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Entwicklung eines Sulfolobus-E. coli Shuttle-Vektors basierend auf dem Plasmid pRN1
(2007)
- Sulfolobus spp., ein Vertreter der thermoacidophilen Crenarchaeota, ist auf dem Weg sich als wichtiger archaealer Modellorganismus zu etablieren. Aufgrund seiner Wachstumsbedingungen von 75-80 °C bei pH 3-3,5 ist Sulfolobus biotechnologisch ebenfalls von hoher Bedeutung, da seine Enzyme thermostabil und, im Fall von sekretierten Enzymen, auch säurestabil sind. Bisher waren jedoch in vivo-Experimente in Sulfolobus nur schwierig durchzuführen, da trotz jahrelanger Bemühungen nur wenige genetische Systeme zur Verfügung standen, die außerdem Probleme hinsichtlich ihrer reproduzierbaren Anwendbarkeit aufwiesen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, einen kleinen, episomalen, einfach zu handhabenden Sulfolobus-Escherichia coli Shuttle-Vektor zu entwickeln. Zur Konstruktion eines Sulfolobus-E. coli Shuttle-Vektors wird ein E. coli-Replikon mit selektivem Marker, ein Sulfolobus-Replikon und ein selektiver Marker für Sulfolobus benötigt. Zu Beginn der Arbeiten unklar war, welcher Faktor entscheidend für die Etablierung verlässlicher Vektoren sein würde. Daher wurden, ausgehend von einer breiten, gut charakterisierten Auswahl verschiedener Shuttle-Konstrukte, möglicher selektiver Marker und potentieller Rezipientenstämme, optimale Kombinationen identifiziert. Als Sulfolobus-Replikon wurde das kryptische Plasmid pRN1 aus Sulfolobus islandicus REN1H1 gewählt, da es eine geringe Größe von 5,4 kb und eine geeignete Kopienzahl von 2-23 Plasmiden pro Zelle aufweist, sowie das am besten untersuchte crenarchaeale Plasmid ist. Auf dem Plasmid befinden sich drei konservierte offene Leseraster, die für das multifunktionelle Replikationsprotein Orf904 und die zwei sequenzspezifisch DNA-bindenden Proteine Orf56 und Orf80 codieren. Über den Replikationsmechanismus oder den Replikationsursprung des Plasmides ist jedoch nichts bekannt. Um die Funktionsweise des Plasmides pRN1 besser zu verstehen, wurde die Transkription des Plasmides untersucht. Dadurch sollten auch Hinweise auf essentielle Regionen bzw. mögliche Unterbrechungsstellen zur Shuttle-Vektorkonstruktion gewonnen werden. Es wurden fünf Transkripte im Bereich der offenen Leseraster kartiert. Erste Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen zur Kopienzahlkontrolle von pRN1 wurden durch die quantitative Bestimmung des Verlaufs der Transkriptanzahlen pro Zelle während verschiedener Wachstumsphasen und die Untersuchung der Stabilität der Transkripte gewonnen. In in vivo-Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Protein Orf56 als Transkriptionsrepressor wirkt und somit die Transkription des Replikationsoperons reguliert. Das Replikationsoperon orf56/orf904 wurde als essentiell zur Shuttle-Vektorkonstruktion eingestuft. Um möglichst viele gleichmäßig über den restlichen Teil des Plasmides verteilte Unterbrechungsstellen zur Vektorkonstruktion zu erhalten, wurde eine Transposon-basierte Bibliothek erstellt, aus der 13 Konstrukte ausgewählt wurden. Eine effiziente Selektion wurde durch die Verwendung uracilauxotropher, pyrEF-defizienter Mutanten erreicht. Daher wurden uracilauxotrophe Mutanten als potentielle Rezipientenstämme isoliert und phänotypisch, genotypisch und hinsichtlich ihrer Reversionsfrequenzen untersucht. Die funktionsfähigen pyrEF-Gene aus Sulfolobus solfataricus P2, codierend für Enzyme des Uridinmonophosphat-Syntheseweges, wurden als selektiver Marker zur Uracil-Selektion in die 13 verschiedenen pRN1-Unterbrechungskonstrukte integriert. Die verschiedenen potentiellen Shuttle-Vektorkonstrukte wurden in die sechs zur Verfügung stehenden uracilauxotrophen Rezipienten transformiert. 11 der 13 Vektorkonstrukte replizierten stabil in der Sulfolobus acidocaldarius pyrE-Deletionsmutante MR31 unter Uracil-Selektion. Die Vektoren zeigten Kopienzahlen von 2-8 Plasmiden pro Zelle in Sulfolobus, rekombinierten nicht und integrierten auch nicht in das Wirtschromosom. Sie waren in E. coli stabil und erlaubten eine einfache Klonierung zusätzlicher DNA-Sequenzen. Mit Hilfe der verschiedenen Unterbrechungskonstrukte und weiterer Deletionskonstrukte konnten erste Informationen zur Funktion des konservierten Leserasters orf80 erhalten und das minimale Replikon von pRN1 eingegrenzt werden. Außerdem wurde die Eignung der Shuttle-Konstrukte für Reportergenexperimente und zur Expression von Proteinen in Sulfolobus demonstriert. Weiterhin konnte mittels Lactose-Selektion das Wirtsspektrum der Shuttle-Konstrukte auf S. solfataricus ausgedehnt werden. Als Schlüsselfaktor zur erfolgreichen Etablierung der Shuttle-Vektoren konnte hoher Selektionsdruck, der nur mittels Deletionsmutanten erreicht werden kann, identifiziert werden. Die Identifizierung dieses kritischen Faktors wird die Entwicklung weiterer genetischer Systeme für Sulfolobus erleichtern.
