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Charakterisierung des Replikationsproteins ORF904 des archaealen Plasmids pRN1
(2008)
- Das Plasmid pRN1 kann als Modell für die Untersuchung der DNA-Replikation im thermoacidophilen Crenarchaeon Sulfolobus genutzt werden. Ein offenes Leseraster kodiert für das Protein ORF904. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dieses Protein eine N-terminal lokalisierte Primase/Polymeraseaktivität besitzt, sowie eine C-terminale ATPase/Helikasedomäne. Vermutlich ist ORF904 involviert in die Replikation von pRN1. Ein Ziel dieser Arbeit war die weitere Charakterisierung der Primaseaktivität von ORF904. Ein Reihe von Oligodesoxynukleotiden wurden untersucht und es konnte ein Templat identifiziert werden, welches von ORF904 für die Synthese eines Primers genutzt werden konnte. Die Primaseerkennungssequenz GTG konnte identifiziert werden und als minimales Substrat für die Synthese eines Volllängenprimers wurde 5’-N8GTGN-3’ bestimmt. Es war außerdem bekannt, dass ORF904 Ribonukleotide und Desoxynukleotide für die Primersynthese benötigt. Die Quantifizierung des Einbaus radioaktiv markierter Ribo- und Desoxynukleotide zeigte, dass der Primer aus einem initiierenden Ribonukleotid besteht, welches mit Desoxynukleotiden verlängert wird. Der Startpunkt des Primers befindet sich direkt 5’ des Erkennungsmotivs. Die Kopiergenauigkeit des Enzyms wurde untersucht, indem die Einbaurate nichtkomplementärer Nukleotide analysiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Selektivität des Enzyms bei der Auswahl des ersten Nukleotids (Ribonukleotid) gering ist und dass ATP an dieser Position bevorzugt und gegenüber allen Basen eingebaut wird. Im Gegensatz dazu kommt es beim Einbau der Desoxynukleotide extrem selten zu Misinkorporationen, die Fehlerrate beträgt hier weniger als 0,02. Die minimale Primasedomäne von ORF904 (Aminosäuren 40-370) hat eine erhöhte Affinität für DNA mit dem Erkennungsmotiv, die Dissoziationskonstante beträgt hier 225 nM, im Vergleich zu DNA mit einem Basenaustausch im Erkennungsmotiv mit einer Dissoziationskonstante von 1200 nM. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ORF904 in der Lage ist, ein einzelsträngiges Oligodesoxynukleotid templatunabhängig zu verlängern. Diese terminale Transferaseaktivität wurde auch bei einer Reihe weiterer archaealer zellulärer und plasmidaler Primasen gefunden. Es wird vermutet, dass diese Proteine zusätzlich an DNA-Reparaturprozessen beteiligt sind. Bisher gibt es nur wenige Informationen über den Reaktionsmechanismus von Primasen. Deshalb wurde versucht, kurze DNA-Matrizen mit verschiedenen Deletionsmutanten des Proteins zu kristallisieren, um die Röntgenkristallstruktur des Komplexes zu lösen. Nur mit einer kurzen Deletionsmutante (Aminosäuren 40-370) konnten Kristalle erzeugt werden, welche allerdings keine DNA enthielten. In der Struktur zeigte sich, dass die C-terminale Subdomäne der Deletionsmutante (Aminosäuren 260-370), welche für die Primersynthese essentiell ist, ausschließlich alpha-helikal gefaltet vorliegt. Die Anordnung der beiden Subdomänen und ihre Verbindung mit einem nicht auflösbaren, flexiblem Linker führte zu der Vermutung, dass das Protein verschiedene Konformationen einnehmen kann. Dies wurde untersucht, indem eine Reihe von Aminosäuren ausgetauscht wurden und die Primaseaktivität untersucht wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass Y352 und schwächer W314 in die Erkennung des GTG involviert sind, da eine Mutation dieser Aminosäuren zu einem Verlust der Primaseaktivität mit einem Templat mit der Erkennungssequenz führt. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass dieser Verlust der Aktivität vermutlich auf eine Veränderung der Erkennungssequenz zurückzuführen ist, da die Proteine in der Lage waren, mit M13 DNA, welche eine Vielzahl möglicher Sequenzen enthält, einen Primer zu synthetisieren. In der Kristallstruktur liegen das vorher identifizierte aktive Zentrum und die Aminosäuren Y352 und W314 weit voneinander entfernt, aber die Ergebnisse zeigen, dass sich diese Teile des Proteins während der Primersynthese vermutlich in räumlicher Nähe befinden. Dies unterstützte die Vermutung, dass die aktive Form von ORF904 eine geschlossene Konformation einnimmt und sich von der offenen Form im Kristall unterscheidet. Um die Replikation von pRN1 genauer untersuchen zu können, wurde versucht ein in vitro Replikationssystem aufzubauen. Es gelang nicht, den Replikationsursprung von pRN1 zu identifizieren. Viele der Proteine, welche in die DNA-Replikation involviert sind, sind in Komplexen organisiert, deshalb könnten weitere Proteine, die an der Replikation von pRN1 beteiligt sind, durch die Identifizierung von Interaktionspartnern von ORF904 gefunden werden. Mit einem modifizierten ELISA-Assay wurde die Interaktion von ORF904 mit PCNA1 beobachtet, welches Teil der archaealen sliding clamp ist und mit ORF80, welches ebenfalls auf pRN1 kodiert ist. Für die Interaktion von ORF904 mit diesen Proteinen war die Anwesenheit von ATP und einem Oligodesoxynukleotid notwendig. Die Aminosäuren 371-526 von ORF904 wurden als Ort der Interaktion identifiziert.
