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- Ligandenaffinität (1) (remove)
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Mechanismen molekularer Erkennung: Charakterisierung der molekularen Details der Wechselwirkungen des herpesviralen Tip-Proteins mit SH3-Domänen
(2005)
- Die Wechselwirkungen des Tip-Proteins aus Herpesvirus saimiri mit der T-Zell-spezifischen Kinase Lck sind entscheidend für die Aktivierung der Kinaseaktivität und nehmen somit eine zentrale Rolle bei der T-Zell-Transformation ein. Bis heute war es weder durch Röntgenkristallografie, noch durch NMR-Spektroskopie möglich, eine hochaufgelöste Struktur des LckSH3-Tip-Komplexes zu erhalten. Eine Möglichkeit dieses Probleme zu lösen, ist die Verwendung von stärker bindenden Interaktionspartnern, die sich oft besser für strukturelle Studien eignen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit sowohl der Komplex von Tip mit LynSH3 charakterisiert, als auch eine Punktmutante (P17G) der LckSH3 entworfen, die eine höhere Affinität zu Tip aufweist. Die Strukturinformationen, die aus der Charakterisierung dieser Systeme erhalten werden konnten, sollten als Basis für eine zuverlässige Modellierung des LckSH3-Tip-Komplexes dienen. Analysen ergaben, dass die im Vergleich zur LckSH3 erhöhten Ligandenaffinitäten von LynSH3 und LckSH3_P17G auf unterschiedlichen Mechanismen basiert. Die im Vergleich zur wildtyp LckSH3 um nahezu eine Zehnerpotenz stärkere Bindung von LckSH3_P17G konnte durch schnellen Mischmethoden zumindest teilweise auf eine schnellere Komplexbildung zurückgeführt werden. Eine detaillierte Erklärung dieses Unterschieds auf struktureller Ebene konnte durch Moleküldynamiksimulationen des Wildtyps und der Mutante der LckSH3 erhalten werden. So korreliert die schnellere Komplexbildung der Mutante gut mit einer stärkeren Population der 'bindungsaktiven' Konformation während des Simulationszeitraums. Dabei zeichnet sich LckSH3_P17G nicht nur durch eine erhöhte konformationelle Abtastrate der 'bindungsaktiven' Konformation aufgrund gesteigerter RT-Schleifenflexibilität aus, sondern zeigt eine Zunahme der Gesamtflexibilität der SH3-Domäne im ps-s-Bereich auf. Weiterhin konnten durch die Analyse der thermischen Entfaltung mittels CD-Spektroskopie und MD-Simulationen eine globale Destabilisierung und ein veränderter Entfaltungsweg für die P17G-Mutante der LckSH3 gezeigt werden. Der LynSH3-Tip-Komplex konnte in hoher Auflösung mittels NMR-Spektroskopie bestimmt werden. Analysen der Komplexstruktur ergaben, dass nicht nur die Prolinhelix, sondern auch zusätzliche COOH-terminal flankierende Reste des Liganden an der Bindung beteiligt sind. Eine besondere Rolle nimmt dabei L186 ein. Es bindet in eine hydrophobe Tasche aus H41, W44 und F57 auf der Oberfläche der LynSH3. Ausgehend von der LynSH3-Tip-Komplexstruktur konnte unter der Einbeziehung NMR-spektroskopischer Daten der LckSH3-Tip-Wechselwirkungen ein molekulares Modell des LckSH3-Tip-Komplexes erstellt werden. Obwohl die Bindung von L186 in die hydrophobe Tasche auf der Oberfläche für beide SH3-Domänen experimentell nachgewiesen werden konnte, zeigten Fluoreszenztitrationsexperimente mit einem verkürzten Tip-Peptid, dass L186 aus Tip nur im Komplex mit LynSH3 einen signifikanten Einfluss auf die Affinität hat. Weitere Untersuchungen ergaben, dass L186 bei Bindung in die hydrophobe Tasche der LynSH3 nahezu vollständig von H41 bedeckt wird. Das Serin an strukturell ähnlicher Position in LckSH3 bedeckt hingegen nur einen kleinen Teil von L186. Die zusätzlichen Wechselwirkungen senken die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation des Komplexes, was in guter Übereinstimmung mit dem unterschiedlichen Austauschverhalten auf der NMR-Zeitskala steht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit neben der Aufklärung der molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen der LckSH3 mit dem herpesviralen Tip-Protein gezeigt werden, dass Affinität auch bei sehr nahe verwandten Proteinen auf unterschiedliche Weise erzielt werden kann. Weiterhin unterstreichen die Ergebnisse dieser Arbeit die Notwendigkeit der gleichzeitigen Charakterisierung der Struktur und Dynamik makromolekularer Interaktionen. Erst dieses kann zu einem detaillierteren Verständnis der Mechanismen molekularer Erkennung und darauf aufbauend zukünftig zu verlässlicheren Vorhersagen von molekularen Interaktionen führen.
