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Molekularbiologische Gewinnung von RNase 40-124 Fragmenten zur Synthese von einheitlichen Glycoproteinen durch native chemische Ligation
(2007)
- Die Bereitstellung von einheitlichen Glycoproteinen ist wegen der Mikroheterogenität und der Probleme bei der Isolierung aus natürlichen Quellen eine ungelöste Aufgabe. Nur mit homogenem Material sind detaillierte Untersuchungen der Struktur-Wirkungsbeziehung möglich, was zur Optimierung von therapeutischen Glycoproteinen verwendet werden kann. Deshalb sollten Methoden zur Totalsynthese von uniformen Glycoproteinen etabliert werden. Dazu sollte die chemoselektive Reaktion von Thioestern und molekularbiologisch gewonnenen Fragmenten mit N-terminalem Cys über die native chemische Ligation (NCL) ausgenutzt werden. Diese Methode sollte mit dem Modellprotein Ribonuclease 1-124 entwickelt werden. Zur Synthese der RNase durch NCL wurde das Cys 40 als Ligationsstelle gewählt. Das Fragment 40-124 B mit N-terminalem Cys sollte mit dem Thioester Met-RNase 1-39 A bzw. glycosylierten Varianten über sequentielle Ligationsschritte zur RNase ligiert werden. Zur Gewinnung des N-terminalen Cys-fragmentes 40-124 B der RNase wurde das pTWIN-Expressionssystem verwendet, das die autokatalytische Spaltung von Inteinen ausnutzt. Durch Expression des Plasmids pTWINcp1 in E. coli konnte das Fusionsprotein als unlösliche IBs erhalten werden. Diese wurden gereinigt, solubilisiert und unter optimierten Bedingungen rückgefaltet. Trotz einer fast vollständigen Inteinspaltung konnte das oxidationsempfindliche und möglicherweise unlösliche Zielpeptid RNase 40-124 B nicht isoliert werden. Deshalb wurden die sieben Cys von B vor der Rückfaltung und Inteinspaltung durch gemischte Disulfide geschützt. Die Reaktion mit GSSG oder DTDP ergab eine Mischung von Peptiden 1, 3, 5 und 7 modifizierten Cys. Die vollständige Reaktion aller Cys gelang mit 2-Carboxyethyl-methanthiosulfonat, jedoch bei geringerer Spaltungseffizienz des Inteins. Nach Reinigung mittels RP-HPLC konnte das 7-fach geschützte und nicht mehr oxidationsempfindliche Fragment 3 in einer Ausbeute von 3.5 mg pro Liter Medium erhalten werden. Die Ligationsfähigkeit der modifizierten Fragmente 1 und 2 wurde mit den Thioester Met-RNase 1-39 4 und dem Glyco-Thioester RNase 30-39 8 untersucht und die Reaktion zu 5 und 9 durch LC-MS bestätigt. Mit Hilfe des vollständig modifizierten Fragmentes RNase 40-124 3 konnte unter optimierten Ligationsbedingungen die vollständige Met-RNase 1-124 5 erhalten werden und nach einem Rückfaltungsschritt die enzymatische Aktivität durch Hydrolyse von 2’,3’-CMP nachgewiesen werden. Die Synthese von glycosylierter RNase 1-124 sollte durch eine sequentielle Ligationsstrategie versucht werden. Dazu wurde das Fragment 1-39 in den Thioester 1-25 F und den glycosylierten Thioester 26-39 D geteilt, dessen N-terminales Cys durch verschiedene Schutzgruppen maskiert wurde. Die Ligation zwischen dem vollständig SCE-geschützten Fragment RNase 40-124 3 und den Thioestern Thz-26-39 15 bzw. Mapoc-26-39 20 konnte durchgeführt werden. Die Ligation zu 16 bzw. 21 und die Abspaltung der Schutzgruppen unter Freisetzung des N-terminalen Cys konnte mittels LC-MS nachgewiesen werden. Zwar konnte nach der Öffnung des Thiazolidinringes mit Methoxyamin eine Ligation mit dem Thioester RNase 1-25 18 zur vollständigen RNase 1-124 19 nachgewiesen werden, allerdings reagierte der größte Teil des Thioesters mit Methoxyamin zum Methoxyamid. Deshalb wurde anstelle der sequentiellen Eintopf-Ligationsstrategie ein Syntheseweg mit Isolierung des Ligationsproduktes 26-124 nach der Methoxyaminentschützung angewandt. Diese Methode konnte mit den Ligationsprodukten RNase Thz-26-124 24 und 28 etabliert werden. Die entschützten Produkte wurden mit einer Ausbeute von 44 % bzw. 74 % isoliert und mit dem Thioester 18 zu den RNasen 26 und 30 ligiert. Nach einer Rückfaltung der synthetischen Proteine konnte mit einem Assay deren Aktivität nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse konnten zur Synthese der kompletten RNase 1-124 34 mit einem Nonasaccharid an Asn34 angewandt werden. Die Isolierung des entschützten Ligationsproduktes 33 aus der Reaktion von RNase 40-124 3 mit dem Glycopeptidthioester RNase Thz-26-39 31 gelang mit einer Ausbeute von 48 %. Das Produkt wurde mit 18 zur Reaktion gebracht und zurückgefaltet. Nach Reinigung mittels Gelfiltration konnte das native Enzym 34a in einer Ausbeute von 71 % gewonnen werden. Die RNase-Aktivität des synthetischen Glycoproteins 34a wurde durch Vergleich mit der Aktivität von RNase A mit einem kcat/Km-Wert von 9.6 x 102 M-1 s-1 bestimmt (RNase A = 5.6 x 103, RNase B = 1.5 x 103 M-1 s-1). In dieser Arbeit konnte eine reproduzierbare Methode zur molekularbiologischen Gewinnung von Fragmenten mit N-terminalem Cys etabliert werden. Mit Hilfe eines rekombinanten RNase-Fragmentes und den entprechenden Thioestern bzw. Glycopeptidthioestern konnte erstmals ein biologisch aktives, homogenes RNase-Glycoprotein mit komplexem N-Glycan erhalten werden. Diese Strategie sollte auf die Synthese von biochemisch und therapeutisch interessanten Proteinen übertragbar sein.
