Refine
Keywords
- Nus-Faktoren (1) (remove)
-
Die Regulation der Transkriptionsantitermination in Escherichia Coli.
(2009)
- Die Transkription wird in den Zellen durch die RNA-Polymerasen (RNAP) katalysiert. Die bakterielle RNAP ist aus den zwei alpha, beta´, beta, omega-Untereinheiten aufgebaut. Das katalytische Zentrum wird durch die beta’- und beta-Untereinheit gebildet und sorgt für die Bildung der Phosphodiesterbindung. Die alpha- und omega-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau der RNAP verantwortlich, wobei Teile der alpha-Untereinheiten zusätzlich regulatorische Funktionen haben. Der Ablauf der Transkription ist in Initiation, Elongation und Termination unterteilt. Alle drei Phasen werden innerhalb der Zellen streng reguliert. Während der Elongation bewirkt die sogenannte Antitermination das Überlesen von Terminationssequenzen. Dieser zuerst beim Phagen Lambda identifizierte Mechanismus, beruht auf dem Aufbau eines Multi-Protein-Komplexes, bestehend aus den Escherichia coli (E. coli) Nus-Proteinen (A, B, E, G), der RNAP, der nut RNA-Sequenz und dem Lambda N-Protein. Die ribosomalen (rrn) Operons in E. coli werden durch intrinsische Antitermination reguliert. Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen konnten zeigen, dass die Bildung des NusB:NusE Heterodimers und seine Bindung an die boxA der nut und rrn RNA-Sequenzen ein wichtiger Schritt im Aufbau des Antiterminationskomplexes ist. Für die sogenannte NusB101-Mutation, Asp118Asn, die den negativen Effekt von Mutationen in anderen Komponenten des Komplexes aufheben kann, konnte eine höhere Affinität zur Erkennungs-RNA gezeigt werden. Weitere Mutationen an dieser Position zeigten, dass die Aminosäureposition 118 zentral für die Stabilität der RNA-Bindung ist. Ein weiterer Bestandteil des Antiterminationskomplex ist das zwei Domänenprotein NusG, über dessen Interaktion innerhalb des Komplexes wenig bekannt war. Interaktionen für die beiden Domänen, die das NusG-Paralog RfaH konstituieren, sind in der Literatur beschrieben, wie es auch bei der Kristallisation von NusG aus Aquifex aeolicus gezeigt werden konnte. Für E. coli NusG konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese Interaktion konzentrationsabhängig, damit intermolekular, und sehr kurzlebig ist. Zusätzlich konnten Proteinbindungsflächen auf beiden Domänen bestimmt werden. Als Erkenntnis von zentraler Wichtigkeit und sehr weitreichenden Konsequenzen wurde in dieser Arbeit eine spezifische und strukturell sehr gut definierte Wechsel-wirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE, das unter der Bezeichnung S10 auch ein Bestandteil der 30S Untereinheit des Ribosoms ist, identifiziert. Seit wenigen Wochen ist in der Literatur die Interaktion der amino-terminalen Domäne von NusG mit der RNA-Polymerase beschrieben. Die hier beobachtete Wechselwirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE könnte damit zur Rekrutierung des NusB:NusE Heterodimers und zur Ausbildung eines kompakten Antiterminationskomplexes beitragen. Da NusE auch Teil des Ribosoms ist, stellt die NusG:NusE Interaktion möglicherweise die erste direkte molekulare Verbindung zwischen Transkription und Translation in Bakterien dar. Diese Kopplung von bakterieller Transkription und Translation ist ein sehr lange bekanntes, aber molekular nicht erklärtes Phänomen von außerordentlicher Bedeutung für die Überlebensfähigkeit von Bakterien. In ähnlicher Weise, wie das Lambda N-Protein, aber mit entgegengesetzter Wirkung – Termination statt Antitermination – bindet das Nun-Protein aus dem Phagen HongKong 022 an die boxB, eine Haarnadelschleife der nut Sequenz. Durch in vivo Studien wurde die Nun Tyr39Ala Mutante, die wichtige Hinweise für das Verständnis der Peptid-RNA-Interaktion lieferte, identifiziert. Durch diese Mutation ist eine ursprünglich als wichtig angesehene Wechselwirkung mit dem Adenosin 9 der boxB nicht mehr möglich. Molekulardynamikuntersuchungen zeigen deutliche Unter-schiede zur Lambda N:boxB Wechselwirkung auf, da die analoge Trp18:A9 Interaktion essentiell für prozessive Antitermination ist. Auf diese Weise lieferte diese Untersuchung wichtige Hinweise auf den molekularen Schaltmechanismus.
