Refine
Keywords
- Nitrosomonas europaea (1) (remove)
-
Molekulare und physiologische Charakterisierung des Energiestoffwechsels von Nitrosomonas europaea
(2010)
- Die lösliche Ammoniak-Monooxygenase (AMO) aus Nitrosomonas europaea ist in ungefähr der gleichen Menge wie die membrangebundene AMO vorhanden. Beide Formen sind in vivo aktiv und besitzen eine ähnliche spezifische Aktivität. Die lösliche AMO ist ein Cu-, Fe- und möglicherweise auch Zn-haltiges Enzym und besteht aus den Untereinheiten AmoA (27 kDa), AmoB (42 kDa) und Cytochrom c1 (24 kDa). Das Enzym weist dabei eine heterotrimere Alpha3-Beta3-Gamma3-Untereinheitenstrukur mit einer molekularen Masse von etwa 316 kDa auf. Die AmoB-Untereinheit der löslichen AMO besitzt dabei eine Signalsequenz von 25 Aminosäuren. Die An- beziehungsweise Abwesenheit des Signalpeptides könnte die Konformation der AMO so weitreichend beeinflussen, dass daraus sowohl ein löslicher als auch ein membrangebundener AMO-Komplex resultiert. Das gereinigte Enzym koordiniert in vitro 9,5 Cu-, 3,9 Fe- und 0,45 bis 2,6 Zn-Atome. Nach Reduktion der löslichen AMO werden im Absorptionsspektrum die für Cytochrome des c-Typs charakteristischen Absorptionsbanden ersichtlich. Elektronspinresonanz-Spektren von luftoxidierter löslicher AMO bei einer Temperatur von 50 K weisen auf die Existenz von ein oder mehreren Typ-2-Cu(II)-Zentren hin. Bei einer Temperatur von 10 K wird sowohl ein für Häm-gebundenes Eisen als auch ein für nicht Häm-gebundenes Eisen charakteristisches Signal ersichtlich. Durch Vergleich der Cu(II)-Konzentration mit dem Gesamtgehalt an Cu konnte ermittelt werden, dass die lösliche AMO etwa sechs paramagnetische Cu(II)-Atome und drei diamagnetische Cu(I)-Atome koordiniert. Der substratanaloge kompetitive Hemmstoff Acetylen wird von der löslichen AMO zu einem Keten oxidiert. Dieses reaktive Intermediat bindet in der Folge kovalent an His 191 (AmoA). Die Bindung von Keten setzt dabei ein Cu(I)-Atom pro AmoA-Untereinheit frei und führt somit zu einer irreversiblen Hemmung der AMO. His 191 aus AmoA ist dementsprechend an der Koordination eines Cu(I)-Zentrums beteiligt welches die Oxidation von Ammoniak katalysiert. Die lösliche AMO katalysiert die Disproportionierung von Hydroxylamin zu Ammoniak, Nitrit und Nitrat nach folgender Reaktionsgleichung: 3,2 NH2OH + 2 NH3 + 0,8 NO3– --> 0,4 NO2– + 3,6 H+ + 2,4 e– Die Reaktion besitzt das Temperaturoptimum zwischen 45 und 50 °C, das pH-Optimum bei einem pH-Wert von 8,5 und wird weder von Licht noch von Sauerstoff beeinflusst. Die maximale spezifische Aktivität der Disproportionierung liegt bei etwa 1.000 nmol NH2OH (mg AMO)-1 min-1 und der Km-Wert für Hydroxylamin beläuft sich auf ungefähr 140 µM. Acetylen besitzt keinen Einfluss auf die Aktivität der Disproportionierung, jedoch wirkt Hydrazin als kompetitiver Hemmstoff für die Umsetzung von Hydroxylamin durch die lösliche AMO. Eine Disproportionierung von Hydroxylamin konnte auch bei intakten Nitrosomonas-Zellen beobachtet werden, welche so einer Akkumulation von Hydroxylamin entgegenwirken. Es ist denkbar, dass die Disproportionierung von Hydroxylamin einen Mechanismus darstellt, mittels dessen sich N. europaea vor toxischen Hydroxylaminkonzentrationen schützt und dabei gleichzeitig ihr Substrat Ammoniak zurückgewinnt. Weiterhin gelang es im Zuge dieser Arbeit die Existenz eines funktionellen Ammoniaktransporters vom Rhesus-Typ (Rh1) in N. europaea zu beweisen. Der passive Rh1-Transporter ermöglicht sowohl die Aufnahme von Ammoniak als auch von Methylammonium (MA) in das Cytoplasma von N. europaea. Die Menge an transportiertem MA korreliert dabei mit der Expression von Rh1. Der Km-Wert für MA beträgt dabei 1,8 mM bei einem pH-Wert von 7,25. Die Aufnahme von MA konnte vollständig durch Ammonium gehemmt werden [Ki(NH4+) = 0,3 mM]. Ein niedriger periplasmatischer pH-Wert (pH 5 - 6) während der Ammoniakoxidation scheint eine Akkumulation von Ammonium im Periplasma zu bewirken („Säurefalle“) und Rh1 ermöglicht in der Folge einen raschen Konzentrationsausgleich von NH3 mit dem Cytoplasma. In aerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen korrelieren die spezifische Aktivitäten der Ammoniakoxidation, der Reduktion von Nitrit, als auch die Wachstumsrate mit den Transkriptionsintensitäten der zugehörigen Gene amoA/hao/rh1, nirK/norB und cbbL/ftsZ. Die Konzentration von amoA-, hao-, rh1-, coxA-, cbbL, ftsZ- und sodB-mRNA in anaerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen war im Bezug auf aerob Ammoniak-oxidierende Nitrosomonas-Zellen reduziert, die Konzentration an nirK- and norB-Transkript dagegen aber erhöht. Während anaerober Denitrifikation (Pyruvat dient als Substrat) stieg die Transkription der Gene nirK, norB, aceE, gltA, und odhA deutlich an. Die Konzentrationen von amoA-, hao-, rh1-, coxA-, cbbL-, ftsZ- und sodB-mRNA war im Vergleich zu aerob und anaerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen allerdings signifikant erniedrigt.
