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Strukturbiologische Untersuchungen und Faltungsstudien von Modellproteinen mittels NMR-Spektroskopie
(2004)
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Markus Wolfgang Zeeb
- Die biologische Funktion von Proteinen basiert in den meisten Fällen auf einer definierten dreidimensionalen Struktur, die sich im Verlauf der Proteinfaltung ausbildet. In dieser Arbeit wurden die Modellproteine CspB aus B. subtilis, RNase T1 aus A. oryzae, ORF56 aus S. islandicus sowie des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d mit einer Reihe biophysikalischer Methoden ausführlich charakterisiert. Die schnelle interne Dynamik von CspB wurde bei verschiedenen Lösungsmittelviskositäten untersucht, wobei durch eine erweiterte Lipari-Szabo-Analyse der 15N-Relaxationsparameter die Rotationskorrelationszeit iterativ optimiert. Diese stellt einen empfindlichen Sensor gegenüber der unmittelbaren Umgebung des Proteins innerhalb der Hydratationshülle dar, wobei die Geschwindigkeit der Gesamtbewegung nicht von der Größe des Proteins inklusive seiner Hydratationshülle sondern vielmehr von deren Mikroviskosität abhängt. Die Dynamik im ps- bis ns-Bereich bleibt bei steigender Viskosität nahezu unverändert. Der Beitrag des chemischen Austauschs (Rex) zur transversalen Relaxationsrate ist über das gesamte Protein verteilt und korreliert nicht mit Sekundärstrukturelementen oder flexiblen Schleifen. Rex repräsentiert daher nicht die lokale Dynamik einzelner Reste sondern ist auf die globale Faltungsreaktion von CspB im Millisekundenbereich zurückzuführen. Durch die Erhöhung der Viskosität wird die Größe und Anzahl der Rex-Beiträge signifikant reduziert. Die Kooperativität der Millisekundenfaltung von CspB wurde anhand dynamischer NMR-Methoden untersucht, wobei die Bestimmung der Faltungsraten mit R2-Dispersionsmessungen die verlässlichsten Ergebnisse lieferte. Die 24 analysierten ortsspezifischen Sonden zeigen sehr ähnliche apparente Faltungsraten und stimmen gut mit stopped flow Fluoreszenz detektierten Faltungsraten überein. Die Faltung verläuft kooperativ und über einen wenig heterogenen Übergangszustand. Die Wechselwirkung von CspB mit einzelsträngiger DNA wurde auf struktureller Ebene charakterisiert. Die aus Sequenzvergleichen postulierte potentielle Bindungsregion von CspB wurde mittels NMR-Titrationsexperimenten verifiziert. Dabei konnten zusätzliche Aminosäuren außerhalb der Bindungsmotive identifiziert werden, die für die Interaktion sehr wichtig sind. Die Beiträge einzelner Reste zur Bindungsaffinität wurden anhand einer Mutationsanalyse bestimmt, wobei die Lösungsmittel-exponierten Phenylalanine essentiell für eine feste Bindung sind. Aus der Strukturbestimmung von CspB im Komplex mit dem ssDNA-Fragment dT7 folgte, dass das Proteinrückgrat nahezu unverändert vorliegt und die Hauptunterschiede in der relativen Orientierung der aromatischen Seitenketten liegen. Die Modellierung der Struktur des Komplexes mit HADDOCK weist auf die vermuteten Stapel-Wechselwirkungen der aromatischen Seitenketten mit den Basen der ssDNA hin. Die Bindung der Nukleinsäure stabilisiert CspB. Das homodimere Protein ORF56 aus dem acidohyperthermophilen Archaeon Sulfolobus islandicus wurde mit einer Fülle von biophysikalischen Methoden studiert und dessen dreidimensionale Struktur mittels NMR bestimmt. Diese ähnelt der des Arc-Repressor sehr. Die Faltung von ORF56 kann sowohl im Gleichgewicht als auch in der Faltungskinetik mit dem Zweizustandsmodell für dimere Proteine beschrieben werden. Das Protein besitzt eine außerordentlich hohe Stabilität, was in dem extrapolierten Schmelzpunkt der thermischen Entfaltung von 107 °C zum Ausdruck kommt. Diese extreme Stabilität wird von der schnellen simultanen Assoziations-/Faltungsreaktion aber vor allem durch die besonders langsame Entfaltungsreaktion (5.7 pro Jahr) bestimmt. Die Entwicklung höherdimensionaler Echtzeit NMR-Techniken zum Studium langsamer Faltungsreaktionen wurde mit S54G/P55N RNase T1 durchgeführt. Die geschwindigkeitsbestimmende trans/cis Isomerisierung der Y38-P39 Peptidbindung synchronisiert die kooperative Rückfaltung des Faltungsintermediats, was anhand einer Vielzahl von ortsspezifischen Sonden gezeigt wurde. Die Aufnahme von 3D Echtzeit NOESY-HSQC-Spektren ermöglichte die Zuordnung des Proteinrückgrats des Faltungsintermediats und die Identifizierung von NOE-Kreuzsignalen, die die Basis für eine zukünftige Strukturbestimmung des transienten Zustands bilden. Die Faltung des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d, der weder Trp noch Tyr enthält, wurde mit Circulardichroismus und Phenylalanin-Fluoreszenz beobachtet. Mittels dieser optischen Sonden wurde im Gleichgewicht ein apparentes Zweizustandsmodell gefunden. Allerdings wurde in einem NMR-detektierten Entfaltungsübergang ein dritter Zustand bei mittleren Harnstoffkonzentrationen detektiert. Unter stark nativen Bedingungen konnten drei Rückfaltungsphasen aufgelöst werden. Die langsamste Phase kann mit PPIasen signifikant beschleunigt werden, was auf eine Prolyl-cis/trans-Isomerisierung hindeutet, die mittels 1D Echtzeit NMR-Spektroskopie verfolgt werden konnte.
