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Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA
(2002)
- In dieser Arbeit wurden drei virale Regulator-Proteine (CAEV-Tat, HK022 Nun und l N (1-53)) und mehrere ihrer nicht-viralen Bindungspartner kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. CAEV-Tat (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus) ist ein Transaktivatorprotein aus einem HIV-verwandten Lentivirus der Ziege. Zur effizienten Expression von CAEV-Tat war es notwendig, einige seltene Codons des tat-Gens gegen die jeweils synonymen, aber in E. coli häufiger verwendeten Codons auszutauschen. Ferner mußte eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (argU) koexprimiert werden, um die für NMR-Spektroskopie nötigen Proteinmengen herstellen zu können. Expression und Reinigung von CAEV-Tat mittels Standardverfahren wie Metallionenaffinitätschromatographie über einen Histidinanhang oder die Expression und Reinigung als GST-Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Daher mußte ein individuell auf CAEV-Tat zugeschnittenes Reinigungsprotokoll etabliert werden. Aufgrund seines hohen pIs von 11 konnte CAEV-Tat über Kationenaustauscher-Chromatographie an CM-Sepharose und anschließende Hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Ausbeuten an Protein ließ sich durch Verwenden von Heparin-Sepharose als Kationenaustauscher-Material noch weiter steigern. CAEV-Tat zeigte in CD- und NMR-Spektren typische Charakteristika eines a-helikalen Proteins. Da CAEV-Tat in Konzentrationen über 400 µM aggregierte und daher nicht für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen, die höher Konzentrationen voraussetzen, geeignet war, wurde eine cysteinfreie Mutante von CAEV-Tat kloniert und nach dem für das Wildtyp-Protein etablierten Protokoll gereinigt. Die Mutante erwies sich als weitaus NMR-tauglicher und zeigte keinerlei Aggregationstendenzen bei Konzentrationen von 1 mM. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß Wildtyp-Protein und cysteinfreie Mutante strukturell identisch sind. Somit steht mit der cysteinfreien Mutante ein für weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignetes Konstrukt zur Verfügung. Für das CAEV-Tat homologe Maedi-Visna-Virus-Tat-Protein war eine Interaktion mit der basischen und der Leucin-Zipper-Domäne der beiden zellulären Transkriptionsfaktoren Jun und Fos postuliert worden (Morse et al., 1999). Für spätere Vergleichsstudien mit CAEV-Tat und Jun / Fos zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit der Beschaffung der entsprechenden Nukleotidsequenzen und der Generierung expressionsfähiger Klone von c-jun, c-fos sowie und fosbZIP bereits wichtige Voraussetzungen für spätere Bindungsstudien mit NMR-Spektroskopie geschaffen. JunbZIP (222-331) konnte bereits erfolgreich als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose gereinigt werden. Nun aus dem lambdoiden Phagen HK022 fungiert bei einer Superinfektion des Wirts mit dem l-Phagen als Terminator der viralen Genexpression. Um spätere Strukturuntersuchungen an diesem System durchführen zu können, mußte zunächst ein auf die E. coli codon usage optimiertes synthetisches Gen für Nun generiert werden. Hierbei erwies sich die Methode nach Kim (1989) als erfolgreich. HK022 konnte mit Ausbeuten von 70 mg/l Kulturmedium über Kationenaustauscher-Chromatographie mit Heparin-Sepharose gereinigt werden. Erste strukturelle Befunde (CD, HSQC-Spektren, Messung des hydrodynamischen Radius) deuten darauf hin, daß es sich bei Nun um ein Protein mit nur gering ausgeprägter Tertiärstruktur handelt. Ein Fragment (1-53) des Antiterminator-Protein N aus dem Phagen l konnte kloniert und als Fusionsprotein mit Ubiquitin exprimiert werden. Die Reinigung erfolgte über Affinitätschromatographie und einen abschließenden RP-HPLC-Schritt nach der Abspaltung des Ubiquitinanteils. l N-Protein liegt in Lösung unstrukturiert vor. Dieser Befund wurde auch für das N(1-53)-Peptid durch CD-Spektroskopie und die Bestimmung des hydrodynamischen Radius erhalten. Bei der Bindung von 15N-N(1-53) an nutboxB-RNA bildet sich ein Komplex, der höchstwahrscheinlich weitgehend die gleiche Struktur wie der Komplex aus N(1-36) und nutboxB-RNA besitzt. Bei Zugabe des Wirtsfaktors NusA aus E. coli zu diesem binären Komplex kommt es auf Seiten von l N (1-53) zu Veränderungen im HSQC-Spektrum, was auf eine spezifische Interaktion zwischen dem längeren l-Peptid und NusA hindeutet. Hiervon sind vor allem die nicht im Komplex mit nutboxB vorliegenden Reste von l N betroffen. Weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen werden klären, inwieweit die nutboxB-RNA an der Interaktion mit NusA beteiligt ist. Mit der Etablierung eines Reinigungsprotokolls für N(1-53) und für E. coli NusA konnten wichtige Voraussetzungen hierfür bereits erfüllt werden.
