Refine
Keywords
- Glykokonjugation (1) (remove)
-
Chemische Modifikation von siRNAs zur Verbesserung der zellulären Aufnahme
(2006)
- Um therapeutisch wirksam zu sein, muss eine siRNA die Zellmembran überwinden und ins Zytoplasma gelangen. Auf Grund der negativen Ladung unmodifizierter Nukleinsäuren und des hohen Molekulargewichts ist eine passive Permeation ins Zytoplasma unwahrscheinlich. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch die Anknüpfung kleiner Moleküle an den 5´-Terminus des Sense Strangs einer siRNA deren Aufnahme ins Zytoplasma zu erreichen. Hierzu wurden verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert, welche in einem in vitro Modellsystem ohne Verwendung eines Transfektionsreagenzes die posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression in Leberparenchymzellen ermöglichen. Ein erster Ansatz zielte auf die Erhöhung der Hydrophobizität der siRNAs und eine damit verbundene Erleichterung der zellulären Annäherung. Als Grundbausteine dienten Lithocholsäure, Cholesterin, Betulin und 3-Beta-Cholestanol. Durch kurze organisch chemische Synthesesequenzen wurden diese Verbindungen in das entsprechende Phosphoramidit überführt, um eine Kopplung während der RNA-Festphasensynthese zu ermöglichen. Unter Verwendung verschiedener Linker konnte das Spektrum der Modifikationen erweitert werden. Des Weiteren wurde versucht, durch Amidbindungsknüpfung zwischen einer NHS-Ester aktivierten siRNA und verschiedenen Aminen, kationischen Aminosäuren und Dipeptiden, die Lipophilie der siRNA zu erhöhen. So sollte eine Aufnahme über Zellpenetration, bestimmte Aminosäurekanäle oder Nährstofftransporter erreicht werden. In einem weiteren Ansatz wurde eine definierte Rezeptor-vermittelte Aufnahme nach Glykokonjugation der siRNA mit linearen und verzweigten Galaktose-Strukturen zur Überwindung der Zellmembran angestrebt. Hierzu wurde beta-D-Galaktosepentaacetat in ein Phosphoramidit umgewandelt und während der RNA-Festphasensynthese verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert. Zunächst wurden die Eigenschaften der modifizierten siRNAs untersucht. Anhand von Transfektionsexperimenten wurde deren Aktivität im Hinblick auf die posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression gezeigt. Mit Hilfe eines Membranintegritätstests konnten keine zytotoxischen Eigenschaften für die verwendeten Zelllinien detektiert werden. Der Fokus der folgenden Dosis-Wirkungs-Experimente richtete sich auf die Galaktose-konjugierten Nukleinsäuren. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung konnte sowohl in An- als auch in Abwesenheit eines Transfektionsreagenzes für das SBGAL- und SBTEGGAL-Konjugat nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Glykokonjugation von verzweigten Galaktose-Strukturen an siRNAs konnte in dieser Arbeit erstmals eine definierte Rezeptor-vermittelte Aufnahme über den Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) gezeigt werden. Infolge dessen war eine posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression in humanen Leberkarzinomzellen möglich. Durch Stimulation dieses Rezeptors mit Kalziumchlorid konnten die beobachteten RNA-Interferenz-Effekte erheblich gesteigert werden. Die SBGAL-modifizierte siRNA bewirkte in einer Konzentration von 10 µM eine 70%ige Reduktion der apoB m-RNA, während mit dem SBTEGGAL-Konjugat eine Abnahme des m-RNA Gehalts um 90% gezeigt werden konnte. Anhand fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen Cy3-markierter SBGAL- und SBTEGGAL-Konjugate wurde eine Internalisierung dieser siRNAs ins Zytoplasma deutlich gemacht, wobei durch Aktivierung des Rezeptors eine vermehrte Aufnahme der siRNAs ins Zytoplasma zu beobachten war. In den durchgeführten Kompetitionsstudien wurde durch Zusatz des stärker an den Rezeptor bindenden Liganden N-Acetylgalaktosamin eine Internalisierung der siRNAs verhindert und es konnten keine RNA-Interferenz-Effekte mehr detektiert werden. Alle Experimente zur Dosis-Wirkung, Rezeptorstimulation sowie die Kompetitionsstudien wurden mit vergleichbaren Ergebnissen in einer Rattenleberkarzinomzelllinie bestätigt. Diese Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung von RNAi-basierenden Therapeutika und eröffnen neue Möglichkeiten für die gezielte Ablieferung von siRNAs in Leberparenchymzellen bei kommenden in vivo Experimenten.