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Isolation and characterization of the B-type allatostatin gene of Gryllus bimaculatus de Geer (Ensifera, Gryllidae)
(2004)
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Junling Wang
- 1. Cricket B type allatostatins, which belong to a neuropeptide family sharing the conserved W(X)6Wamide structure, exhibited inhibitory functions on the biosynthesis of juvenile hormones (JH) in vitro in the corpora allata (CA) as well as on ecdysteroid biosynthesis in the ovary of adult crickets (Gryllus bimaculatus). To understand the mechanisms of function of the pleiotropic cricket B type allatostatins, it is necessary to characterize their gene (preprohormone) and study the spatial and temporal expression patterns of the gene. 2. By PCR screening of a random primer cDNA library and by RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), a 535 bp 3´cDNA sequence of the cricket B type allatostatin gene was yielded. This 3´cDNA fragment encodes a putative translation product of 85 amino acids with potential dibasic endoproteolytic cleavage sites, which may allow processing into six peptides including three copies of Grybi-AS B1 (GWQDLNGGWGa) and single copies of Grybi-AS B2 (GWRDLNGGWGa), Grybi-AS B3 (AWRDLSGGWGa), and Grybi-AS B6 (AWNNLGSAWGa), respectively. Three of these deduced peptides were previously isolated from cricket brain extracts by conventional chromatographic techniques and were designated as Grybi-AS B1, Grybi-AS B2, and Grybi-AS B3. The Grybi-AS B6 neuropeptide represents a novel member of the B type allatostatins. 3. The nucleotide sequences encoding the type B allatostatins are high in GC-content and show strong homology. The highest GC-content was found for Grybi-AS B3 with 83.3%. The similarity of the nucleotide sequences encoding Grybi-AS B2 and Grybi-AS B1 is 93.3%, whereas Grybi-AS B2 and B3 share 90% nucleotide identity. 4. By Southern blot analyses, it was proven that the Grybi-AS type B gene is present as a single copy per haploid genome of G. bimaculatus. 5. By RT in situ PCR technique, it could be demonstrated that the Grybi-AS B gene is expressed in various tissues of 1 day old female adult crickets: In the central nervous system the Grybi-AS B gene expression was detected in the brain. In the protocerebrum, strong positive signals were found in the median neurosecretory cells, and to a lesser extent in lateral neurosecretory cells and in neurons. Gene expression was also found in the neurosecretory cells of the deuterocerebrum and the tritocerebrum. Furthermore, Grybi - AS B gene expression was localized in neurosecretory cells of the suboesophageal ganglion (SOG), the thoracic ganglia, and the abdominal ganglia. In the germarium and in primary oocytes of the ovary, Grybi-AS B gene expression was detected as condensed signals in the nuclei, but not in the prefollicular cells or the cytoplasm. With ongoing development of the oocytes, the signals in the nuclei (germinal vesicles) appeared as separated granules with weaker intensity, which finally disappeared, whereas in the follicular cells strong signals became apparent. Grybi-AS B gene expression was also detected in the epithelial cells of the accessory reproductive glands of female crickets. In the caecum and midgut, Grybi-AS B gene expression was found in endocrine secretory and epithelial cells, whereas in the hindgut, positive RT in situ PCR signals were detected in both longitudinal and circular muscles and in the gut epithelial cells. Grybi-AS B gene expression was also found in cells of the fat body and in thoracic (flight) muscles. 6. The results on Grybi-AS B gene expression as obtained by RT in situ PCR were confirmed by RT-PCR and RNA dot blot analyses. The expression of the Grybi-AS B gene in various tissues of adult females varied in an age-dependent manner. In brains of virgin females gene expression increased from the day of emergence until day 8 of adult life. In the ovary of virgin females gene expression showed a maximum at day 4 after ecdysis, whereas in mated females gene expression was high during the first two days and at days 6 to 7, but low inbetween. In caecum and midgut of virgin females gene expression was low during the first 5 days after ecdysis, but peaked at days 6 and 7, whereas in the hindgut gene expression was highest at day 3 of adult life. In the fat body, gene expression showed highest values on day 1 and days 6 to 7 after ecdysis. 7. Gene expression in brain, testes, and accessory reproductive glands of 0 to 3 days old male crickets was also demonstrated by RT-PCR and RNA dot blot analyses.
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Strukturelle Untersuchung des Antiterminationskomplexes von EIAV
(2002)
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Marc Ehnert
