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Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA
(2002)
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Sabine Schwarz
- In dieser Arbeit wurden drei virale Regulator-Proteine (CAEV-Tat, HK022 Nun und l N (1-53)) und mehrere ihrer nicht-viralen Bindungspartner kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. CAEV-Tat (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus) ist ein Transaktivatorprotein aus einem HIV-verwandten Lentivirus der Ziege. Zur effizienten Expression von CAEV-Tat war es notwendig, einige seltene Codons des tat-Gens gegen die jeweils synonymen, aber in E. coli häufiger verwendeten Codons auszutauschen. Ferner mußte eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (argU) koexprimiert werden, um die für NMR-Spektroskopie nötigen Proteinmengen herstellen zu können. Expression und Reinigung von CAEV-Tat mittels Standardverfahren wie Metallionenaffinitätschromatographie über einen Histidinanhang oder die Expression und Reinigung als GST-Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Daher mußte ein individuell auf CAEV-Tat zugeschnittenes Reinigungsprotokoll etabliert werden. Aufgrund seines hohen pIs von 11 konnte CAEV-Tat über Kationenaustauscher-Chromatographie an CM-Sepharose und anschließende Hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Ausbeuten an Protein ließ sich durch Verwenden von Heparin-Sepharose als Kationenaustauscher-Material noch weiter steigern. CAEV-Tat zeigte in CD- und NMR-Spektren typische Charakteristika eines a-helikalen Proteins. Da CAEV-Tat in Konzentrationen über 400 µM aggregierte und daher nicht für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen, die höher Konzentrationen voraussetzen, geeignet war, wurde eine cysteinfreie Mutante von CAEV-Tat kloniert und nach dem für das Wildtyp-Protein etablierten Protokoll gereinigt. Die Mutante erwies sich als weitaus NMR-tauglicher und zeigte keinerlei Aggregationstendenzen bei Konzentrationen von 1 mM. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß Wildtyp-Protein und cysteinfreie Mutante strukturell identisch sind. Somit steht mit der cysteinfreien Mutante ein für weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignetes Konstrukt zur Verfügung. Für das CAEV-Tat homologe Maedi-Visna-Virus-Tat-Protein war eine Interaktion mit der basischen und der Leucin-Zipper-Domäne der beiden zellulären Transkriptionsfaktoren Jun und Fos postuliert worden (Morse et al., 1999). Für spätere Vergleichsstudien mit CAEV-Tat und Jun / Fos zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit der Beschaffung der entsprechenden Nukleotidsequenzen und der Generierung expressionsfähiger Klone von c-jun, c-fos sowie und fosbZIP bereits wichtige Voraussetzungen für spätere Bindungsstudien mit NMR-Spektroskopie geschaffen. JunbZIP (222-331) konnte bereits erfolgreich als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose gereinigt werden. Nun aus dem lambdoiden Phagen HK022 fungiert bei einer Superinfektion des Wirts mit dem l-Phagen als Terminator der viralen Genexpression. Um spätere Strukturuntersuchungen an diesem System durchführen zu können, mußte zunächst ein auf die E. coli codon usage optimiertes synthetisches Gen für Nun generiert werden. Hierbei erwies sich die Methode nach Kim (1989) als erfolgreich. HK022 konnte mit Ausbeuten von 70 mg/l Kulturmedium über Kationenaustauscher-Chromatographie mit Heparin-Sepharose gereinigt werden. Erste strukturelle Befunde (CD, HSQC-Spektren, Messung des hydrodynamischen Radius) deuten darauf hin, daß es sich bei Nun um ein Protein mit nur gering ausgeprägter Tertiärstruktur handelt. Ein Fragment (1-53) des Antiterminator-Protein N aus dem Phagen l konnte kloniert und als Fusionsprotein mit Ubiquitin exprimiert werden. Die Reinigung erfolgte über Affinitätschromatographie und einen abschließenden RP-HPLC-Schritt nach der Abspaltung des Ubiquitinanteils. l N-Protein liegt in Lösung unstrukturiert vor. Dieser Befund wurde auch für das N(1-53)-Peptid durch CD-Spektroskopie und die Bestimmung des hydrodynamischen Radius erhalten. Bei der Bindung von 15N-N(1-53) an nutboxB-RNA bildet sich ein Komplex, der höchstwahrscheinlich weitgehend die gleiche Struktur wie der Komplex aus N(1-36) und nutboxB-RNA besitzt. Bei Zugabe des Wirtsfaktors NusA aus E. coli zu diesem binären Komplex kommt es auf Seiten von l N (1-53) zu Veränderungen im HSQC-Spektrum, was auf eine spezifische Interaktion zwischen dem längeren l-Peptid und NusA hindeutet. Hiervon sind vor allem die nicht im Komplex mit nutboxB vorliegenden Reste von l N betroffen. Weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen werden klären, inwieweit die nutboxB-RNA an der Interaktion mit NusA beteiligt ist. Mit der Etablierung eines Reinigungsprotokolls für N(1-53) und für E. coli NusA konnten wichtige Voraussetzungen hierfür bereits erfüllt werden.
