicher Ebene zeigten sich durch verschiedene Bedingungen des Habitatausschnittes wesentlich beeinflusst. Wichtige Faktoren waren die Dichte und Verteilung der Wirte, die Konstellation des Fouragierraumes aus Wirts- und Nichtwirtspflanzen, der Mehltaubefall der Wirtspflanzen und die Predation durch Spinnen. Außerdem resultierten erhebliche Differenzen zwischen Primärparasitoiden mit unterschiedlicher Wirtsspezialisierung. Ein interspezifischer Vergleich lieferte große Parallelen zwischen den beiden Spezialisten Aphidius tanacetarius (monophag) und Aphidius absinthii (oligophag), während sich die Fouragierstrategien und der Reproduktionserfolg von Aphidius ervi (polyphag) deutlich von diesen abhob. Die Wirtsdichte hatte erheblichen Einfluss auf das Fouragierverhalten der Parasitoide: • Mit zunehmender Wirtsdichte resultierten höhere Aufenthaltszeiten der Parasitoidenweibchen in dem Pflanzenbestand. Dieses Muster zeichnete sich mit steigender Wirtsspezialisierung stärker ab. • Sowohl A. ervi als auch A. absinthii verwendeten auf wirtsbefallene Pflanzen relativ mehr Suchzeit als auf unbefallene, bei A. tanacetarius war dies nicht der Fall. • Der Eiablageerfolg nahm bei A. ervi mit wachsender Wirtsdichte zu, während A. tanacetarius und A. absinthii allgemein geringe Eiablageraten zeigten. • Generell wurden lokalisierte Blattlauskolonien nur zu einem geringen Anteil parasitiert, v. a. aufgrund des Abwehrverhaltens der Wirte. Die räumliche Verteilung der Wirte nahm großen Einfluss auf den Erfolg der Parasitoide: • Das aggregierte Auftreten von Blattlauskolonien erhöhte den Such- und Parasitierungserfolg von A. ervi signifikant gegenüber der uniformen Verteilung. Ursache kann die evolutive Adaption der Parasitoide an die natürliche Verteilungsform ihrer Wirte sein. Die Zusammensetzung des Bestandes aus Wirts- und Nichtwirtspflanzen wirkte sich wesentlich auf die Wirtssuche der Parasitoiden aus. In Abhängigkeit von der Wirtsspezialisierung folgten unterschiedliche Fouragierstrategien: • Die polyphage Art A. ervi reagierte in Gegenwart von Nichtwirtspflanzen mit einer kürzeren Aufenthaltszeit als in reinen Wirtspflanzenbeständen. Tendenziell war dies auch bei den Spezialisten A. tanacetarius und A. absinthii ausgebildet. Im interspezifischen Vergleich ergaben sich höhere Aufenthaltszeiten mit reduziertem Wirtsspektrum. • Während A. ervi auch Nichtwirtspflanzen zu einem relativ hohen Anteil anflog, konnten diese von den Spezialisten weitgehend gemieden werden, am extremsten von der monophagen Art A. tanacetarius. • Allerdings konnte A. ervi die Besuchszeit auf Nichtwirtspflanzen gering halten, signifikant kürzer als auf Wirtspflanzen. Diese Fähigkeit besaßen die spezialisierten Parasitoidenarten zusätzlich zu dem Meiden ungeeigneter Pflanzen. • Der Sucherfolg fiel bei A. tanacetarius und A. absinthii unabhängig von der Zusammensetzung des Pflanzenbestandes gering aus. Dagegen hatte A. ervi insgesamt eine sehr viel höhere Erfolgsquote und einen stark reduzierten Sucherfolg in Anwesenheit von Nichtwirtspflanzen ab. Die Vorerfahrung erzeugte bei A. ervi beträchtliche Modifikationen der Wirtssuche: • Die Vorerfahrung mit dem der Fouragiersituation entsprechenden Pflanze-Wirt-System führte bei A. ervi Weibchen zu intensiviertem Suchverhalten und infolgedessen zu einer Erfolgssteigerung in der Parasitierung verfügbarer Wirte. Der Befall von Wirtspflanzen mit Echtem Mehltau (Erysiphe trifolii; Mycobionta: Ascomycetes, Erysiphales) modifizierte stark das Suchverhalten von A. ervi: • Bei Mehltaubefall resultierten signifikant kürzere Aufenthaltszeiten der Parasitoide als in gesunden Pflanzenbeständen. • Die Intensität der Suche war in Anwesenheit von Mehltau reduziert, indem eine signifikant geringere Anzahl von Pflanzen abgesucht wurde. • Als direkter Effekt des Mehltaus auf die Parasitoiden zeigte sich die Verhaltenskomponente "Putzen" gegenüber der Suche auf gesunden Pflanzen signifikant erhöht, verursacht durch die Kontamination mit Pilzsporen. Eine nasse Blattlauskutikula beeinträchtigte die Wirtserkennung von A. ervi-Weibchen: • Die Eiablagerate von A. ervi war bei nassen A. pisum mangels Erkennung signifikant reduziert. • Die Reduktion der Eiablage in nasse Wirte nahm mit der Zeit kontinuierlich ab, so dass die gewaschenen A. pisum bereits eine Stunde nach der Behandlung wieder uneingeschränkt parasitiert wurden. • Das gleiche Phänomen trat bei gewaschenen toten Blattläusen auf. Das Mortalitätsrisiko durch Netzspinnen für Parasitoide: • Die Suche auf höherer räumlicher Ebene war für die Primärparasitoidenarten A. absinthii und A. ervi mit einem hohen Mortalitätsrisiko durch Netzspinnen verbunden, während die Hyperparasitoidenart Dendrocerus carpenteri (Hymenoptera: Megaspilidae) dieser Gefahr nicht unterlag.