- In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Untersuchungen am Antiterminationskomplex von EIAV durchgeführt. Die Auswertung von Tripleresonanz-NMR-Experimenten ermöglichte die sequentielle Zuordnung der Resonanzen von 13C/15N-markiertem EIAV-Tat. Zum ersten Mal konnten mit Hilfe dieser Zuordnung strukturelle Veränderungen des Proteins bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA, Cyclin T1 und dem Inhibitor TF53 auf der Basis einzelner Aminosäuren direkt in einem 15N-1H-HSQC-Spektrum beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass das EIAV-Tat-Protein ohne die Beteiligung weiterer Bindungspartner an die TAR-RNA bindet. Bei dieser Bindung erfahren die Core-Domäne (Tyrosin-35 bis Tyrosin-49) und das argininreiche Motiv (ARM; Arginin-55 bis Lysin-63) von EIAV-Tat strukturelle Veränderungen, wobei auch der zwischen diesen beiden Domänen liegende Linker (Leucin-50 bis Leucin-54) betroffen ist. Auf RNA-Ebene deutet die Analyse der Imino-Protonen-Verschiebungen auf strukturelle Veränderungen bei der Tat-Wechselwirkung hin, die sich aber auf den Stamm der RNA nur wenig auswirken, so dass von einer Bindung an die ungepaarten Basen der Loopregion ausgegangen werden kann. Die Untersuchung der Interaktionen von EIAV-Tat mit TF53 – einem Inhibitor der HIV-Tat/TAR-Bindung – ergab, dass dieser auch an das virale Protein aus EIAV bindet und dabei – ähnlich wie die TAR-RNA – strukturelle Veränderungen der Core- und ARM-Region induziert. Die Veränderungen des Tat-Proteins, die bei der TF53-Bindung beobachtet wurden, stimmen mit denen der TAR-Bindung zu einem großen Teil überein; Unterschiede sind nur bei wenigen Resonanzen zu erkennen. Offensichtlich bindet der Inhibitor zwar nicht an alle Aminosäuren, die bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA beteiligt sind. Beispielsweise sind die für die TAR-Bindung wichtigen Reste Arginin-55 und Asparagin-58 hier nicht betroffen. TF53 bedingt aber ähnliche strukturelle Veränderungen des Tat-Proteins, so dass die TAR-Bindung gehemmt werden könnte. Die Wechselwirkungen von EIAV-Tat mit dem Wirtsfaktor Cyclin T1 wurden anhand verschiedener Systeme untersucht. Da die Reinigungen von Pferde-Cyclin T1 (eCycT1) und einer His-tagged Form von eCycT1 trotz erfolgreicher Expression beider Proteine in E. coli nicht zu einer ausreichend konzentrierten Lösung führten, wurde die Reinigung einer V29L-Mutante von humanem Cyclin T1 (hCycT1_V29L) mittels Ammoniumsulfat-Fällung und einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) etabliert. Das an EIAV-Tat bindende hCycT1_V29L konnte bis zu 80 µM konzentriert werden. Erste CD- und NMR-spektroskopische Untersuchungen belegen, dass sowohl eCycT1 als auch hCycT1_V29L hauptsächlich a-helikale Strukturelemente besitzen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass hCycT1_V29L Wechselwirkungen mit EIAV-Tat über Leucine eingeht. Dabei sind neben einigen bereits in der TAR-Bindung involvierten Resten der Core- und Linker-Region auch die Leucine-74 und 75 beteiligt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit der 272 Aminosäuren großen CyclinT1-Proteine wurden zudem Untersuchungen mit verkürzten Cyclin-Varianten durchgeführt, die nur die wichtigen amino- und carboxyterminalen Bereiche von Cyclin T1 – verbunden durch einen FKSG-Linker – enthielten. Das daraus abgeleitete synthetische Peptid Mini_eCyc_45 und das etwas längere in E. coli überexprimierte und über Heparin-Sepharose gereinigte Mini_eCyc_75 zeigen in CD- und 1D-NMR-Spektren keine reguläre Sekundärstruktur. Beide Mini-Cycline gehen mit EIAV-Tat nur geringe Wechselwirkungen ein, die sich lediglich bei der Interaktion mit Mini_eCyc_75 in wenigen Verschiebungen der Seitenketten-Resonanzen im 15N-1H-HSQC beobachten lassen. Eine Verstärkung der zwischen zwei Bindungspartnern auftretenden Wechselwirkungen wurde bei der Untersuchung von ternären Interaktionen zwischen EIAV-Tat, TAR-RNA und Mini_eCyc_45 beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Mini_ eCyc_45 zusätzliche strukturelle Veränderungen der TAR-RNA bewirkt. Anhand der Veränderungen im 15N-1H-HSQC von EIAV-Tat konnte ebenso gezeigt werden, dass sich – ähnlich wie bei der Bindung von hCycT1_V29L an Tat – wahrscheinlich mehrere Leucine an dieser ternären Interaktion beteiligen.
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Synthese und Charakterisierung von mono- und 1,1´-di-substituierten Ferrocenen sowie [3]- und [4]Ferrocenophanen und ihre 57Fe-NMR-spektroskopische Untersuchung
(2004)
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Anahid Ayazi
- Ferrocen ist eine außergewöhnlich stabile Organometallverbindung, in der zwei Cyclopentadienyl-Anionen hapto-5 an ein Fe(II)-Zentrum koordiniert sind. Die zahlreichen Reaktionsmöglichkeiten des Ferrocens machen es zu einer vielseitigen Modellverbindung anhand derer auch die Aus-wirkungen verschiedener Substituenten auf die elektronische Struktur besonders gut untersucht werden können. In der Literatur sind bereits zahlreiche Ferrocene mit gleichartigen Substituenten bekannt. 1,1´-disubstituierte Ferrocene mit unterschiedlichen Heterosubstituenten, sowie [3]- und [4]Ferrocenophane mit zwei oder mehr unterschiedlichen Substituenten in der Brücke fanden jedoch bisher nur geringes Interesse, da ihre Synthese komplexer ist, obwohl sie sich gut für NMR-spektroskopische Vergleiche mit analogen gleichartigen 1,1´-disub-stituierten Ferro-cenen eignen. Bisher war es nicht gelungen [3]Ferrocenophane mit drei verschiedenen Hetero-elementen darzustellen. Die hohe Bedeutung der Ferrocenchemie, z.B. in der Materialwissenschaft, bedingt den systematischen Einsatz physikalischer Messmethoden, um mehr Informationen über die Eigenschaften der Ferrocene zu erhalten. Neben Röntgenstrukturanalyse und Routine-NMR-Spektroskopie eignet sich dafür besonders die 57Fe-NMR-Spektroskopie, da die Daten bekannter Verbindungen zeigen, dass die magnetische Abschirmung der 57Fe-Kerne sehr empfindlich auf kleine Veränderungen der elektronischen Struktur reagiert. Die synthetisierten Verbindungen wurden durch