Refine
Keywords
- Protein-Tyrosin-Phosphatasen (1) (remove)
-
Untersuchungen zur Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPRR
(2003)
- Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Funktion der PTPRR in der zellulären Signaltransduktion mit den Schwerpunkten Substrate, Regulation und Beteiligung an biologischen Prozessen. Von besonderem Interesse war die Rolle der PTPRR bei der Tumorentstehung und Transformation von Zellen. Dabei wurden noch unveröffentlichte Daten bestätigt, daß PTPRR die MAPKn ERK1 und 2 über ein neuartiges MAPK-Bindungsmotiv, das KIM, sowohl in vitro als auch in vivo binden und dephosphorylieren kann. Somit ist PTPRR die erste tyrosinspezifische Phosphatase, der eine Dephosphorylierung von MAPKn in höheren Eukaryonten nachgewiesen wurde. Eine weitere Analyse durch transiente Überexpression der PTPRR in HEK293-Zellen ergab, daß PTPRR spezifisch die MAPKn ERK1/2, nicht jedoch p38 Kinase oder JNK/SAPK dephosphoryliert. Zudem wurde über Transkriptionsaktivierungs-experimente der Nachweis erbracht, daß PTPRR die ERK1/2-vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren negativ beeinflussen kann. Bei der näheren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK1/2 wurde eine vorher unbekannte Verknüpfung des PKA mit dem ERK-Signalweg aufgedeckt. Es wurde gezeigt, daß PKA den im KIM gelegenen Serinrest in der Position 321 der Aminosäuresequenz der PTPRR phosphorylieren und so die Bindung und Dephosphorylierung der ERK1/2 in vivo inhibieren kann. Dies weist auf einen neuartigen Mechanismus hin, über den PKA die Aktivierung des MAPK-Signalwegs reguliert. Ein weiterer Effekt, der nachgewiesen wurde, ist die Inhibition der c-Src-induzierten Phosphorylierung des KIF1C, welcher am retrograden Transport vom Golgi-Apparat zum Endoplasmatischen Retikulium beteiligt ist. Damit wurde PTPRR als erste PTPase mit einer Dephosphorylierung des KIF1C in Verbindung gebracht. Über in vitro-Assoziation mit GST-PTPRR im präparativen Maßstab mit anschließender Sequenzierung der gebundenen Proteine wurden die Hitzeschockproteine HSP70 und GRP78 als in vitro Bindungspartner der PTPRR identifiziert. Die nähere Untersuchung der Bindung ergab, daß diese innerhalb der Juxtamenbrandomäne der PTPRR erfolgt und von ATP abhängig ist. Diese Art der Bindung ist ein Anzeichen dafür, daß die Wechselwirkung spezifisch und PTPRR ein Substrat der Chaperone HSP70 und GRP78 ist, welche für die korrekte Faltung von Proteinen sorgen. Da HSP70 ebenfalls mit anderen Mitgliedern des ERK-Signalwegs wechselwirken kann und zudem aus Komplexen mit den MAPK-Kaskade-Gerüstproteinen KSR und HSP90 isoliert wurde, ergibt sich aus der Assoziation von PTPRR und HSP70 die Möglichkeit einer Beteiligung an einem Multiprotein-ERK-Signalkomplex. Bei der Analyse der endogenen Proteinexpression der PTPRR wurde erstmals das Auftreten verschiedener Isoformen in humanen Zellen nachgewiesen. Über Immunfluoreszenz wurde gezeigt, daß die zytoplasmatische Isoform PTPRRcyto im gesamten Zytoplasma vorkommt, während die Isoform PTPRR TM in perinukleären Vesikeln lokalisiert ist. Ein Vergleich der Effekte verschiedener überexprimierter Isoformen zeigte Unterschiede sowohl bei der PDGF-induzierten Phosphorylierung der ERK1/2 als auch bei der c-Src-vermittelten Phosphorylierung des KIF1C. Zudem wurden in Transkriptionsaktivierungsexperimenten Unterschiede in der ERK1/2-vermittelten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren detektiert. In allen Fällen hatte die zytoplasmatische Isoform die stärkste inhibitorische Wirkung. Ferner wurde in stabil mit PTPRR transfizierten NIH3T3-Zellen der Effekt dieser PTPase auf biologische Prozesse untersucht. Dabei wurde ein negativer Einfluß der Überexpression der PTPRR auf die basale und PDGF-induzierte Proliferation sowie auf die Migration der Zellen beobachtet, welche beide an der Tumorentstehung beteiligt sein können. Die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK für diese Effekte wurde dadurch belegt, daß eine Mutante der PTPRR, die ERK1/2 nicht mehr bindet, in beiden Experimenten keine Wirkung zeigte. Außerdem konnte die Überexpression der PTPRR sowie der verwandten PTPase STEP die durch die Onkogene v-Ki-Ras- und Her2-, nicht jedoch die durch v-ErbB- oder v-Fms-induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen in Focusbildungs-experimenten verhindern. Zudem reduzierte die Überexpression der PTPRR die Her2-vermittelte Proliferation von Zellen unter Entzug von Wachstumsfaktoren. Diese Daten liefern nicht nur Hinweise auf eine potentiell tumorsupprimierende Wirkung der PTPRR und STEP, sondern gewähren auch Einblicke in die von den Onkogenen ausgehenden Signalwege, die zur Transformation von Zellen führen. Auch wurde nachgewiesen, daß der Expressionslevel der PTPRR in Tumorzellinien und –geweben im Vergleich zu nichttransformierten Zellinien und Geweben erhöht ist. Es ergeben sich erste Hinweise auf einen Rückkopplungsmechanismus, mit dem Zellen versuchen könnten, die durch Onkogene häufig hyperaktivierten ERKn negativ zu regulieren.
