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Charakterisierung thermophiler Cellulasen aus Sulfolobus solfataricus und Thermotoga maritima
(2010)
- Die Cellulase SSO1949 aus dem hyperthermophilen Archaeon S. solfataricus P2 ist aufgrund ihrer extremen thermo- und acidophilen Eigenschaften interessant für industrielle Anwendungen. 2005 wurde das 37 kDa grosse Enzym biochemisch charakterisiert und weist ein pH- und Temperaturoptimum von ca. 1.8 und ca. 80°C auf. Auf ein N-terminales Signalpeptid folgt eine Ser/Thr-reiche Region, an welche die katalytische Domäne anschliesst, die Sequenzähnlichkeiten zu anderen Mitgliedern der Glykosidhydrolase-Familie 12 aufweist. Für biotechnologische Anwendungen muss SSO1949 möglichst kostengünstig in grossen Mengen produziert werden. In E. coli wird SSO1949 rekombinant in unlöslicher Form („Inclusion Bodies“) überexprimiert. Die Aggregation des Proteins konnte auch durch Koexpression mit Chaperonen, Verkürzung der Ser/Thr-reichen Region sowie des C-Terminus, Deletieren des hydrophoben Loops innerhalb der konservierten Region und Fusion mit verschiedenen Proteinen nicht verhindert werden. In dieser Arbeit wurde eine Strategie entwickelt, SSO1949 aus „Inclusion Bodies“ denaturierend zu reinigen und das inaktive Enzym anschliessend in seine aktive Form zu überführen. Das geschah durch schnelles Verdünnen des Proteins in Rückfaltungspuffer. Die anschliessende Aufkonzentrierung gestaltete sich schwierig, dennoch konnte SSO1949 in dieser Arbeit enzymatisch charakterisiert werden. Im katalytischen Zentrum von SSO1949 befinden sich zwei konservierte Glutamatreste (E213 und E310). Durch Modellstrukturanalysen konnten in der Umgebung der katalytischen Reste Aminosäuren identifiziert werden, die möglicherweise für die extreme Acidophilie von SSO1949 verantwortlich sind. Durch gezielten Austausch dieser Aminosäuren wurde untersucht, inwiefern das pH-Optimum des Enzyms verschoben werden kann. Den grössten Einfluss zeigte die Mutation der Aminosäure Threonin 137 zu Asparagin, bei der sich das pH-Optimum von SSO1949 von 1.8 auf 3.4 verschob. Dieser Effekt konnte bereits bei Mutation der homologen Aminosäuren in Xylanasen von in Aspergillus kawachii, Streptomyces sp. und Bacillus circulans beobachtet werden. Da sich E. coli nicht als geeignetes Expressionssystem für SSO1949 herausstellte, wurde in dieser Arbeit dazu übergegangen, das Enzym unter den Bedingungen zu exprimieren, unter denen es natürlicherweise exprimiert wird, nämlich in dem Crenarchaeot Sulfolobus. Seit 2007 steht für Sulfolobus acidocaldarius ein Shuttle-Vektor-System zur Verfügung, in welchem SSO1949 unter Kontrolle verschiedener induzierbarer und konstitutiver Promotoren exprimiert wurde. Darüberhinaus wurde SSO1949 zur stabileren Proteinexpression auch ins Genom von S. acidocaldarius integriert. Durch Verwendung von uracilauxotrophen pyrEF-defizienten Mutanten wurde eine effiziente Selektion erreicht. Als selektive Marker für die Uracil-Selektion dienten die funktionsfähigen pyrEF-Gene aus Sulfolobus solfataricus P2, welche für Enzyme des Uridinmonophosphat-Syntheseweges codieren. SSO1949 zeigt 85% Sequenzidentität zu einer weiteren Endoglukanase aus Sulfolobus solfataricus. Bei der Cellulase SSO1354 handelt es sich um eine extrazelluläre Cellulase, die nicht frei ins Medium sekretiert wird, sondern mit der Zelloberfläche assoziiert bleibt. Auch SSO1949 ist sowohl in der Membranfraktion als auch im Kulturüberstand zu finden und kann aus beiden Fraktionen aufgereinigt werden. Die Aufeinigung von SSO1949 gestaltete sich schwierig und seine Identität konnte nicht massenspektrometrisch bestätigt werden. Aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zu SSO1949 wurden zwei weitere Cellulasen der Glykosidhydrolase-Familie 12 für Mutationsstudien im aktiven Zentrum ausgewählt. CelA aus Thermotoga maritima und EglA aus Pyrococcus furiosus wurden bereits in früheren Arbeiten charakterisiert und weisen ebenfalls extreme Hitzestabilität auf mit einem pH-Optimum im leicht sauren Bereich bei pH 6. Durch gezielten Austausch von Aminosäuren im katalytischen Zentrum der beiden Glukanasen gegen die homologen Aminosäuren in SSO1949 sollte ihr pH-Optimum weiter ins saure Milieu verschoben werden. Die Punktmutationen im aktiven Zentrum von CelA führten jedoch lediglich zu einer Verschiebung des pH-Optimums um eine pH-Stufe in den sauren Bereich. Bei allen Mutanten wurde die cellulolytische Aktivität in Mitleidenschaft gezogen. Abschließend wurde ein Hybridprotein aus den beiden Cellulasen SSO1949 aus Sulfolobus solfataricus und CelA aus Thermotoga maritima generiert, welches die Eigenschaften der besseren Löslichkeit und Acidophilie erfolgreich in einem Protein vereint. Das neu entstandene Fusionsprotein wird zwar noch immer unlöslich in E. coli exprimiert, kann jedoch im Gegensatz zu SSO1949 mit milderen Denaturierungsmitteln aus „Inclusion Bodies“ gelöst werden. Nach erfolgreicher Rückfaltung zeigte das funktionsfähige Hybridprotein ein Temperaturoptimum von ca. 85°C und ein pH-Optimum von ca. pH 3.
