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Strukturelle Untersuchungen an dem Radikalenzym (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase
(2011)
- In der Natur werden viele chemisch schwierige Reaktionen von Radikalenzymen katalysiert. Die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase katalysiert die Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA in der Fermentation von L-Leucin im humanpathogenen Bakterium Clostridium difficile. Im Gegensatz zu einer Vielzahl von Radikalenzymen, wie beispielsweise der Coenzym B12-abhängigen bakteriellen Klasse II Ribonukleotid-Reduktase oder der S-Adenosylmethionin-abhängigen Biotin-Synthase, benötigt die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase keine komplexen Kofaktoren zur Erzeugung des katalytisch aktiven Radikals. Stattdessen verwendet sie ein einzelnes, hoch energetisches Elektron. Bei der Dehydratisierung – einer atypischen α/β-Eliminierung – werden reduktiv Ketylradikale im Substrat erzeugt. Die Dehydratase muss zunächst aktiviert werden, indem ein Aktivator, der ein [4Fe-4S]-Zentrum enthält, unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase überträgt. Für den Aktivator werden im Laufe des Aktivierungsprozesses Nukleotid- und redox-abhängige Konformationsänderungen angenommen. Das hoch reaktive Elektron wird nach jedem Substratumsatz wieder auf die Dehydratase übertragen, so dass bis zu 10.000 Umsätze katalysiert werden können, bevor eine erneute Aktivierung notwendig ist. Die strukturelle Grundlage der Aktivierung sowie die Art und Weise, wie das aktive Elektron in der Dehydratase nach erfolgtem Umsatz wiedergewonnen und vor Verlust durch unspezifische Nebenreaktionen geschützt wird, ist unbekannt. In dieser Arbeit konnte zunächst die Struktur der homodimeren (E)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase gelöst werden, die in der Fermentation von L-Leucin den zweimaligen Transfer eines Coenzym A-Moleküls katalysiert. Sie gehört zur Familie III der CoA-Transferasen und besitzt deren typische Faltung. Ein Aspartatrest im aktiven Zentrum ist wahrscheinlich an der Ausbildung von kovalenten Intermediaten beteiligt. Es wurden die Strukturen des reduzierten Aktivators ohne Nukleotid, mit ADP und mit dem ATP-Analogon ADPNP bestimmt. Der homodimere Aktivator gehört zur Actin-Faltungsfamilie und die Monomere sind durch ein verbrückendes [4Fe-4S]-Zentrum miteinander verbunden. Jedes Monomer besteht aus zwei Domänen, die in Abwesenheit eines Nukleotids eine offene und in Gegenwart eines Nukleotids eine geschlossene Konformation einnehmen. Die Strukturen des reduzierten Aktivators mit gebundenem ADP und ADPNP zeigten keine signifikaten Konformationsunterschiede. Der Vergleich mit der Struktur eines oxidierten Aktivators ergab, dass auch die Reduktion des [4Fe-4S]-Zentrums offenbar keine strukturellen Änderungen zur Folge hat. Möglicherweise spiegeln die Strukturen, die alle mittels Röntgenkristallographie bestimmt wurden, jedoch nicht die konformationelle Flexibilität in Lösung wider. Erstmals wurde die Komplexbildung zwischen dem Aktivator und der Dehydratase mittels ADPNP nachgewiesen. Die Strukturen des Aktivators legen nahe, dass die Komplexildung über den Prozess der konformationellen Selektion geschieht. Die Struktur der Dehydratase zeigte, dass das heterodimere Protein zwei [4Fe-4S]-Zentren in einem Abstand von 12 Å beinhaltet. Jedes Fe/S-Zetrum ist von drei Cysteinresten und einem terminalen Liganden koordiniert. Das Fe/S-Zentrum in der α-Untereinheit ist Teil des aktiven Zentrums und besitzt in Abwesenheit von Substrat ein Hydroxyidion/Wassermolekül als vierten Liganden. Das Substrat ersetzt diesen Liganden und koordiniert das Fe/S-Zentrum mit dem Carbonylsauerstoffatom der Thioestergruppe. Das [4Fe-4S]-Zentrum in der β-Untereinheit hat eine Sulfhydryl-/Sulfidogruppe als terminalen Liganden und fungiert als Speicher für das Elektron, wenn kein Substrat anwesend ist. Die Struktur der (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase dient als Modell für die Familie der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen und der Gruppe der phylogenetisch verwandten Benzoyl-CoA-Reduktasen.
