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- Thermodynamische Stabilität (1) (remove)
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Stabilisierung von Proteinen durch in vitro-Evolution - Selektion und biophysikalische Charakterisierung
(2007)
- Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, große Proteine bzw. Enzyme durch Proside zu stabilisieren und die selektierten Varianten biophysikalisch zu charakterisieren. Proside ist eine auf dem phage display basierende in vitro-Evolutions-Methode zur Selektion stabilisierter Proteinvarianten, wobei eine erhöhte Proteaseresistenz stabilisierter Proteinvarianten mit der Infektiosität filamentöser Phagen verknüpft wird. Die evolutive Stabilisierung großer Proteine bzw. Enzyme ist besonders wichtig, weil deren Optimierung mittels rationalen Designs aufgrund der fehlenden Kenntnis der Struktur-Stabilitäts-Zusammenhänge fast unmöglich ist. Zum einen sind stabilisierte Enzyme in der industriellen Anwendung von großem Interesse, zum anderen ermöglicht die Analyse der stabilisierenden Effekte, vor allem auch im strukturellen Zusammenhang, Einblicke in die Prinzipien der Stabilität von Mehr-Domänen-Proteinen. Im Proside-System wird das zu stabilisierende Gastprotein zwischen die N2- und die CT-Domäne des G3P filamentöser Phagen eingebaut. Proside ist ein sehr effektives Selektionssystem, die Stabilisierung größerer Gastproteine ist jedoch schwierig. Cysteinhaltige Gastproteine können mit den Disulfidbrücken des G3P inkorrekte Disulfidbrücken bilden, wodurch die Infektiosität der Phagen verlorengeht. Außerdem nimmt die Infektiosität der Phagen mit der zunehmenden Größe des Gastproteins ab. Dieses Phänomen tritt besonders in Kombination mit dem Problem des Verlusts von Gastproteinen durch homologe Rekombination in Erscheinung. Phagen, die durch Rekombination das Gastprotein verlieren, sind in der in vitro-Proteolyse stark begünstigt und zusätzlich auch infektiöser als Phagen mit dem vollständigen Gastproteininsert. Ziel der Arbeit war deshalb zunächst, das Selektionssystem so zu modifizieren, dass es auf größere Proteine angewendet werden kann. Um das Problem der inkorrekten Disulfidverbrückung zu eliminieren, wurden die drei Disulfidbrücken im N1N2-Fragment des G3P durch Proside-Selektion substituiert und damit ein infektiöser Phage mit disulfidfreiem G3P konstruiert. Das selektierte 0SS-G3P* ist stabiler als das disulfidverbrückte Wildtyp-Protein. Kombination aller selektierten Mutationen in einer Variante ergibt ein im Vergleich zum Wildtyp-Protein um 19,0 °C stabilisiertes disulfidfreies G3P*. Die 14 second-site Muationen konnten so den Verlust von drei Disulfidbrücken überkompensieren. Die Einzelbeiträge zur Stabilisierung wurden mit Hilfe vieler Einzel- und Mehrfachmutanten charakterisiert und auf der Basis der Kristallstruktur des stabilisierten 0SS-G3P* analysiert. Dies ergab, dass verbesserte Domäneninteraktionen einen enormen Beitrag zur Stabilität leisten. Das G3P besitzt neben den Domänen N1 und N2 eine C-terminale Domäne CT, die auch für den Infektionsprozeß von Bedeutung ist. Diese Domäne wurde allein oder in Fusion mit N2 bzw. N1 und N2 exprimiert. Die isolierte CT-Domäne ist bis auf eine hydrophobe Helix entfaltet. Lediglich in Gegenwart von N1 und N2 besitzt sie eine marginale konformationelle Stabilität. Die Funktion der CT-Domäne bei Infektion und Phagenaustritt aus der Wirtszelle beruht auf der Exponierung hydrophober Oberflächen für die Interaktion mit der Wirtszellmembran, so dass eine flexible bzw. nur marginal stabile Domäne hierfür sehr geeignet scheint. Als Modellprotein für große Enzyme wurde die TEM-1 Beta-Lactamase aus E. coli durch Zufallsmutagenese und Proside-Selektion stabilisiert. Ebenso wie im Fall des G3P wurde eine große Stabilisierung des Enzyms um 18,4 °C durch eine stufenweise Selektion und anschließende Kombination der stabilisierenden Mutationen erreicht. Die stabilisierte Kombinationsvariante ist bei niedriger Temperatur etwa doppelt so aktiv wie das Wildtyp-Protein, und das Optimum der Aktivität ist zu höheren Temperaturen verschoben. Die Selektion stabilisierter Varianten war nur bei gleichzeitiger Selektion auf Ampicillin-Resistenz der infizierten Zellen möglich. Da der Phagentiter niedrig war, dominierten in Abwesenheit von Ampicillin rekombinante Phagen ohne Gastprotein die in vitro- und in vivo-Selektion. Um dieses Problem bei großen Gastproteinen ausschließen zu können, wurde ein alternatives Selektionssystem etabliert, wobei das zu stabilisierende Gastprotein aus der ursprünglichen Position zwischen der N2- und der CT-Domäne an den Beginn des G3P verschoben und mit einem N-terminalen Cystein als Selektions-Tag versehen wird. Die Phagenbibliothek wird auch in diesem Fall einer Proteolyse unterworfen, die Selektion beruht jedoch nicht auf einer Kombination von Proteaseresistenz und Infektiosität des Phagen, sondern auf der Kombination Proteaseresistenz und Bindung an eine Affinitätsmatrix. Die Infektiosität der Phagen wird durch ein N-terminal angefügtes Gastprotein nicht beeinflußt, und in ersten Selektionsversuchen mit Beta-Lactamase konnten stabilisierte Varianten angereichert werden.