Multikern-NMR-Spektroskopie, insbesondere 57Fe-NMR-Spektroskopie, sowie mit Hilfe von EI- und FD-Massenspektro-metrie charakterisiert. In einigen Fällen konnte die Struktur der erhaltenen Komplexe durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt werden. I. Monosilyl- und 1,1´-disilyl-substituierte Ferrocen-derivate mit sperrigen Substituenten am Siliciumatom Monosilyl-substituierte Ferrocene und 1,1´-Bis[chloro(dimethyl)silyl]ferrocen lassen sich ausgehend von Monolithioferrocen bzw. Dilithioferrocen durch eine Reaktion mit Chlorosilanen darstellen. Durch den Austausch der Chlor-Substituenten dieser Verbindungen gegen eine oder zwei 9-Fluorenyl- oder 1-Indenyl-Gruppen kann man monosubstituierte Ferrocen-derivate sowie 1,1´-Bis[indenyl(dimethyl)silyl]ferrocen bzw. 1,1´-Bis[fluorenyl(dimethyl)-silyl]ferrocen synthetisieren. II. 1-Sila-[1]ferrocenophane Eine Reihe von 1-Sila-[1]ferrocenophanen wurde als Edukte für die Darstellung von 1,1´-disubstituierten Ferrocenen mit unterschiedlichen Heteroatomen in 1,1´-Position eingesetzt und NMR-spektroskopisch erstmalig genauer untersucht. III. Ringöffnungen der 1-Sila-[1]ferrocenophane Bei der Umsetzung der 1-Sila-[1]ferrocenophane mit Borhalogeniden, SnCl4 und 9-BBN konnten die 1-silyl-1´-boryl - und 1-stannyl-1´-silyl-substituierten Ferrocene erhalten werden. IV. Intramolekularer Ringschluss bei 1,1´-disubstituierten Ferrocenen Mit Hilfe der unter III beschriebenen Produkte konnten erstmals [3]Ferrocenophane mit drei ver-schiedenen Heteroelementen in der Brücke dargestellt werden. Als Ausgangsverbindung für die Darstellung der [3]Ferrocenophane dienten die Aminoborylferrocene, da aufgrund des Stabilisierungseffekts der Amino-Gruppe ein selektiver Ringschluss begünstigt wird. Die Reaktionen mit Lithiumchalkogeniden bzw. mit primären Aminen führten zu einem intramolekularen Ringschluss und zur Bildung der [3]Ferrocenophane mit drei unterschiedlichen Heteroatomen in der Brücke. Auswirkungen auf NMR-spektroskopische Daten durch die Vergrößerung der Brücke auf vier Atome wurden untersucht, insbesondere 57Fe-NMR-spektroskopisch anhand des 1-Sila-4-bora-[4]ferrocenophans. Die Darstellung dieses [4]Ferrocenophans erfolgte durch die Reaktion von fcLi2(TMEDA) mit (E)-2-[Chloro(dimethyl)silyl]-3-[chloro(ethyl)boryl]-2-penten. V. 57Fe-NMR-Spektroskopie Um weitere Informationen über die elektronische Struktur von Ferrocenderivaten zu erhalten, wurde die 57Fe-NMR-Spektroskopie eingesetzt. Da bei früheren 57Fe-NMR-Untersuchungen von Ferrocenderivaten der Einfluss von Heteroelement-Substituenten nicht bestimmt worden war, wurden in der vorliegenden Arbeit die 57Fe-NMR-Spektren von bekannten silyl-, germyl-, stannyl- und boryl-substituierten Ferrocenen sowie von bekannten und neuen 1,1´-disubstituierten Ferrocenen mit gleichen oder unterschiedlichen Heteroatomen in 1,1´-Position und auch von [m]Ferrocenophanen gemessen.
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Keteneylidenetriphenylphosphorane as a Versatile C-2 Building Block Leading to Tetronic Acids with Potential Herbicidal and anti-HIV Activity
(2004)
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Gary John Gordon
- The cumulated ylide keteneylidenetriphenylphosphorane (Ph3PCCO) has shown great potential in the construction of heterocyclic compounds. The formation of heterocycles arises from the unique dipolar electronic structure of the cumulated ylide, which combines ylide and ketene properties. Upon reaction of alcohols, amines and thiols with keteneylidenetriphenylphosphorane the intermediate ketene cation gets intercepted by the more strongly nucleophilic counter anion (alkoxide, amide, thiolate) yielding monomer “acyl” ylides. Since acyl ylides enter into Wittig alkenation reactions far more quickly than the starting ylide, multi-component or domino reactions between the latter and a carbonyl compound becomes possible leading to beta,gamma-unsaturated carbonyl derivatives. A further strength of keteneylidenetriphenylphosphorane is its low toxicity, easy accessibility, simple handling and its ability to enter into extended domino reactions, thus this molecule is extremely useful in modern synthetic applications. Our group has recently extended this procedure to the formation of tetronates from keteneylidenetriphenylphosphorane and alpha-hydroxycarboxylic esters. In cases were the ester contains an beta,gamma-unsaturated alkene the corresponding tetronates can be easily converted to either tetronic acids or 3-dispirodihydrofurandiones by careful control of the reaction conditions. Tetronic acids are an important class of heterocycles which exhibit a large array of biological properties. In recent years tetronic acids derivatives have been found to be important HIV-1 protease inhibitors. This work is concerned with using keteneylidenetriphenylphosphorane as a new route to highly functionalised HIV-protease inhibitors. New synthetic techniques such as microwave irradiation is investigated as a means to accelerate Claisen rearrangement reactions. The mechanistic pathway of Claisen/abnormal Claisen rearrangements is investigated in detail. Further examples of 3-dispirodihydrofurandiones are provided with a more in-depth study of the reaction mechanism. The nucleophilic ring opening of these 3-dispirodihydrofurandiones to give 3-substituted tetronic acids is also investigated. These tetronic acids have been found to have potential as lead compounds in the herbicidal industry.
