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Funktionale Analyse des ATPase- und des Zn2+-Bindungs-Motivs der Bacillus subtilis Protease FtsH und deren Einfluss auf die Sporulation
(2004)
- Die membrangebundene, ATP- und Zn2+- abhängige Metalloprotease FtsH ist in E. coli bereits gut untersucht. Es handelt sich um ein multifunktionales Protein mit ATPase- und Protease-Aktivität. Dort wurden eine Vielzahl von E. coli ftsH-Mutanten mit pleiotropen Phänotyp charakterisiert und die Auswirkung von gezielten Mutationen in vivo und in vitro analysiert (Akiyama et al., 1994; Akiyama et al., 1996). Über FtsH aus B. subtilis ist hingegen noch wenig bekannt. Bisher wurden erst die Phänotypen einer ftsH-Nullmutante und einer Insertionsmutante beschrieben, die zu einem pleiotropen Phänotyp führen. Die Rolle bestimmter Bereiche oder Aminosäuren von FtsH wurden hier nicht untersucht (Deuerling et al., 1995; Deuerling et al., 1997; Lysenko et al., 1997). In ihrer Diplomarbeit konstruierte Eva Harfst 1999 vier B. subtilis ftsH-Allele, indem sie gezielt Aminosäuren in der Walker-A-Box und im Zinkbindungsmotiv austauschte, wie sie bereits für E. coli und Hefe FtsH beschrieben wurden. Diese mutierten ftsH-Gene und ein wildtypisches zur Kontrolle brachte sie in den pX-Vector ein, wodurch sie unter die Kotrolle eines Xylose-induzierbaren Promotors gestellt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die mutierten ftsH-Allele in das B. subtilis-Chromosom integriert und in einem zweiten Schritt das wildtypische ftsH deletiert. Die Phänotypen der so erzeugten Mutanten (sowohl die aus dem ersten Schritt, die noch das wildtypische ftsH tragen, als auch die aus dem zweiten Schritt, die nur noch das mutierte Allel tragen) wurden hinsichtlich des filamentösen Wachstums, der Sporulation, der Sensitivität gegenüber Hitzeschock und hyperosmotischen Bedingungen analysiert. Dabei stellte sich heraus, das die mutierten Allele keinen Einfluss auf den Phänotyp der Stämme haben, die das wildtypische ftsH noch tragen, und in den Knockout-Stämmen das wildtypische ftsH nicht ersetzen können, also den Phänotyp einer ftsH- Nullmutante zeigen. Des weiteren sind die mutierten ftsH-Allele ebenfalls nicht in der Lage, die Defizienz in der Subtilisin-Sekretion zu kompensieren. ATPase-Tests zeigten, dass die eine Mutation im Walker-A-Motiv die ATPase-Aktivität der beiden betroffenen Proteine ausschaltete. Protease-Tests ergaben, dass keines der mutierten FtsH-Proteine noch eine Protease-Aktivität aufweist. Das bedeutet, dass einerseits die Basenaustausche im Zinkbindungsmotiv die Protease-Aktivität ausschalten, andererseits aber auch keine Protease-Aktivität ohne ATPase- Aktivität möglich ist. Daraus folgt weiterhin, dass die ATPase-Aktivität des FtsH-Proteins allein nicht ausreicht, um einen der untersuchten pleiotropen Phänotypen einer ftsH--Mutante zu kompensieren. Die Funktionalität sowohl der ATPase- als auch der Protease-Domäne ist also für FtsH und somit für B. subtilis hinsichtlich des filamentösen Wachstums, der Sporulation, der Sensitivität gegenüber Hitzeschock und hyperosmotischen Bedingungen essentiell. Anhand von Northern-Blot-Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass FtsH eine essentielle Rolle bei der Phosphorylierung von Spo0A haben muss, da ohne FtsH kein aktives Spo0A gebildet wird. Die daraus resultierende Sporulationsdefizienz kann aber durch eine Spo0A-Mutante, die ohne Phosphorylierung aktiv ist, fast vollständig kompensiert werden. FtsH ist also während der Sporulation nur für die Phosphorylierung von Spo0A essentiell.
