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Charakterisierung des Replikationsenzyms ORF904 aus Sulfolobus islandicus
(2010)
- ORF904 ist ein multifunktionelles Enzym, welches durch das kryptische Plasmid pRN1 codiert wird. Das Protein besitzt eine C-terminale Primase/Polymerasedomäne und eine N-terminale ATPase/Helikasedomäne. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die molekulare Funktion der N-terminalen Domäne genauer untersucht. Sequenzanalysen der Helikasedomäne ermöglichten ORF904 als eine Superfamilie-3-Helikase zu klassifizieren und für die ATPase- und Translokationsaktivität relevante Sequenzmotive zu identifizieren. Darüber hinaus konnte zusätzlich eine Winged-Helix-DNA-Bindedomäne am C-Terminus der Helikasedomäne identifiziert werden. An Hand von CD-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Deletionsmutanten von ORF904 strukturiert vorlagen. Die thermische Denaturierung der Mutanten unterstreicht den thermophilen Charakter des Proteins (TM= 85-100°C). Der endgültige Nachweis der Hexamerisierung des Proteins in Gegenwart von dsDNA und AMP-PnP wurde mit der Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie erbracht. Es war bereits bekannt, dass die ATPase-Aktivität von ORF904 durch RNA gar nicht und durch ssDNA nur schwach stimuliert wird. Eine spezifische Zunahme der ATPase-Aktivität in Gegenwart von pRN1 konnte nicht beobachtet werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass dsDNA die ATPase-Aktivität um den Faktor 7 erhöht. Eine Bevorzugung der längeren Plasmid-DNA unter limitierenden Bedingungen konnte nicht beobachtet werden, weswegen von einer geringen Prozessivität der Helikase auszugehen ist. Die Wechselzahl und der KM für ATP konnten zu 0,7/s und 0,4 mM bestimmt werden. Die ATPase-Aktivität der Deletionsmutanten von ORF904 gaben Hinweise auf die Wichtigkeit der Region direkt N-terminal vor dem Helikasekernbereich. Es wird angenommen, dass diese Region für die Hexamerisierung des Proteins von Bedeutung ist. Die Analyse der Punktmutanten von ORF904 in den konservierten Bereichen erlaubten es R690 als den Argininfinger zu identifiziert. Der potentielle Lysinfinger K574 konnte nicht als solcher identifiziert werden. Wie zu erwarten war, zeigten die Mutanten des beta-Hairpins eine vernachlässigbare Abnahme in Gegenwart von dsDNA. Translokationsexperimente mit einem Biotin-Streptavidin-Verdrängungsversuch ermöglichten es, für die Helikase eine durch ATP induzierbare Translokation mit 3-5-Polarität auf ssDNA nachzuweisen. Dabei konnte K657 als das Lysin im beta-Hairpin identifiziert werden, welches vermutlich den direkten Kontakt zur DNA herstellt. Die Translokationsrate von ORF904 wurde zu etwa 6,2x10^-4 b/s bestimmt. Zusammen mit den Ergebnissen der Prozessivität ist anzunehmen, dass es sich bei OF904 nicht um eine prozessive Helikase handelt. Vielmehr scheint ORF904 am Aufschmelzen des Replikationsursprungs beteiligt zu sein. In der Vergangenheit konnte keine Entwindung von komplett doppelsträngigen Helikasesubstraten oder Substraten mit 5- oder 3-Überhang auf der Basis von M13-DNA oder Oligodesoxynukleotiden gezeigt werden. Es konnte jedoch eine ATP-abhängige Entwindung für ein kurzes DNA-Substrat mit 3- und 5-Überhang, ein Doppelstrangsubstrat mit internem 5-Überhang, eine Holliday-Struktur sowie eine Triple-Helix gezeigt werden. Mittels der letzten drei Substrate wurde auch die Translokation auf dsDNA nachgewiesen. Die Entwindungsraten für die Helikase liegen abhängig vom Substrat zwischen 1,0 und 7,2x10^-4 bp/s. Die Ergebnisse der Entwindungsexperimente untermauern nochmals die Ergebnisse der Translokationsexperimente. DNA-Bindungsexperimente auf der Basis von Fluoreszenzanisotropiemessungen bestätigten die DNA-Bindung der carboxyterminalen DNA-Bindedomäne und der Helikasedomäne, die in Gegenwart von ATP zunahm. Darüber hinaus scheint es, dass die Prim/Pol-Domäne in der Lage ist, die Helikasedomäne in Gegenwart von ATP und Abwesenheit des GTG-Bindemotivs zu maskieren, um so unter Umständen eine unspezifische DNA-Bindung zu erschweren. In Gegenwart des GTG-Bindemotivs bindet die Prim/Pol-Domäne ssDNA sowie dsDNA stärker. Dieser Effekt wird für ssDNA durch ATP weiter verstärkt. Möglicherweise unterstützt die Prim/Pol-Domäne die DNA-Bindung der Helikase bei Vorliegen des GTG-Bindemotivs im Bereich des Replikationsursprungs. Um den Replikationsursprung zu bestimmen, wurden mit einem für die Replikation essentiellen Sequenzabschnitt stromabwärts von orf904 Footprint-Analysen durchgeführt. Diese erlaubten es, Nukleotide in einer Region 60 bis 90 Nukleotide stromabwärts von orf904 zu identifizieren, die durch die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne scheinbar geschützt werden. Interessanterweise befindet sich in diesem Bereich auch ein GTG-Motiv, das als Erkennungssequenz für die Prim/Pol-Domäne dienen könnte, um die Bindung des Proteins an den vermeintlichen Replikationsursprung zu verstärken. Im Ganzen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne zusammen mit der Helikasedomäne den Replikationsursprung während der Replikationsinitiation erkennt.