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Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung von Alkyl-Kohlenstoff in Böden
(2003)
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Anja Winkler
- Nach Befunden der 13C-CP/MAS-NMR-Spektroskopie reichern sich unbekannte Alkyl-C-Komponenten in Waldhumusprofilen mit zunehmender Streuzersetzung und Humifizierung an. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, den Alkyl-C in Bodenproben zu isolieren, zu identifizieren und zu quantifizieren, um auf diese Weise zur Aufklärung des o.g. Phänomens beizutragen. Das Interesse galt sowohl den zu den Triterpenen gehörenden Hopanoiden als auch anderen, vor allem unlöslichen Alkyl-C-Komponenten. Dabei sollten Informationen über Strukturen, Konzentrationen und Verhalten dieser “Zielverbindungen” in Böden gewonnen werden. Die Methodenentwicklung erfolgte jeweils anhand einer Referenzprobe (Oh-Horizont eines Norm-Podsols). Lösungsmittellösliche Hopanoide ließen sich durch Lipidextraktion aus Böden abtrennen. Kovalent an die Huminstoffmatrix gebundene Hopanoide wurden durch mehrere Abbauschritte freigesetzt: der sauren/basischen Hydrolyse (Spaltung von Estern) schlossen sich die Reaktion mit Iodtrimethylsilan (ITMS; Spaltung von Ethern, auch von Estern) und die Oxidation mit Rutheniumtetroxid (RuO4; Spaltung von aliphatisch-aromatischen Bindungen, auch von Estern und Doppelbindungen) an. Dieses Analysenschema (in leicht modifizierter Form) bewährte sich auch für die Isolierung unlöslicher Alkyl-C-Komponenten. Um die Tiefenfunktionen der Zielverbindungen (d.h. den jeweiligen Konzentrationsverlauf im Bodenprofil) zu charakterisieren, wurden ein Norm-Podsol (Horizontabfolge L/Of/Oh/Aeh/Ahe/Bh; für Hopanoide und Alkyl-C) und eine Tangelrendzina (Horizontabfolge L/Of/Oh/Ohca; für Alkyl-C) ausgewählt und analysiert. Die Identifizierung und Quantifizierung der freigesetzten Zielverbindungen erfolgte nach jedem Abbauschritt mittels GC/MS. Die Wiederfindungen lagen zwischen 45% und 101%. Die Hopanoide wurden reaktionsbedingt in Form von verschiedenen Alkoholen (nach Extraktion), als Säure (nach Extraktion und RuO4-Oxidation) und als Kohlenwasserstoff (nach ITMS-Spaltung) detektiert. Das Substanzspektrum der unlöslichen Alkyl-C-Komponenten umfasste Carbonsäuren und Alkohole mit vielfältigen Strukturen und Kettenlängen von 7-32 C-Atomen. Sie stammten im Wesentlichen aus leicht bis schwer hydrolysierbaren pflanzlichen Cutin- und Suberinestern, die auch Ether- und Doppelbindungen besaßen. Im L-Horizont des Podsols konnten Hopanoide nicht nachgewiesen werden. Ihre Gesamtkonzentration nahm vom Of- zum Aeh-Horizont von 300 µg g–1 Corg (kleinster Wert) bis auf 565 µg g–1 Corg (größter Wert) zu, fiel im Ahe-Horizont und zeigte im Bh-Horizont ein weiteres Maximum. Variierende mikrobielle Aktivität (Hopanoidbiosynthese, -abbau) und Verlagerungsprozesse beeinflussen anscheinend die Tiefenfunktion. Die extrahierbaren Hopanoide stellten die Hauptfraktion dar. Abschätzungen mittels 13C-CP/MAS-NMR-Spektroskopie ergaben, dass Hopanoide wegen ihrer geringen Gehalte die Akkumulation des Alkyl-C in Bodenprofilen kaum erklären können. Die Gesamtkonzentration der unlöslichen Alkyl-C-Komponenten zeigte im Podsol Maxima im L-, Oh- und Ahe-Horizont (größter Wert: 44,8 mg g–1 Corg), Minima im Of-, Aeh- und Bh-Horizont (kleinster Wert: 26,3 mg g–1 Corg). In der Tangelrendzina trat der größte Gehalt im L-Horizont auf (28,9 mg g–1 Corg) und nahm bis zum Ohca-Horizont ab (7,6 mg g–1 Corg). Die Tiefenfunktion hing in beiden Böden hauptsächlich vom Cutin- und Suberineintrag durch Streufall/Wurzelmaterial, sowie deren Verlagerung und enzymatischem Abbau ab. Die größte Fraktion an Alkyl-C-Komponenten resultierte jeweils aus der sauren/basischen Hydrolyse. Die Gehalte der durch ITMS-Spaltung und RuO4-Oxidation freisetzbaren Verbindungen waren in beiden Böden eher gering. Eine Zunahme von den nach RuO4-Oxidation isolierbaren Alkyl-C-Komponenten (v.a. Alkandisäuren) konnte im Podsol von den Auflage- zu den Mineralbodenhorizonten festgestellt werden. Ansonsten reicherten sich während der Streuzersetzung und Humifizierung nur im Podsol einzelne Substanzen (z.B. Suberinmonomere) an. Die Konzentrationen des Alkyl-C wurden anhand der entsprechenden Konzentrationen der einzelnen Alkyl-C-Komponenten berechnet. Der Anteil des durch GC/MS identifizierten unlöslichen Alkyl-C am gesamten Alkyl-C (bestimmt durch NMR) nahm von jeweils ca. 10% in den L-Horizonten auf 5% im Aeh- bzw. 2% im Ohca-Horizont ab. Zusammen mit dem lösungsmittellöslichen Alkyl-C können in den L-Horizonten ca. 60%, im Aeh- bzw. Ohca-Horizont dagegen nur 22% bzw. 10% des gesamten Alkyl-C erklärt werden. Die z.T. niedrigen Ausbeuten sind auf einen Abbau der Alkyl-C-Komponenten zu nicht fassbaren Spaltprodukten während der chemischen Prozedur und auf eine unvollständige Freisetzung aus den Bodenproben zurückzuführen. Durch die CP/MAS-NMR-Technik wird möglicherweise auch der jeweilige Gesamtgehalt des Alkyl-C in den einzelnen Bodenhorizonten überschätzt, auf dessen Basis die Anteile des aufklärbaren Alkyl-C berechnet werden.
