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DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors ABF1 aus S. cerevisiae: Spezifität und Kontaktpunkte
(2002)
- Das ABF1-Protein aus S. cerevisiae ist als ein multifunktioneller, dsDNA-bindender Transkriptionsfaktor bekannt, der nicht nur Transkriptionsprozesse in der Zelle reguliert, sondern auch an der DNA-Replikation und einer Nukleosomen-Rekonfiguration bzw. Änderung der Chromatinstruktur beteiligt ist. Da das Protein in verschiedenen Zusammenhängen immer wieder gefunden wurde, kann man davon ausgehen, dass es in den Zellprozessen eine essentielle Rolle spielt. Aus diesem Grund war es von besonderem Interesse, den zentralen Punkt der ABF1-Funktion – nämlich die Erkennung und Bindung des zugehörigen DNA-Elements – zu untersuchen und zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro Experimente zur Klärung dieser Fragen verwendet, wobei ein besonderes Augenmerk auf der Identifizierung der Kontaktpunkte lag. Die Experimente stützen sich auf die Literaturdaten über das spezifische DNA-Erkennungsmotiv 5’-CGTNNNNRRYGAY (konservierte Nukleotide sind unterstrichen) sowie über die strukturellen Domänen von ABF1 (Zink-Finger-Motiv, Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH) und C-terminale Transaktivierungsdomäne). Mittels Gelretardationsexperimenten mit verschiedenen DNA-Sonden wurde gezeigt, dass ABF1 einen richtungsorientierten DNA-Bindungsmechanismus aufweist und eine Neigung zur Oligomerisierung besitzt. Die DNA-Bindungsaffinität ist stark von der Sondenlänge abhängig – die Verkürzung des DNA-Fragments von 27 auf 20 bp verringert die Bindung um eine Größenordung – , die Zusammensetzung des variablen Bereichs des Konsensusmotivs hingegen beeinflusst die Bindung nur geringfügig. Offenbar finden nur wenige ABF1-DNA-Kontakte im variablen Bereich statt, wie durch fehlgepaarte ARS1-Fragmenten nachgewiesen werden konnte. Um das ABF1-Erkennungsmotiv einzuschränken bzw. besser zu beschreiben, wurde ein in vitro DNA-Selektionsverfahren (SELEX) eingesetzt. Mit diesem Ansatz wurden zwei dsDNA-Aptamere identifiziert, die am häufigsten im selektierten DNA-Pool vorkommen und eine bis zu 20fach höhere DNA-Bindungsaffinität im Vergleich zu einem ARS1-Fragment aufweisen. Von den selektierten ABF1-Erkennungsmotive konnten die meisten im S. cerevisiae Genom wiedergefunden werden. Die Sequenzanalyse der selektierten Aptamere führte zur Erweiterung des Konsensusmotivs (5’-TACCGTATNNNATGATGT) im Vergleich zur bisher formulierten ABF1-Erkennungssequenz 5’-CGTNNNNRRYGAY. Mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie wurde die ABF1-DNA-Bindungsreaktion in Bezug auf Thermodynamik und Kinetik genauer charakterisiert. Anhand der im analysierten Temperatur- (10-35°C) und Salzkonzentrationsbereich (100-300 mM NaCl) gemessenen Geschwindigkeits- und Gleichgewichtskonstanten konnten auf die Bildung von 6-7 ionischen Kontakten bei der spezifischen ABF1-ARS1-Wechselwirkung geschlossen werden. Dabei ist die Dissoziationsgeschwindigkeit sehr stark von der Ionenstärke abhängig. Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante kA dagegen ist nur wenig von den externen Bedingungen abhängig, zeigt aber – im Gegensatz zu kD – eine deutliche Sequenzspezifität. Aus der Temperaturabhängigkeit der thermodynamischen Parametern lässt sich schließen, dass die ABF1-DNA-Bindung bei physiologischen Temperaturen eine enthalpiekontrollierte Reaktion darstellt. In der ABF1-Struktur sind das Zink-Finger- sowie das HTH-Motiv als potenzielle DNA-Bindungsdomänen bekannt. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der DNA-Bindedomäne sowie die Identifizierung von den DNA-kontaktierenden Aminosäuren. Dafür wurde ein 27 bp langes, I5dU-substituiertes ARS1-Fragment mit ABF1 durch UV-Bestrahlung quervernetzt. Ein limitierter Trypsin-Verdau des Quervernetzungsprodukts sowie die Ergebnisse einer chemischen Spaltung mit NTCB und Hydroxylamin legten nahe, dass nur das Zink-Finger-Motiv eine Quervernetzung mit dem untersuchten ARS1-Fragment eingeht. Die vollständige Spaltung des Quervernetzungsproduktes mit Trypsin und PDE I/II lieferte ein Peptid-Nukleotid-Addukt, das mittels MALDI-MS charakterisiert wurde. Es gelang, das Peptid NSHR aus der Zink-Finger-Region zu identifizieren, das höchstwahrscheinlich über His57 einen spezifischen DNA-Kontakt mit dem IdU-Rest an Position 8 im ARS1-Oligonukleotid bildet. Damit ist die Beteiligung des Zn-Fingers des ABF1-Proteins an der DNA-Bindung eindeutig nachgewiesen.