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Isolation and characterization of the B-type allatostatin gene of Gryllus bimaculatus de Geer (Ensifera, Gryllidae)
(2004)
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Junling Wang
- 1. Cricket B type allatostatins, which belong to a neuropeptide family sharing the conserved W(X)6Wamide structure, exhibited inhibitory functions on the biosynthesis of juvenile hormones (JH) in vitro in the corpora allata (CA) as well as on ecdysteroid biosynthesis in the ovary of adult crickets (Gryllus bimaculatus). To understand the mechanisms of function of the pleiotropic cricket B type allatostatins, it is necessary to characterize their gene (preprohormone) and study the spatial and temporal expression patterns of the gene. 2. By PCR screening of a random primer cDNA library and by RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), a 535 bp 3´cDNA sequence of the cricket B type allatostatin gene was yielded. This 3´cDNA fragment encodes a putative translation product of 85 amino acids with potential dibasic endoproteolytic cleavage sites, which may allow processing into six peptides including three copies of Grybi-AS B1 (GWQDLNGGWGa) and single copies of Grybi-AS B2 (GWRDLNGGWGa), Grybi-AS B3 (AWRDLSGGWGa), and Grybi-AS B6 (AWNNLGSAWGa), respectively. Three of these deduced peptides were previously isolated from cricket brain extracts by conventional chromatographic techniques and were designated as Grybi-AS B1, Grybi-AS B2, and Grybi-AS B3. The Grybi-AS B6 neuropeptide represents a novel member of the B type allatostatins. 3. The nucleotide sequences encoding the type B allatostatins are high in GC-content and show strong homology. The highest GC-content was found for Grybi-AS B3 with 83.3%. The similarity of the nucleotide sequences encoding Grybi-AS B2 and Grybi-AS B1 is 93.3%, whereas Grybi-AS B2 and B3 share 90% nucleotide identity. 4. By Southern blot analyses, it was proven that the Grybi-AS type B gene is present as a single copy per haploid genome of G. bimaculatus. 5. By RT in situ PCR technique, it could be demonstrated that the Grybi-AS B gene is expressed in various tissues of 1 day old female adult crickets: In the central nervous system the Grybi-AS B gene expression was detected in the brain. In the protocerebrum, strong positive signals were found in the median neurosecretory cells, and to a lesser extent in lateral neurosecretory cells and in neurons. Gene expression was also found in the neurosecretory cells of the deuterocerebrum and the tritocerebrum. Furthermore, Grybi - AS B gene expression was localized in neurosecretory cells of the suboesophageal ganglion (SOG), the thoracic ganglia, and the abdominal ganglia. In the germarium and in primary oocytes of the ovary, Grybi-AS B gene expression was detected as condensed signals in the nuclei, but not in the prefollicular cells or the cytoplasm. With ongoing development of the oocytes, the signals in the nuclei (germinal vesicles) appeared as separated granules with weaker intensity, which finally disappeared, whereas in the follicular cells strong signals became apparent. Grybi-AS B gene expression was also detected in the epithelial cells of the accessory reproductive glands of female crickets. In the caecum and midgut, Grybi-AS B gene expression was found in endocrine secretory and epithelial cells, whereas in the hindgut, positive RT in situ PCR signals were detected in both longitudinal and circular muscles and in the gut epithelial cells. Grybi-AS B gene expression was also found in cells of the fat body and in thoracic (flight) muscles. 6. The results on Grybi-AS B gene expression as obtained by RT in situ PCR were confirmed by RT-PCR and RNA dot blot analyses. The expression of the Grybi-AS B gene in various tissues of adult females varied in an age-dependent manner. In brains of virgin females gene expression increased from the day of emergence until day 8 of adult life. In the ovary of virgin females gene expression showed a maximum at day 4 after ecdysis, whereas in mated females gene expression was high during the first two days and at days 6 to 7, but low inbetween. In caecum and midgut of virgin females gene expression was low during the first 5 days after ecdysis, but peaked at days 6 and 7, whereas in the hindgut gene expression was highest at day 3 of adult life. In the fat body, gene expression showed highest values on day 1 and days 6 to 7 after ecdysis. 7. Gene expression in brain, testes, and accessory reproductive glands of 0 to 3 days old male crickets was also demonstrated by RT-PCR and RNA dot blot analyses.