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The two-dimensional vibrating reed technique: a study of anisotropic pinning in high-temperature superconductors
(2004)
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Anna Karelina
- In this work the anisotropy of the pinning forces of vortices in a-b plane of high temperature-supraconductors was examined. For this purpose vibrating reed with two degrees of freedom of the oscillation was constructed. The pinning forces were examined in single crystals of YBa2Cu3O7 and Bi2Sr2CaCu2O8. Because of the d waves symmetry of the order parameter is expected four-fold anisotropy of the pinning potential. The reed consists of a sapphire fiber which is fast clamped at one end. Other end of the reed glued into a hole of the ruby disc, which is used as a sample holder. The superconducting sample was glued on top of the disc with the c-axis parallel to the sapphire fiber. The dielectric reed is covered by a thin conducting layer for driving the reed electrostatically and detecting its elongation from equilibrium by capacitance method. Thus we have the possibility to vibrate the sample in any direction of the ab plane. The magnetic field directed along the c axis creates vortices in the superconductor. Vibrating of the superconductor leads to the distortion of the flux lines and displacement of the vortices from the point-like oxygen defects, which act as pinning centers. The pinning force leads to additional restoring force which causes a typical magnetic field dependence of the resonance frequency. Such an experimental configuration has never been used before and gives the possibility to study the symmetry of the pinning potential. A mathematical model was developed to describe the effect of anisotropy of the pinning potential on the vibrating reed motion. The two simplest cases of two- and four-fold symmetry of the potential were considered in this model. The experiments with the two-dimensional vibrating reed were carried out with single crystals of YBa2Cu3O7, glued with some angle between the easy axis of the reed (the x direction) and the crystallographic axis a and b. These experiments demonstrated the presence of the two-fold symmetry of the pinning potential of the sample. The anisotropy of the pinning potential manifests itself by the appearance of coupling between main axes of the vibrating reed and by beating in the free oscillations. From the comparison of measurement and mathematical model anisotropy parameter was obtained equal to 10%. For the investigations of the fourfold symmetry of the pinning potential, the crystal was glued so that the crystallographic axes coincide with the easy axes of the reed to eliminate the effect of the two-fold symmetry of the pinning potential. The experiments with YBa2Cu3O7 show that at temperatures lower than 78K the vortices are in a nonequilibrium state. This leads to a flux creep and to a drift of the resonance frequency with time. This prevents the comparison of resonance curves in different directions of oscillations. In Bi2Sr2CaCu2O8 single crystals the vortices are in more stable state, but the measurements of the resonance curves in different directions show no indication of the four-fold symmetry. At temperatures below 60 K a strong hysteresis of the resonance frequency and the resonance-oscillation amplitude was found in YBa2Cu3O7 crystals as a function of the magnetic field. The hysteresis of the amplitude caused probably by bending of the reed because of the irreversible magnetisation.
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Stickstoff-Umsätze in Humusauflagen von Buchen- und Fichtenwäldern im Fichtelgebirge (NO-Bayern) und entlang eines europäischen Nord-Süd-Transekts
(2003)
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Michaela Hein
- Unter natürlichen Bedingungen gilt der N-Kreislauf in terrestrischen Ökosystemen, in dem Mineralisation und Nitrifikation im Boden eine zentrale Rolle spielen, als geschlossenes System. Ausgehend davon wurden in der vorliegenden Arbeit die Brutto-N-Umsatzraten, in den Humusauflagen europäischer Buchen- und Fichtenwäldern getrennt quantifiziert. Diese wurden dann mit den Netto-Umsatzraten, die nur die Differenz der gleichzeitig ablaufenden Prozesse der N-Produktion und des N-Verbrauchs beschreiben, verglichen. Entlang eines Depositions- und klimatischen Transekts von Nordschweden bis Mittelitalien sowie im Fichtelgebirge – also bei ähnlicher Deposition und Klima – wurde die Abhängigkeit der N-Umsätze von atmosphärischem N-Eintrag und klimatischen Verhältnissen untersucht. Ziel der Arbeit war es zu klären, unter welchen Bedingungen der bodeninterne N-Kreislauf offen oder geschlossen ist. Mit Hilfe der 15N-Isotopenverdünnungsmethode wurden die Flüsse der Brutto-Mineralisation, des Brutto-NH4-Verbrauchs, der Brutto-Nitrifikation und des Brutto-NO3-Verbrauchs im Sommer und Herbst 1998 bestimmt und der mit der Beutelinkubationsmethode gemessenen Netto-Mineralisation und Netto-Nitrifikation gegenübergestellt. Alle diese N-Umsätze wurden sowohl im Of- als auch im Oh-Horizont der untersuchten Standorte ermittelt. Die Brutto-Umsatzraten von Ammonium und Nitrat entlang des europäischen Transekts waren mit denen im Fichtelgebirge vergleichbar. Die Brutto-Mineralisation war im Of-Horizont höher als im Oh-Horizont und spiegelt damit den zeitlichen Ablauf des Abbaus organischer Substanz wider. Bezüglich der Brutto-Nitrifikation waren die Unterschiede zwischen beiden Horizonten uneinheitlich. Dies gilt ebenfalls für saisonale Effekte, da die im Sommer gemessenen Raten nur z. T. höher waren als die im Herbst. Auf fast allen Standorten wurde nahezu alles produzierte Ammonium von Mikroorganismen assimiliert oder nitrifiziert. Insgesamt verbrauchte die Nitrifikation meist weniger als 20 % des produzierten Ammoniums. Dagegen war der Brutto-NO3-Verbrauch auf den nordeuropäischen Standorten z. T. mehr als doppelt so hoch wie die Brutto-Nitrifikation. Die Nitrataufnahme der Mikroorganismen war dort demnach stark substratlimitiert. Das Fehlen von Netto-Nitrifikation auf diesen Standorten bestätigt dies. Der Vergleich von Brutto- und Nettoumsatzraten zeigte, daß die Netto-Mineralisation und -Nitrifikation die Brutto-Mineralisation und -Nitrifikation nicht vorhersagen konnten. Die Bestimmung der Bruttoumsatzraten gibt damit einen tieferen Einblick in den bodeninternen N-Kreislauf als es mit der Bestimmung von Nettoumsatzraten möglich wäre. Die N-Umsatzraten der beiden europäischen Hauptbaumarten Buche und Fichte unterschieden sich nur z. T. Die Brutto-Mineralisation und der Brutto-NH4-Verbrauch waren unter Buche höher als unter Fichte. Dagegen wies die Brutto-Nitrifikation und der Brutto-NO3-Verbrauch der Buchenstandorte etwa gleiche Raten auf wie die der Fichtenstandorte. Die kleinräumige Variabilität innerhalb eines Bestandes bzw. einer Region, in der die klimatischen Bedingungen und die N-Einträge