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Die Bedeutung von endogenem und künstlichem Auxin für die Kultivierung photoautotropher Zellen von Chenopodium rubrum
(2005)
- Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der Bedeutung von endogenem (IES) und künstlichem Auxin (2,4-D) für das Wachstum der photoautotrophen Chenopodium rubrum-Zellkultur. Das Cytokininspektrum dieser Zellen und die Ethylenproduktion einer Suspensions-Batchkultur war bereits über den ganzen Verlauf von ca. 100 Tagen eingehend untersucht worden, über die endogenen Auxinverhältnisse lagen jedoch keine Daten vor. Die Quantifizierung der IES-Konzentration erfolgte dann mit Hilfe des ELISA nach Weiler (1986). Mit der optimierten Methode wurde der Auxingehalt während der gesamten Kulturperiode gemessen. Zu Beginn der Kultur (4.Tag) durchläuft die endogene Konzentration an IES einen kurzzeitigen, aber besonders ausgeprägten Peak, wobei die Konzentration bereits in der Teilungsphase wieder auf einen niedrigen Wert abfällt. In der stationären Phase nimmt die Auxinkonzentration vorübergehend, aber längst nicht so stark wie am Anfang, zu, fällt zum Beginn der Seneszenz wieder ab, und steigt dann in der Schlussphase erneut deutlich an. Der endogene Auxingehalt steht aber auch unter dem Einfluss von exogen angebotenen 2,4-D (Dichlorphenoxyessigsäure). Um einen Beitrag zum Verständnis der Auxinwirkung auf molekularer Ebene zu leisten, wurde zunächst die Aufnahme von exogenem Auxin in die Zellen untersucht. Die Zellen nehmen Auxin sehr schnell und (fast) vollständig aus dem Medium auf. Nun konnte mit Hilfe des Differential Display-Verfahrens gezielt nach Genen gesucht werden, die durch IES induziert werden. Mit diesem Verfahren wurden 3 Genfragmente aufgefunden, deren Expression durch IES induziert wurde. Durch Screenen von cDNA-Banken von Chenopodium rubrum wurden die zugehörigen Gene gefunden: 18R10 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen), A1.1 und Alt6m4 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen nach 2stündiger IES-Behandlung). Das Gen A1.1 wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Es handelt sich um ein Gencluster, das zwei Proteine codiert - das ribosomale Protein S2 (RPS2) und die Untereinheit IV der ATPase. Im Northern-Blot-Verfahren wurde eine mRNA aus Chenopodium rubrum-Kulturzellen detektiert, die mit der die ATPase-Untereinheit codierenden cDNA aus A1.1 hybridisierte. Da diese mRNA durch die Bindung an eine Oligo-dT-Säule isoliert wurde, muß sie einen Poly-A-Schwanz besitzen und somit aus der Transkription des Kerngenoms stammen, da plastidische mRNA keinen Poly-A-Schwanz aufweist. Ein die ATPase-Untereinheit-codierendes Gen sollte daher auch im Kern der Chenopodium rubrum-Zellen vorkommen, das grosse Ähnlichkeit mit dem entsprechenden cDNA-Bereich des plastomischen A1.1 hat. Die Bildung dieser mRNA wurde duch IES-Behandlung induziert. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass nicht nur die Chloroplasten, sondern auch der Kern der Chenopodium rubrum-Zellen ein ATPase-Untereinheit-codierendes Gen besitzt, dessen Expression durch Auxin induziert werden kann. Das Gen 18R10 codiert eine Lipase mit dem für Phospholipasen typischen GDSL-Motiv. Die Sequenz ist 368 Aminosäuren lang. Eine Hydrophobizitätsindex-Analyse mit Hilfe des TMHMM-Programms ergab, dass die GDSL-Lipase von Chenopodium rubrum ein transmembranes Protein ist. Dabei befindet sich der N-Terminus (12 Aminosäuren) im Zellinneren und ist über einen transmembranen Anker von 19 Aminosäuren an die Zellmembran gebunden. Der größte Teil des Proteins ist extrazellulär (Aminosäuren 32-368), darunter auch das aktive Zentrum. Interessanterweise wurde die Expression dieser Lipase durch IES induziert, aber durch Cytokinin gehemmt. Ein Antagonismus beider Phytohormone wurde auf Genexpressionsebene bisher noch für kein anderes Gen beschrieben. Das Gen Alt6m4 wird nicht in Zellen der Teilungsphase (7 Tage), sondern nur in Zellen der stationären Phase (35 Tage) exprimiert und seine Expression wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Die Sequenz ist 2692 bp lang, mit einem offenen Leseraster zwischen den Basenpaaren 59-2362. Das entsprechende Protein ist eine ß-Xylo-Glucosidase, die zur Glycosyl-Hydrolase-Familie 3 gehört und 767 Aminosäuren enthält. Um die zellphysiologische Bedeutung dieses Gens zu ermitteln, wurde eine knock-down-transformante (RNAi) Zelllinie hergestellt. Dafür musste ein Transformations- und Selektionssystem für die Chenopodium rubrum-Suspensionskultur entwickelt werden. Die stabile Transformation gelang schließlich durch Partikelbeschuss und Selektion mit Kanamycin. Die Transformante konnte über eine Kalluskultur wieder als Suspensionskultur etabliert werden. Sie wächst erheblich schlechter als der „Wildtyp“ und auch als die Null-Transformante und altert schneller. Die Teilungsfähigkeit dieser Zellen geht schon am 50.Tag der Kultur verloren. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit dem Befund, dass das Gen im „Wildtyp“ in der stationären Phase (Tag 30 – 60) am stärksten exprimiert wird.
