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- Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (1) (remove)
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Lokalisierung und molekulare Charakterisierung eines Pederin produzierenden Endosymbionten der Gattung Pseudomonas aus dem Kurzflügler Paederus riparius(Coleoptera: Staphylinidae)
(2007)
- Weibliche Kurzflügelkäfer der Gattung Paederus beherbergen einen mit Pseudomonas aeruginosa sehr nahe verwandten Endosymbionten, der für die Synthese des stark cytotoxischen Naturstoffs Pederin verantwortlich ist. Die ökologische Bedeutung dieses Giftstoffs für die Käfer liegt dabei offenbar in einer Abwehrfunktion gegenüber potentiellen Prädatoren, wie z. B. Wolfsspinnen, begründet. Aufgrund einer sehr hohen tumorhemmenden und antiviralen Wirksamkeit ist Pederin in erster Linie für die medizinische Forschung interessant. Ziel dieser Arbeit war es, den Endosymbionten von Paederus riparius mit verschiedenen mikrobiologischen und molekularen Methoden in den Käfern bzw. auf deren Eiern exakt zu lokalisieren, um somit die Organisation dieser Bakterien im Wirtsinneren näher zu beleuchten und deren Übertragungsweg auf die Nachkommenschaft aufklären zu können. Durch eine gezielte Isolierung des Pederin-Symbionten sollte dieser schließlich auf exakt abgestimmten, Agar basierten Kulturmedien angezüchtet werden, um letztlich eine Produktion dieses komplizierten Polyketids außerhalb der Käfer in ökologisch nachhaltiger Weise gewährleisten zu können. 1. Mit Hilfe von Pederin-Gen-spezifischen Primern konnte der Endosymbiont in den Abdominalspitzen der Käfer detektiert werden. Eine sich anschließende molekulare Untersuchung verschiedener abdominaler Organe zeigte, dass das Vorhandensein des symbiontischen Bakteriums ausschließlich auf die am weiblichen Geschlechtsapparat paarig angelegten Anhangsdrüsen und den Ausführgang begrenzt ist. Über eine in situ-Färbung dieser Drüsen mit dem Nucleinsäurefarbstoff DAPI konnte daraufhin zum ersten Mal das Vorhandensein einer morphologisch einheitlichen, stark an Pseudomonas erinnernden Kolonie gezeigt werden. 2. Der Einsatz einer fluoreszenzmarkierten Gensonde ermöglichte es, das endosymbiontische Bakterium in Serien-Dünnschnitten von Abdomina und Eiern gezielt sichtbar zu machen. Dabei zeigte sich im Falle der Abdominalschnitte, dass der Pederin-Produzent in einer enorm hohen Dichte als Reinkultur in den Anhangsdrüsen und in etwas geringerer Menge in bestimmten Bereichen des Ausführgangs lokalisiert ist, in den die beiden Symbionten-Drüsen münden. Im Falle der Ei-Dünnschnitte konnte der Endosymbiont auf einer die Eischale umgebenden warzenartigen Schicht detektiert werden, auf die das Bakterium in einer biofilmartigen, festen Matrix aufgebracht ist. Die Verteilung der Symbionten-Zellen erstreckte sich dabei stets über die gesamte Ei-Oberfläche. Ein möglicher Weg der Übertragung vom Weibchen auf die Eier wäre die aktive oder passive Abgabe einer definierten Menge Bakterienmaterial über einen Schleusenmechanismus, der die Anhangsdrüsen gegenüber dem Inneren des Ausführgangs während der Ei-Passage öffnen und verschließen kann. 3. Mit einer speziellen Sektionstechnik gelang es, den Endosymbionten von seinem Insekten-Wirt zu isolieren. Die lichtmikroskopische Untersuchung der Bakterienlösung zeigte dabei das Vorhandensein einer Pseudomonas aeruginosa sehr ähnlichen, offenbar kontaminationsfreien Zellkolonie. Den endgültigen Beweis, dass es sich dabei um eine Reinkultur des Paederus-Endosymbionten handelte, erbrachte jedoch erst die fluoreszenzmikroskopische Auswertung der mit der spezifischen Gensonde hybridisierten Zellen. 4. Anhand der isolierten Reinkultur des Pederin produzierenden Symbionten konnte über verschiedene Enzymtests gezeigt werden, dass es sich um ein gramnegatives Bakterium mit einem aeroben oder mikroaerophilen Stoffwechsel handelt, das jedoch im Gegensatz zu den Pseudomonaden vollständig unbegeißelt ist. Die dafür benötigten Gene sind offenbar im Zuge der endosymbiontischen Anpassung an den Käfer-Wirt durch zahlreiche Genomreduktionen verloren gegangen. Dies gilt wahrscheinlich ebenso für die Gene, die Pseudomonas aeruginosa die Fähigkeit zur Denitrifikation verleihen. Diese Gene konnten im Rahmen spezifischer PCR-Experimente in den Endosymbionten nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus erbrachte eine vergleichende RFLP-Analyse der endosymbiontischen 16S rDNAs der beiden voneinander kontinental getrennten Paederus-Arten P. riparius und P. sabeus die Erkenntnis, dass eine genetische Aufspaltung des Pederin-Symbionten in eigenständige Arten noch nicht stattgefunden hat. 5. Ein mögliches Wachstum des Endosymbionten konnte mit den Pederin-Gen-spezifischen Primern in einem flüssigen Anreicherungsmedium nachgewiesen werden. Durch eine Beimpfung der verschiedensten universellen und selektiven Nährböden mit Ei- bzw. Käfer-Homogenisat konnte im Laufe der Kultivierungsexperimente eine Vielzahl grampositiver und gramnegativer Bakterien kultiviert werden. Eine gezielte Anzucht des Paederus-Endosymbionten auf diesen Medien konnte jedoch nicht erreicht werden, was nicht zuletzt auch auf einen zu geringen Kenntnisstand über die möglicherweise sehr speziellen Nährstoffanforderungen der Pederin-Produzenten außerhalb ihrer Käfer-Wirte zurückgeführt werden kann.
