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Regulation der Transkription: Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen der carboxyterminalen Domäne von E.coli NusA
(2005)
- Die RNA-Synthese in der Zelle wird durch RNA Polymerasen (RNAPs) katalysiert und erfolgt in einem Zyklus aus Initiation, Elongation und Termination. In den letzten Jahren konnten durch die Aufklärung von Kristallstrukturen elongierender RNAPs vor allem Fortschritte im Verständnis der Elongationsphase erzielt werden, so daß die Elongation derzeit ein attraktives Forschungsgebiet darstellt. Während der Elongation bildet die RNAP einen stabilen Komplex mit DNA und RNA, der als Transkriptionselongationskomplex (TEC) bezeichnet wird, und über Tausende von Basenpaaren prozessiv ist, das heißt nicht dissoziiert. Lediglich an bestimmten DNA-Elementen, sogenannten Terminatoren, kann der TEC soweit destabilisiert werden, daß die Transkription beendet werden kann. Die Effizienz der Termination wird dabei durch Transkriptionsfaktoren reguliert. In E.coli wird die Entscheidung Elongation-versus-Termination an einem Terminator durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor NusA beeinflußt. NusA assoziiert während der Elongation mit dem TEC und fördert sowohl Pausen während der Transkription als auch die Termination. Dagegen wirkt NusA zusammen mit dem viralen Antiterminator-Protein lambda N selbst als Antiterminator und setzt die Terminationseffizienz herab. Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen bakteriellen NusA-Proteinen sowie biochemische Daten weisen darauf hin, daß NusA aus drei funktionellen Domänen besteht. Dabei wechselwirkt die aminoterminale Domäne mit den großen Untereinheiten der RNAP während die zentrale Domäne RNA-Interaktionen vermittelt. Die ungefähr 160 Aminosäuren umfassende carboxyterminale Domäne, NusACTD, ist nur in einigen NusA-Proteinen vorhanden. NusACTD ist auffallend negativ geladen und enthält eine Sequenzwiederholung. Für den konservierten aminoterminalen und zentralen Bereich von NusA wurden die Strukturen von T.maritima und M.tuberculosis mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Eine hochaufgelöste Struktur für NusACTD konnte dagegen erst in dieser Arbeit mit NMR-Spektroskopie gewonnen werden. NusACTD besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen NusA(353-416) (AR1)und NusA(431-490) (AR2), die ungefähr den zwei homologen sauren Sequenzbereichen entsprechen. Mit 15N-Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, daß die Domänen über eine flexible Linkerregion verbunden sind und keine definierte Orientierung zueinander einnehmen. Jede der Domänen weist fünf Helices auf, die eine (HhH)2-Faltung annehmen. Charakteristisch für die (HhH)2-Faltung sind jeweils zwei gegeneinander gepackte HhH-Motive, die zusammen mit der Verbindungshelix zwischen den Motiven einen kompakten hydrophoben Kern bilden. (HhH)2-Faltungen kommen häufig als selbständige Domänen vor, die DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. E.coli NusACTD wechselwirkt mit dem viralen lambda N-Protein sowie der carboxyterminalen Domäne der alpha Untereinheit der RNAP (alpha CTD). Zudem reguliert NusACTD die RNA-Bindung an die zentrale Domäne von NusA, indem es selbst mit den RNA-Bindungsstellen interagiert. Trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit erkennen AR1 und AR2 lambda N und alpha CTD auf unterschiedliche Art und Weise. In dieser Arbeit durchgeführte Titrationsexperimente weisen darauf hin, daß alpha CTD ausschließlich an AR2 bindet, während lambda N wahrscheinlich nur mit AR1 spezifische Kontakte ausbildet. Die Wechselwirkung von alpha CTD mit NusA ermöglicht in vitro eine RNA-Bindung an NusA. Es ist daher anzunehmen, daß AR2 eine autoinhibitorische Funktion besitzt. Zusätzlich scheinen die Wechselwirkungen von NusACTD und alpha CTD zur Stabilisierung der RNAP-NusA-Interaktion beizutragen. Die antiterminatorische Wirkung von lambda N beruht auf einer direkten Interaktion zwischen der RNAP und einer Region von lambda N außerhalb der NusA-Bindungsregion. Die lambda N-NusA-Wechselwirkung steigert die Antiterminationseffizienz von NusA wahrscheinlich über eine Stabilisierung der schwachen RNAP-lambda N-Interaktion. Der Vergleich der Struktur von AR1 im ungebundenen Zustand mit der kürzlich gelösten Röntgenkristallstruktur des NusA(350-424)-lambda N(34-47)-Komplexes unterstützt die Hypothese, daß die NusA-lambda N-Wechselwirkung nicht direkt am Mechanismus der Antitermination beteiligt ist, da nur geringe konformationelle Änderungen durch die Komplexbildung beobachtet werden. Insgesamt stellt NusACTD über seine beiden (HhH)2-Module eine vielseitige Interaktionsfläche bereit, die möglicherweise Bindungsstellen für weitere Proteine neben alpha CTD und lambda N bietet. Die Trennung der Domänen über eine mobile Linkerregion ermöglicht eine Anpassung an konformationelle Veränderungen in der TEC-Struktur, die zum Beispiel beim Übergang des TEC von einem Elongations- in einen Antiterminationszustand auftreten können. Die flexible Verbindung zwischen den Domänen ist zudem für den Mechanismus der Autoinhibition wichtig, da bei der Bindung von NusA an den TEC die RNA Zugang zu den Bindungsstellen erhält.
