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Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis
(2011)
- Der Gram-positive Modellorganismus Bacillus subtilis besitzt 17 alternative Sigmafaktoren, von denen 7 zur Gruppe der ECF (extra-cytoplasmic function) -Sigmafaktoren gehören. Einer dieser ECF-Sigmafaktoren, SigX, und sein entsprechender Anti-Sigmafaktor, RsiX, sind Gegenstand dieser Arbeit. Dabei handelt es sich bei RsiX um ein Transmembranprotein, während SigX im Cytoplasma lokalisiert ist und von der N-terminalen RsiX-Domäne von einer Interaktion mit der RNA-Polymerase abgehalten wird. SigW, ein weiterer ECF-Sigmafaktor, und RsiW, der dazugehörende Anti-Sigmafaktor, sind bereits sehr gut untersucht. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten zwischen SigX/RsiX und SigW/RsiW wurde angenommen, dass die Aktivierung des SigX-Regulons in vergleichbarer Weise erfolgt, wie es für das SigW-Regulon aufgrund intensiver Analysen sehr gut untersucht ist. Die in dieser Arbeit verwendete Methode der Transposonmutagenese lieferte entscheidende Hinweise über die Regulation des sigX-rsiX-Operons. Es konnte gezeigt werden, dass das sigX-rsiX-Operon einer Regulation durch den Transkriptionsterminator Rho unterliegt. Damit wurde das erst dritte Beispiel für eine Termination der Transkription durch den Faktor Rho in B. subtilis bekannt. Als wichtiges Element für die faktorabhängige Termination der Transkription gilt das Vorhandensein einer rut-site, der Bindestelle des Faktors Rho in der naszierenden mRNA. In dieser Arbeit wurden verschiedene Analysetechniken angewandt, um mit Hilfe eines GFP-RsiX-Reporters erstmals eine rut-site in B. subtilis zu kartieren. Die hier identifizierte rut-site von rsiX ist am 5´-Ende dieses Gens lokalisiert. Bei diesen Analysen wurde außerdem deutlich, dass es im sigX-rsiX-Operon zu einer faktorabhängigen intragenischen Termination der Transkription kommt, bei welcher nicht nur die Transkription von rsiX, sondern auch die Expression des stromaufwärts liegenden sigX beeinflusst wird. Punktmutationen in der Sequenz für die rut-site von rsiX zerstörten den Einfluss des Faktors Rho auf das sigX-rsiX-Operon, so dass keine Termination der Transkription mehr stattfand und die detektierbare Menge an sigX-rsiX-Transkript deutlich anstieg. Nur so war es möglich, einen rsiX-Knockout zu komplementieren. Messungen der beta-Galaktosidase-Aktivität eines lacZ-Reporters belegten zudem die Funktion von RsiX als Anti-Sigmafaktor von SigX. Der Verlust des Einflusses von Rho auf das sigX-rsiX-Operon aufgrund einer mutierten rut site machte auch immunologische Nachweise des Anti-Sigmafaktors möglich. Infolgedessen konnte der Frage einer möglichen RsiX-Proteolyse nach dem Vorbild der RsiW-Proteolyse nachgegangen werden. Für RsiW wurde bereits gezeigt, dass ein bestimmtes Stress-Signal den Abbau des Anti-Sigmafaktors einleitet. Die Proteolyse von RsiW erfolgt dann nach dem Mechanismus der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) unter der Beteiligung mehrerer Proteasen. Neben der Beteiligung der Protease RasP an der RsiW-Proteolyse konnte hier auch die Beteiligung von RasP an der RsiX-Proteolyse nachgewiesen werden. Gleichzeitig wurde aber ausgeschlossen, dass die Protease PrsW, welche auch an der RsiW-Proteolyse beteiligt ist, in die RsiX-Proteolyse involviert ist. Demnach können die einzelnen Schritte der RsiW-Proteolyse nicht einfach auf die RsiX-Proteolyse übertragen werden, obwohl es sich bei beiden Transmembranproteinen um Anti-Sigmafaktoren ihrer jeweiligen ECF-Sigmafaktoren handelt.