ähnlich sind, war genauso groß wie die Variabilität entlang des Transekts. Trotzdem ist festzuhalten, daß die Brutto-Mineralisation und der Brutto-NH4-Verbrauch auf dem nördlichsten Fichtenstandort etwa um den Faktor 10 geringer waren als auf dem deutschen und italienischen Fichtenstandort, also geographische Unterschiede in einem gewissen Rahmen sehr wohl vorhanden waren. Von zentraler Bedeutung ist der Einfluß der N-Deposition auf die bodeninterne N-Zirkulation und damit auch auf den Austrag von Nitrat. Der Vergleich des als ungestört geltenden nordschwedischen Fichtenstandorts mit dem deutschen Fichtenstandort mit hohem N-Eintrag legt nahe, daß bei hoher N-Deposition lediglich die Nitratnutzung vermindert ist, nicht jedoch die Brutto-Nitrifikation. Diese Diskrepanz ist es wohl, die am deutschen Standort zu einem hohen Nitrataustrag führte. Dagegen hatte ein Überschuß an produziertem Nitrat auf den Buchenstandorten keinen nennenswerten Nitrataustrag zur Folge. Der Nitrat-Austrag aus den Fichtenstandorten war bis zu 10 mal höher als bei den Buchenstandorten. Das Verhältnis von in der Humusauflage produziertem zu verbrauchtem Nitrat war dabei nur bedingt von Bedeutung, wie das Beispiel des französischen Fichtenstandorts zeigte. Dort wurde fast alles produzierte Nitrat aufgenommen und die Netto-N-Produktion war geringer als der N-Bedarf des Standorts. Dennoch wies dieser Standort mit 29 kg N ha-1 a-1 den höchsten Nitrataustrag aller Transektstandorte auf. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte keine singuläre Ursache für das Auftreten von Nitrat-Austrag identifiziert werden, obgleich die N-Deposition ein wichtiger Faktor zu sein scheint. Es ist wohl eher eine Reihe von Faktoren, deren standortspezifisches Zusammenspiel dazu führt, ob und in welchen Mengen Nitrat aus dem Waldökosystem ausgewaschen wird.
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Maximum Entropy Method in Superspace Crystallography
(2003)
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Lukas Palatinus
- This thesis discusses several aspects of the combination of the Maximum Entropy Method (MEM) for the reconstructions of the electron density with the superspace approach to the description of structures of aperiodic crystals. It is shown that the MEM in superspace provides a parameter-free reconstruction of the modulation functions with sufficient accuracy. The MEM in superspace has been applied to diffraction data of several compounds. The computer program BayMEM was developed for this purpose. BayMEM allows electron densities of the ordinary 3D structures and the superspace electron densities of the aperiodic structures to be reconstructed using the same general principles. The program has been extended by adding features improving its versatility and accuracy of the results. The improvements include attaching of the set of subroutines MemSys5 to BayMEM, implementation of the method of the Generalized F-constraints and the static weighting, implementation of the G-constraints, of the Prior-derived F-constraints and of the two-channel entropy. The second major computer program EDMA is a software tool for analysis of the electron densities in arbitrary dimension. The program analyzes the MEM electron density and extracts quantitative information about the atoms according to Bader's formalism “Atoms in molecules“. Two new variants of the constraints in the MEM have been developed in order to solve the problems with artifacts in the MEM reconstructions. The two methods are the Generalized F-constraints and the Prior-derived F-constraints. The concept of the Generalized F-constraints is based in the observation, that the standard F-constraint is not sufficiently strong to constrain the histogram of the normalized residuals of the structure factors to the expected Gaussian shape. Higher moments of the distribution of the normalized residuals were therefore used as the constraint in the MEM calculations. With these constraints significantly improved histograms were obtained. The source of some artifacts in the MEM electron densities was identified to be the tendency of the MEM to estimate incorrectly those structure factors, that are not included in the experimental dataset. It is shown that the missing structure factors can successfully be replaced by the structure factors derived from the procrystal electron density. If the structure factors derived from the procrystal prior electron density (the Prior-derived F-constraints) are used as additional constraints in the MEM calculation, the result is free of sharp artifacts and the quality of the reconstruction of the electron density is comparable with the results of multipole refinements. To test the accuracy of the MEM in superspace, the method was applied to the dataset of the misfit-layer composite structure of (LaS)1.14NbS2. It has been shown, that the MEM on the model structure factors reproduces the model modulation functions with accuracy better that 10% of the pixel size of the grid, on which the electron density was sampled. The structure of the high-pressure phase III of Bi provided a prominent example illustrating the advantages of the MEM in superspace over the standard structure refinements. The MEM in superspace was applied to the diffraction data of Bi-III to extract more information about the modulation than obtained from the standard structure refinement. The modulation functions extracted from the MEM electron density revealed a block-wave-like shape of the modulation function of the Bi atom of the host structure that indicates shifts of the atom between two stable environments rather than smooth harmonic variation of the position indicated by the modulation function from the standard refinement. Secondly, the MEM modulation function of the Bi atoms in channels allowed to better understand the nature of the most prominent feature of the modulated structure - the occurrence of the pairs of Bi atoms along the channels. The incommensurately modulated structure of ammonium tetrafluoroberyllate (NH4)2BeF4, stable between 175K and 182K, was solved and refined in superspace. The known two-fold low-temperature superstructure of (NH4)2BeF4, that is stable below 175K has been described in superspace as a commensurately modulated structure. With aid of this description the close relationship between the two structures has been found. The MEM was applied to the incommensurate structure to test the appropriateness of the refined harmonic structure model. The MEM has shown that the harmonic model is very accurate. The MEM in superspace was established in this thesis as a reliable tool for the structure solutions of the modulated structure. The individual chapters together form a framework that allows to use the MEM in superspace to extract novel information from the diffraction data of both the periodic and aperiodic structures, that cannot be obtained from the structure refinements.
