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Molekulare Grundlagen der Erdnussallergie: Rekombinante Darstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung und Struktur der Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6
(2003)
- Die Erdnussallergie stellt auf Grund ihrer Verbreitung und der Stärke der ausgelösten Reaktionen ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Der derzeit einzige Schutz vor den typischen Symptomen besteht in einem absoluten Verzicht auf erdnusshaltige Lebensmittel. Folglich stellt die Charakterisierung von Erdnussallergenen eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Ansätzen dar. Als Grundlage für biochemische und biophysikalische Studien wurde eine rekombinante Expressionsstrategie zur Herstellung von authentisch gefaltetem Ara h 2 und Ara h 6 in dieser Arbeit entwickelt. Die Strategie zur effizienten Präparation großer Mengen Protein basiert auf der Anwendung spezieller E. coli Stämme mit oxidativem Cytoplasma und eignet sich zur Expression nativ gefalteter und disulfidverbrückter rekombinanter Erdnussallergene vom 2S Albumintyp und mit hoher Wahrscheinlichkeit weiterer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die Integrität der Sekundär- und Tertiärstruktur, der Disulfidverbrückung und der immunologischen Reaktivität der rekombinanten Proteine wurde am Beispiel von Ara h 2 mit Hilfe von natürlichem Protein aus der Erdnuss verifiziert. Die Verfügbarkeit von authentischen rekombinanten Erdnussallergenen eröffnet neue Möglichkeiten für eine verfeinerte Diagnose allergischer Erkrankungen und für die Entwicklung von spezifischen Immuntherapien. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass sich die Allergene Ara h 2 und Ara h 6 durch eine außerordentliche Stabilität gegenüber thermaler Denaturierung und proteolytischem Abbau auszeichnen. Durch CD spektroskopische Studien wurde eine Disulfidbrücken abhängige Stabilität der Sekundärstruktur bis 373 K nachgewiesen. Die Resistenz gegenüber Verdauungsreaktionen wurde an Hand der Enzyme Trypsin und Chymotrypsin untersucht. Der proteolytische Verdau von Ara h 2 und Ara h 6 resultierte in der Ausbildung heterodimerer immunologisch aktiver Produkte. Der proteolytische Angriff erfolgt innerhalb zweier definierter Bereiche. Die resistenten Kernbereiche der Proteine beinhalten eine Reihe von vor Proteolyse geschützten Schnittstellen. Die Faltungen der unverdauten Proteine und der proteaseresistenten Kernbereiche sind nahezu identisch. Die proteaselabilen Bereiche weisen keine reguläre Sekundärstruktur auf und sind von einer signifikanten Flexibilität geprägt. Die für die Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6 nachgewiesene Stabilität stellt ein wichtiges Merkmal der Lebensmittelallergene dar. Je länger ein möglichst großer Proteinabschnitt intakt bleibt, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Immunantwort ausgelöst werden kann und umso stärker wird diese ausfallen. In der vorliegenden Arbeit konnte die Lösungsstruktur des proteaseresistenten Ara h 6-Kerns bestimmt und charakterisiert werden. Die resultierende Struktur besteht aus fünf alpha-Helices, die einen vor enzymatischer Spaltung geschützten kompakten Kernbereich ausbilden. Die ermittelte Struktur stellt die erste experimentell bestimmte dreidimensionale Struktur eines Erdnussallergens und die erste hochaufgelöste Struktur eines 2S Albumins dar. Die globale Faltung von Ara h 6 aus der Erdnuss ähnelt weiteren Pflanzenproteinen: den nichtspezifischen Lipidtransferproteinen, den Amylase/Trypsin-Inhibitoren und dem hydrophoben Protein aus Sojabohne. Eine wichtige Frage betrifft die Lokalisation der IgE bindenden Epitope. In früheren Studien konnten in Ara h 6 keine linearen IgE reaktiven Epitope identifiziert werden, für Ara h 2 wurden hingegen drei immunodominante Regionen beschrieben. Um die Frage nach der Lokalisation dieser Epitope innerhalb der dreidimensionalen Struktur von Ara h 2 zu klären, wurde ein molekulares Modell des Proteins auf der Basis der experimentell gelösten Ara h 6 Struktur erstellt. Sämtliche Epitope befinden sich in einem ausgedehnten Schleifenbereich und am aminoterminalen Ende des Proteins. Dieser Befund weist in Kombination mit der Kenntnis, dass die Multivalenz eines Allergens eine Voraussetzung für das Auslösen einer allergischen Antwort darstellt und mit ihrer Intensität korreliert, stark auf die Existenz von konformationellen Epitopen in Ara h 6 und Ara h 2 hin. Die Präsentation von stabilen konformationellen Epitopen auf Mastzellen führt im Allgemeinen zu einer effizienteren und stärkeren Mediatorausschüttung. Dies ist mit den beobachteten starken klinischen Symptomen bei Patienten mit Erdnussallergie konsistent. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Stabilität und Kompaktheit der Struktur sowie das potentielle Vorhandensein von konformationellen Epitopen eine Erklärung für die extreme Allergenizität der Erdnussallergene liefern kann. Die Identifizierung von IgE-bindenden Epitopen auf der Basis der dreidimensionalen Struktur der Erdnussallergene liefert eine Grundlage für die Entwicklung von veränderten Proteinen mit reduzierter Allergenizität, dem Verständnis von Kreuzallergien und der Entwicklung neuer Therapieformen.
