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Auswirkungen der RNA-Interferenz auf allatoregulierende Neuropeptide und Lokalisation der B-Typ Allatostatine bei Spodoptera frugiperda
(2009)
- Zusammenfassung Bei Insekten regulieren Peptidhormone (Neuropeptide) viele physiologische und entwicklungsrelevante Prozesse, wie Wachstum, Häutung, Metamorphose, Reproduktion, Diapause, Fressverhalten und den Metabolismus. Allatoregulierende Neuropeptide hemmen (Allatostatine, AS) oder fördern (Allatotropine, AT) die Juvenilhormonbiosynthese in den Corpora allata, können aber auch andere Funktionen aufweisen, wie z.B. eine myoregulatorische Aktivität. In dieser Arbeit wurde zunächst die Lokalisation der B-Typ Allatostatine [W(X)6W-amide] aus Spodoptera frugiperda immunologisch untersucht. In Gehirnen adulter, 2 Tage alter Weibchen trat eine deutliche Immunfärbung in medianen neurosekretorischen Zellen des Protocerebrums, im oberen Bereich des Zentralkörpers und in den Antennalloben (Glomeruli) auf. In den Thorakal- und Abdominalganglien von Larven des letzten Larvenstadiums wurde eine intensive Färbung im Bereich des Neuropils und eine schwächere Immunreaktion im Bereich der lateral gelegenen neurosekretorischen Zellen beobachtet. Starke Färbung war auch in den Malpighischen Gefäßen sichtbar, die wahrscheinlich der apikalen Membran zwischen den Hauptzellen zuzuordnen ist, sowie im Mitteldarm und in larvalen Hoden. Anschließend wurden die physiologischen Funktionen der bereits charakterisierten allatoregulierenden Neuropeptide AT 2 und AS-C-Typ aus S. frugiperda nach einer Hemmung der Genexpression mittels der RNA-Interferenz Methode untersucht. Es wurden Expressionsstudien durchgeführt, um die Wirksamkeit und die Spezifität der RNA-Interferenz in verschiedenen Geweben zu überprüfen. Zudem wurden die Auswirkungen der RNA-Interferenz auf verschiedene physiologische Parameter untersucht. Dabei lag der Schwerpunkt der Experimente auf der Regulierung der Juvenilhormonbiosynthese, der Reproduktion, der Verpaarung und der Metamorphose. Nach Injektion und auch nach Fütterung von AS-C- bzw. AT 2-doppelsträngiger RNA (dsRNA) war die Expression der mRNA im Gehirn und Darm von Larven reduziert. Zudem führte die Injektion von AS-C- bzw. AT 2-dsRNA auch bei adulten Weibchen und Männchen unterschiedlicher Altersstufen zu einer Reduktion der Expression im Gehirn. Die Reduktion der Transkription bei Larven ging mit einem erhöhten Juvenilhormon(JH)-Titer in der Hämolymphe der Tiere einher. Dies lässt eine allatostate Aktivität der beiden Peptide zu diesem Zeitpunkt vermuten. Die Folge des erhöhten JH-Titers war eine Verlängerung des letzten Larvenstadiums. Bei adulten Weibchen war der Effekt der Injektion von AS-C- bzw. AT 2-dsRNA auf den JH-Titer vom Alter der Tiere abhängig und variierte innerhalb der JH-Homologen (JH I bis JH III). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass beide Peptide bei adulten Weibchen unterschiedliche Wirkungen auf unterschiedliche JH-Homologe in spezifischen Stadien der Entwicklung haben. Adulte Männchen hatten nach einer Injektion von AS-C- bzw. AT 2-dsRNA an bestimmten Tagen einen erhöhten JH-Titer. Bei der Verpaarung werden mit der Spermatophore verschiedene Substanzen, darunter auch JH, vom Männchen auf das Weibchen übertragen. Bei mit Ringer injizierten Männchen konnte vor der Verpaarung JH in den akzessorischen Drüsen (AD) detektiert werden. Nach der Verpaarung nahm der JH-Titer in den männlichen AD stark ab. Bei unverpaarten Weibchen war kein JH in der Bursa copulatrix nachweisbar. Wurden die Weibchen jedoch verpaart, konnten große Mengen JH in der Bursa copulatrix gefunden werden. Mit AS-C-dsRNA injizierte Männchen zeigten vor der Verpaarung einen erhöhten JH-Titer in ihren AD, der nach der Verpaarung wieder niedriger war. Die mit diesen Männchen verpaarten Weibchen hatten einen erhöhten JH-Titer in der Bursa copulatrix im Vergleich zu mit Ringer injizierten verpaarten Weibchen. Die Ergebnisse lassen auf eine allatostate Wirkung der AS-C-Peptide auf den JH-Titer in den AD schließen. Bei mit AT 2-dsRNA injizierten Männchen war der JH-Titer in den AD, im Vergleich zu den Kontrollen, sowohl vor als auch nach der Verpaarung erniedrigt, ebenso wie in der Bursa copulatrix der mit diesen Männchen verpaarten Weibchen. Weibchen, die mit AS-C- bzw. AT 2-dsRNA injiziert worden waren, zeigten eine reduzierte Eiablage (Oviposition), ebenso wie Ringer injizierte Weibchen, die mit AS-C- bzw. AT 2-dsRNA injizierten Männchen verpaart worden waren. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Fertilität der Männchen und Weibchen durch Neuropeptide unterschiedlich beeinflusst wird, und damit auch die Eiproduktion und Eiablage der Weibchen. Insektenneuropeptide eignen sich als (Bio)Insektizide, da sie die Physiologie und das Verhalten der Insekten während der Entwicklung und Reproduktion beeinflussen bzw. regulieren. Eine Expression von spezifischen dsRNAs in transgenen Pflanzen, gerichtet gegen allatoregulierende Neuropeptidgene, könnte die gezielte Bekämpfung von Schadinsekten, wie z. B. des Agrarschädlings S. frugiperda, ermöglichen.