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Ökotoxikologische Spurenuntersuchungen mehrerer nordbayerischer Fließgewässer
(2003)
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Cristina Velasco-Schön
- Es wurde die Wasserqualität von drei Fließgewässern aus der Fränkischen Schweiz, der Leinleiter, der Aufseß und der Wiesent und zwei Fließgewässern aus Nordostoberfranken, dem Mähringsbach und dem Zinnbach untersucht. Diese Flüsse wurden vierteljährlich während eines Jahres beprobt. Gegenstand der Untersuchung war die mittelpolare bis polare Fraktion der Wasserinhaltsstoffe. Da es sich um relativ gering belastete Fließgewässer handelte, stellte die Planung und Durchführung der ökotoxikologischen Untersuchungen eine besondere Herausforderung dar. Anhand einer Gruppe von Leitanalyten, bestehend aus Herbiziden und einigen ihrer Metabolite, wurden Methoden für die analytischen und die ökotoxikologischen Untersuchungen erarbeitet. Um den über die Wirkungstests ermittelten Effekten die auslösenden Substanzen analytisch zuordnen zu können, wurden die Extrakte in Fraktionen unterteilt. Infolge eines Anreicherungsschrittes, der einen großen Anteil der organischen Matrix mit erfasste, reichte eine zunächst eingesetzte HPLC-Methode nicht aus, um die erforderlichen Nachweisgrenzen zu erzielen. Es traten viele Störsubstanzen im UV-Chromatogramm auf, die die Identifizierung der Leitsubstanzen beeinträchtigten. Mittels einer LC-MS/MS-Methode konnten diese in Bereichen zwischen 0,5-10 ng/l detektiert werden. Für die ökotoxikologischen Untersuchungen musste jeder Schritt durch Leerwerte abgesichert werden, um toxische Artefaktbildung durch die Aufarbeitung zu vermeiden. Ziel war es, die Leerwerte und deren Schwankungen so gering wie möglich zu halten, um eine entsprechend hohe Aussagekraft auch für die niedrigen Effekte zu erhalten. Durch die Anreicherung der organischen Verbindungen wurde die Empfindlichkeit für beide Untersuchungssysteme erhöht. Die Fließgewässer der Fränkischen Schweiz wiesen eine höhere Herbizidbelastung als diejenigen Nordostoberfrankens auf. Atrazin und Desethylatrazin waren während des gesamten Jahres in allen Proben nachzuweisen, wobei in der Fränkischen Schweiz die Konzentrationen zwischen 50 – 200 ng/L und in Nordostoberfranken zwischen 1 – 10 ng/L lagen. Eine Ausnahme bildete eine Quelle in der Nähe des Ortes Aufseß, die im Mittel 600 ng/L Atrazin aufwies. Während der Wachstumsphase wurde im Juni in der Aufseßquelle eine einmalige Konzentration von 580 ng/L festgestellt. Im Märingsbach und Zinnbach wurden keine weiteren Herbizide nachgewiesen, jedoch ließen sich in Aufseß, Leinleiter und Wiesent Metolachlor, Metazachlor, Diuron und Isoproturon messen. Ihre Konzentrationen lagen dabei im niedrigen ng/L-Bereich. Atrazin, Diuron und Isoproturon kommt eine besondere Bedeutung zu, da sie in der Liste der "prioritär gefährlichen Substanzen" in der europäischen Wasserrahmenrichtlinie aufgeführt werden. Die neutralen und sauren Fraktionen der Wasserproben erzielten in allen drei Biotests Effekte zwischen 0 und 100 %. Dabei erwies sich der MicrotoxTM-Test als der empfindlichste der drei Tests. Zeigten die neutralen Fraktionen Effekte bis zu 10 %, waren bei den sauren Fraktionen in allen drei Tests Effekte bis zu 100 % zu verzeichnen. In den sauren Fraktionen sind vor allem Phenole, Carbonsäuren und organische Verbindungen mit aziden OH-Gruppen enthalten. Ausgenommen davon war wiederum eine Probe der Quelle nahe des Ortes Aufseß, deren neutrale wie auch saure Fraktion eine Hemmung von 40 % gegenüber der Alge C. rheinhardtii aufwies. Vermutlich ist die hohe Atrazinkonzentration von etwa 60 µg/L im Extrakt ausschlaggebend gewesen, was durch den negativen Effekt gegenüber der Alge S. capricornutum, die eine geringere Sensitivität gegenüber Atrazin aufweist, unterstützt wird. Im allgemeinen reagierte diese Alge jedoch empfindlicher auf die Flusswasserextrakte. Die höchsten Effekte wurden in der Nähe von Ortschaften bzw. Kläranlagen gemessen. Dies zeigt, dass sich im Biotest eine Veränderung der chemischen Beschaffenheit selbst in niedrig belasteten Fließgewässern manifestiert. Ein Zusammenhang zwischen den nachgewiesenen Herbiziden und den ermittelten Effekten scheint jedoch nicht zu bestehen. Eine weitere HPLC-Fraktionierung der Extrakte mit hohen Effekten brachte keine neuen Informationen über potentiell wirksame Verbindungen, da die damit verbundene Verdünnung des Extrakts mit einem Empfindlichkeitsverlust gegenüber den Biotests einherging. Es konnte darüber hinaus keine Abhängigkeit zwischen den DOC- bzw. AOX-Konzentrationen und den Effekten im Biotest festgestellt werden. Das Monitoring zeigt, dass mittels Biotest und einer entsprechenden Aufarbeitung der Probe auch in gering belasteten Gewässern Änderungen der natürlichen Wasserzusammensetzung nachweisbar sind. Da eine Vielzahl von Verbindungen diese Effekte verursachen können, eine analytische Bestimmung alle in Frage kommenden Verbindungen jedoch zu aufwendig wäre, sind Biotest ein geeignetes Verfahren, um die Beschaffenheit von gering belastetem Wasser zu überwachen.
