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Methyljasmonat induzierte Seneszenz in Chloroplasten aus Primärblättern der Gerste (Hordeum vulgare L.): Analyse der Ultrastruktur und des Proteinimports
(2007)
- Die Seneszenz eines Blattes umfasst dessen abschließende Phase im pflanzlichen Entwicklungsprozess und stellt somit eine der wichtigsten Schlüsselpositionen im Lebens- und Entwicklungszyklus des Individuums dar. Es sind damit dramatische Veränderungen auf molekularem, biochemischem und strukturellem Niveau untrennbar mit der Seneszenz verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten seneszenzbedingte Veränderungen an Plastiden untersucht werden, wobei der Frage, ob die Plastidenhüllmembran bis in relativ späte Phasen der Seneszenz unverändert bleibt, speziell Rechnung getragen werden. Dazu wurde zunächst ein experimentelles System etabliert, bei dem es möglich war, Seneszenz in Primärblättern der Gerste gezielt zu induzieren und deren Ablauf, im Vergleich zur natürlichen Seneszenz, zu beschleunigen. Von vier getesteten seneszenz-auslösenden Faktoren, zeigte einzig die Behandlung mit Methyljasmonat beide der erwarteten seneszenz-spezifischen Veränderungen (Chlorophyllverlust und Bildung von Gerontoplasten). Das experimentelle System „Methyljasmonat-induzierte Seneszenz“ zeigte in Bezug auf die seneszens-spezifischen Marker (Chlorophyllabbau, strukturelle Veränderungen) eine hohe Übereinstimmung mit der natürlichen Seneszenz. Seneszenzspezifische Veränderungen der Plastidenhülle sollten sich v. a. auch auf den Import von kernkodierten, chloroplastidären Proteinen auswirken und somit am veränderten Gehalt dieser Proteine im Plastiden messbar sein. So war eine Methyljasmonatinkubation abgeschnittener Gerstenprimärblätter in der Lage, innerhalb von nur 24 Stunden eine quantitativ messbare Abnahme der Menge zweier wichtiger Proteine (Rubisco und LHC II) des Plastiden zu bewirken. Für diese beobachtete Abnahme könnten aber sowohl verminderte Synthese-, als auch erhöhte Abbauraten der betroffenen Proteine verantwortlich sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionsmuster von chloroplastidären Proteinen, insbesondere des Proteinimports, analysiert. Die Analyse der Genexpressionsmuster der chloroplastidären Proteine Rbcs und LHC II ergaben nun, dass unter Methyljasmonateinfluss die jeweiligen korrespondierenden mRNA-Mengen dieser Proteine abnahmen. Es handelte sich aber nicht um einen generellen RNA-Abbau, da die rRNA Mengen gleich blieben. Die Abnahme der Konzentration dieser plastidären Proteine war zumindest zum Teil durch eine Abnahme ihrer Synthese bedingt. Bei einem an Chlorophyllabbau beteiligten Protein, LLS1, wurde demgegenüber bei Methyljasmonatinkubation ein Ansteigen der Proteinmenge im Chloroplasten beobachtet, was zu der Annahme führt, dass es auch während der Methyljasmonat-induzierten Seneszenz einen funktionierenden Proteinimportapparat geben sollte. Zum Vergleich von Proteinimportkapazitäten von Chloroplasten unterschiedlicher Entwicklungsstufen wurden die Isoenzyme der NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase verwendet, wobei gezeigt werden konnte, dass der Import von pPORB durch den Standardproteinimportapparat (TIC-TOC Maschinerie) und der Import von pPORA entwicklungsabhängig - über einen pPORA-spezifischen Importapparat (PTC) in Abhängigkeit vom Substrat Protochlorophyllid (Pchlid) - erfolgte. Untersuchungen des Importverhaltens von pPORB in Chloroplasten ergab, dass sowohl in Plastiden aus frischen Blättern als auch nach Flotation auf Wasser, ein Import erfolgte. pPORA wurde nur in Pchlid-haltige, nicht jedoch Pchlid-freie Chloroplasten der Frischkontrolle importiert (außer bei Flotation auf Wasser). Eine Behandlung von Blättern mit Methyljasmonat wirkte sich immer hemmend auf den Import beider Präkursoren aus. Mit den angeschlossenen Crosslinking-Experimente zeigten sich weder Proteine der TIC-TOC-Maschinerie noch des PTC-Komplexes. Es kann also davon ausgegangen werden, dass es jedenfalls zu Veränderungen des ganzen oder zu Teilen des Standardproteinimportapparates kommen muss. Diese Veränderungen des Standardproteinimportapparates in der äußeren Plastidenhülle wurden mit Hilfe von speziellen elektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf dem integralen Teil des Standardproteinimportapparates, der den zentralen Kanal durch die äußere Hüllmembran bildet (TOC 75) und den eigentlichen Durchtritt kerncodierter Proteine in den Plastiden vermittelt. Eine Kombination der konventionellen Gefrierbruchtechnik mit der SDS-FRL, gelang es, seneszenzbedingte Veränderungen der Hüllmembran zu detektieren. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Dichte des TOC 75 Proteins, in der äußeren Plastidenhülle unter Methyljasmonateinfluss innerhalb von 24 Stunden dramatisch abnimmt (Verlust der TOC 75 Immunsignaldichte gegenüber dem Ausgangswert um mehr als 85 %). Dieser deutliche Verlust von TOC 75 in der Plastidenhülle nach Methyljasmonatbehandlung deutet darauf hin, dass eine spezifische Regulation des Imports photosynthetisch wichtiger Proteine während der künstlich induzierten Seneszenz auftritt.
