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- DNA-Bindung (1) (remove)
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Strukturbiologische Untersuchungen und Faltungsstudien von Modellproteinen mittels NMR-Spektroskopie
(2004)
- Die biologische Funktion von Proteinen basiert in den meisten Fällen auf einer definierten dreidimensionalen Struktur, die sich im Verlauf der Proteinfaltung ausbildet. In dieser Arbeit wurden die Modellproteine CspB aus B. subtilis, RNase T1 aus A. oryzae, ORF56 aus S. islandicus sowie des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d mit einer Reihe biophysikalischer Methoden ausführlich charakterisiert. Die schnelle interne Dynamik von CspB wurde bei verschiedenen Lösungsmittelviskositäten untersucht, wobei durch eine erweiterte Lipari-Szabo-Analyse der 15N-Relaxationsparameter die Rotationskorrelationszeit iterativ optimiert. Diese stellt einen empfindlichen Sensor gegenüber der unmittelbaren Umgebung des Proteins innerhalb der Hydratationshülle dar, wobei die Geschwindigkeit der Gesamtbewegung nicht von der Größe des Proteins inklusive seiner Hydratationshülle sondern vielmehr von deren Mikroviskosität abhängt. Die Dynamik im ps- bis ns-Bereich bleibt bei steigender Viskosität nahezu unverändert. Der Beitrag des chemischen Austauschs (Rex) zur transversalen Relaxationsrate ist über das gesamte Protein verteilt und korreliert nicht mit Sekundärstrukturelementen oder flexiblen Schleifen. Rex repräsentiert daher nicht die lokale Dynamik einzelner Reste sondern ist auf die globale Faltungsreaktion von CspB im Millisekundenbereich zurückzuführen. Durch die Erhöhung der Viskosität wird die Größe und Anzahl der Rex-Beiträge signifikant reduziert. Die Kooperativität der Millisekundenfaltung von CspB wurde anhand dynamischer NMR-Methoden untersucht, wobei die Bestimmung der Faltungsraten mit R2-Dispersionsmessungen die verlässlichsten Ergebnisse lieferte. Die 24 analysierten ortsspezifischen Sonden zeigen sehr ähnliche apparente Faltungsraten und stimmen gut mit stopped flow Fluoreszenz detektierten Faltungsraten überein. Die Faltung verläuft kooperativ und über einen wenig heterogenen Übergangszustand. Die Wechselwirkung von CspB mit einzelsträngiger DNA wurde auf struktureller Ebene charakterisiert. Die aus Sequenzvergleichen postulierte potentielle Bindungsregion von CspB wurde mittels NMR-Titrationsexperimenten verifiziert. Dabei konnten zusätzliche Aminosäuren außerhalb der Bindungsmotive identifiziert werden, die für die Interaktion sehr wichtig sind. Die Beiträge einzelner Reste zur Bindungsaffinität wurden anhand einer Mutationsanalyse bestimmt, wobei die Lösungsmittel-exponierten Phenylalanine essentiell für eine feste Bindung sind. Aus der Strukturbestimmung von CspB im Komplex mit dem ssDNA-Fragment dT7 folgte, dass das Proteinrückgrat nahezu unverändert vorliegt und die Hauptunterschiede in der relativen Orientierung der aromatischen Seitenketten liegen. Die Modellierung der Struktur des Komplexes mit HADDOCK weist auf die vermuteten Stapel-Wechselwirkungen der aromatischen Seitenketten mit den Basen der ssDNA hin. Die Bindung der Nukleinsäure stabilisiert CspB. Das homodimere Protein ORF56 aus dem acidohyperthermophilen Archaeon Sulfolobus islandicus wurde mit einer Fülle von biophysikalischen Methoden studiert und dessen dreidimensionale Struktur mittels NMR bestimmt. Diese ähnelt der des Arc-Repressor sehr. Die Faltung von ORF56 kann sowohl im Gleichgewicht als auch in der Faltungskinetik mit dem Zweizustandsmodell für dimere Proteine beschrieben werden. Das Protein besitzt eine außerordentlich hohe Stabilität, was in dem extrapolierten Schmelzpunkt der thermischen Entfaltung von 107 °C zum Ausdruck kommt. Diese extreme Stabilität wird von der schnellen simultanen Assoziations-/Faltungsreaktion aber vor allem durch die besonders langsame Entfaltungsreaktion (5.7 pro Jahr) bestimmt. Die Entwicklung höherdimensionaler Echtzeit NMR-Techniken zum Studium langsamer Faltungsreaktionen wurde mit S54G/P55N RNase T1 durchgeführt. Die geschwindigkeitsbestimmende trans/cis Isomerisierung der Y38-P39 Peptidbindung synchronisiert die kooperative Rückfaltung des Faltungsintermediats, was anhand einer Vielzahl von ortsspezifischen Sonden gezeigt wurde. Die Aufnahme von 3D Echtzeit NOESY-HSQC-Spektren ermöglichte die Zuordnung des Proteinrückgrats des Faltungsintermediats und die Identifizierung von NOE-Kreuzsignalen, die die Basis für eine zukünftige Strukturbestimmung des transienten Zustands bilden. Die Faltung des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d, der weder Trp noch Tyr enthält, wurde mit Circulardichroismus und Phenylalanin-Fluoreszenz beobachtet. Mittels dieser optischen Sonden wurde im Gleichgewicht ein apparentes Zweizustandsmodell gefunden. Allerdings wurde in einem NMR-detektierten Entfaltungsübergang ein dritter Zustand bei mittleren Harnstoffkonzentrationen detektiert. Unter stark nativen Bedingungen konnten drei Rückfaltungsphasen aufgelöst werden. Die langsamste Phase kann mit PPIasen signifikant beschleunigt werden, was auf eine Prolyl-cis/trans-Isomerisierung hindeutet, die mittels 1D Echtzeit NMR-Spektroskopie verfolgt werden konnte.
