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Untersuchung des Beitrags von Nicotianaminsynthase zur Zinkhyperakkumulation in Arabidopsis halleri
(2012)
- Zinkdefizienz gehört zu den am meisten verbreiteten Nährstoffmangelerkrankungen weltweit (White and Broadley, 2009). Die Züchtung von zinkreicheren Anbaupflanzen könnte durch ein besseres Verständnis der Mechanismen pflanzlicher Zinkhyperakkumulation erleichtert werden. Hyperakkumulierer sind dazu in der Lage, mehr als hundertmal mehr Zink in den Blättern anzureichern als normale Pflanzen. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Nicotianaminsynthase 2 (NAS2) in den Wurzeln der zinkhyperakkumulierenden und -hypertoleranten Pflanze Arabidopsis halleri um ein Vielfaches stärker exprimiert ist, als im Nicht-Hyperakkumulierer Arabidopsis thaliana (Weber et al., 2004; Weber et al., 2006). Diese Tatsache machte NAS2 zu einem wichtigen Kandidatengen für die Zn-Hyperakkumulation, wobei es aufgrund von Ergebnissen aus Hefevorexperimenten auch zu einem Kandidatengen für die Zn-Hypertoleranz wurde (Weber et al., 2004). NAS2 katalysiert die Bildung des Metallchelators Nicotianamin (NA) aus drei Molekülen S-Adenosyl-Methionin (SAM) (von Wiren et al., 1999). Die Kernaufgabe dieser Dissertation war, einen potentiellen Zusammenhang zwischen der in A. halleri erhöhten NAS2-Expression und der Hyperakkumulation von Zink zu untersuchen. Dafür wurden A. halleri Populationen von metallkontaminierten und von unbelasteten Standorten sowie AhNAS2 RNAi-Linien untersucht und charakterisiert. Sowohl die AhNAS2-Transkritniveaus als auch die Nicotianamingehalte waren in den Wurzeln aller getesteten Individuen der verschiedenen Arabidopsis halleri Populationen signifikant höher als in Arabidopsis thaliana. Des Weiteren konnte in den Experimenten mit AhNAS2 RNAi-Pflanzen gezeigt werden, dass diese erhöhte AhNAS2-Expression und daraus resultierende höhere NA-Gehalte in den Wurzeln zur Hyperakkumulation von Zink beitragen. In Linien mit starkem AhNAS2 RNAi-Effekt wurden im Vergleich zum Wildtyp signifikant höhere Zinkkonzentrationen in den Wurzeln gemessen, wobei im Spross das Gegenteil der Fall war. Das Verhältnis von Sprosszinkgehalt zu Wurzelzinkgehalt ist in einer hyperakkumulierenden Pflanze größer als 1 und lag in der vorliegenden Arbeit in Wildtyppflanzen und Kontroll-RNAi-Linien jeweils über dem Wert 15. In den starken RNAi-Linien konnte dieser Wert einzig durch die Herunterregulierung der AhNAS2-Transkriptmengen unter 4 gesenkt werden. Dieses Ergebnis untermauert die Hypothese, dass Nicotianamin eine wichtige Rolle in der Zinkhyperakkumulation in A. halleri spielt. In Zinklokalisierungsexperimenten mit dem fluoreszenten Farbstoff Zinpyr-1 konnten die in den ICP-OES-Analysen erhaltenen Unterschiede zwischen Wurzelzinkgehalt im Wildtyp und der starken Linie 1-2 mit einem konfokalen Lasermikroskop bestätigt werden. Die höheren Zinkgehalte im Sprossgewebe des Wildtyps waren sowohl im hydroponischen Wachstumsmedium als auch in Experimenten mit artifiziell kontaminierter Erde und unter fast natürlichen Bedingungen mit kontaminierter Erde von nativen A. halleri Standorten im Harz konsistent. Analysen zur Speziierung und Zinkverteilung zeigten, dass in den Wurzeln von A. halleri Zink-Nicotianamin-Komplexe gebildet werden, welche die Xylembeladung erleichtern. Diese Entdeckung besitzt hohe Relevanz für die Entwicklung von Biofortifikationsanwendungen. In Toleranzexperimenten konnte gezeigt werden, dass Cadmiumkonzentrationen bis 2 µM im hydroponischen Wachstumsmedium keine toxischen Effekte, weder auf A. halleri Wildtyp- noch auf AhNAS2 RNAi-Pflanzen hatten. Im Gegensatz dazu bildeten alle getesteten Linien nach Zugabe von 10 µM Cd2+ bzw. 5 µM Ni2+ zum Medium starke Chlorosen aus. Die Wurzellängen der getesteten Linien unterschieden sich nach Cadmiumzugabe nicht, während das Wurzellängenwachstum in Gegenwart von zusätzlichem Ni2+ in den starken RNAi-Linien verglichen mit dem Wildtyp signifikant reduziert war. Unter den getesteten Konzentrationen zeigte sich somit die Verbindung von NA zur Nickeltoleranz, nicht jedoch zur Cadmiumtoleranz. Des Weiteren wurden hydroponische Toxizitätsexperimente mit einer externen Zinkkonzentration von 300 µM durchgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollbedingungen führte dieser erhebliche Zinküberschuss zu einem deutlich verbesserten Sprosswachstum aller Pflanzen, wobei keine der getesteten Linien Toxizitätssymptome aufwies. In Microarrayanalysen konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der NA-Gehalte in A. halleri Wurzeln keine Sekundäreffekte auf andere Metallhomöostasegene zur Folge hat. Nur wenige Gene waren verglichen mit dem Wildtyp in der starken RNAi-Linie induziert, wobei ein für ein “defensin-like protein“ codierendes und eines, welches für die Bildung eines “dual specificity protein“ verantwortlich ist, sowohl unter Kontrollbedingungen als auch nach Zinkbehandlung mindestens vierfach hochreguliert waren. Zusammenfassend kann angemerkt werden, dass mit NAS2 der zweite wichtige Zinkhyperakkumulationsfaktor neben HMA4 (Hanikenne et al., 2008) identifiziert werden konnte.