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In vitro-Evolution und Analyse der biophysikalischen Grundlagen der Proteinstabilität
(2003)
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Andreas Martin
- In der vorliegenden Arbeit wurde Proside, ein Selektionssystem für stabilisierte Proteine, weiterentwickelt und dafür genutzt, die molekularen Ursachen erhöhter Proteinstabilität zu analysieren. Für diese in vitro-Evolutionsexperimente diente das Kälteschockprotein Bs-CspB aus Bacillus subtilis als Modellprotein. Zusätzlich wurde das Gen-3-Protein (G3P) des Phagen fd, eine essentielle Komponente von Proside, thermodynamisch charakterisiert und sein Faltungsmechanismus aufgeklärt. Proside basiert auf phage display und verknüpft die thermodynamische Stabilität eines Proteins mit einem sehr gut selektierbaren Parameter, der Infektiosität filamentöser Phagen. Die Größe der selektierbaren Mutantenbibliotheken konnte durch Veränderungen des Phagenkonstrukts und der zu ihrer Erstellung verwendeten molekularbiologischen Methoden auf mehr als 108 Varianten gesteigert werden. Gleichzeitig wurde mit diesen Modifikationen der rekombinationsbedingte Verlust von Gastproteinsequenzen aus dem Phagengenom deutlich reduziert. Das Gen-3-Protein, in welches diese Gastproteine inseriert werden, wurde mittels Proside um mehr als 10 kJ/mol stabilisiert. Somit sind jetzt in vitro-Selektionen bei Temperaturen von bis zu 60 °C möglich, ohne dass die Stabilität der Phagenproteine selbst limitierend für die Optimierung der Gastproteine wirkt. Das Potential der so optimierten Proside-Methode konnte anhand der Selektionen stark stabilisierter Varianten von Bs-Csp gezeigt werden. Dieses Protein unterscheidet sich von seinem um 15,8 kJ/mol stabileren Homologen Bc-Csp aus dem thermophilen Bacillus caldolyticus in 12 von 67 Resten, die alle an der Oberfläche des Proteins liegen. Die in vitro-Selektionen nach Sättigungsmutagenese an sechs dieser zwölf Positionen in Bs-CspB lieferten eine Vielzahl von stabilisierten Mutanten, die, abhängig von den Selektionsbedingungen, unterschiedliche Stabilisierungsprinzipien aufzeigten. Während bei der Selektion in Gegenwart des ionischen Denaturierungsmittels GdmCl vor allem die hydrophoben Wechselwirkungen verbessert wurden, führte die Selektion bei erhöhter Temperatur zusätzlich zur Optimierung der Coulomb´schen Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche. Für die stabilste der selektierten Varianten von Bs-CspB ist der Mittelpunkt des thermischen Entfaltungsübergangs um mehr als 28 Grad relativ zum Wildtypprotein angehoben und liegt damit auch deutlich höher als der Wert des thermostabilen Referenzproteins Bc-Csp. Die Variante unterscheidet sich von Bc-Csp an allen sechs randomisierten Positionen. Dennoch nutzen die beiden Proteine ähnliche Strategien für eine hohe Thermostabilität, insbesondere zeichnen sie sich durch eine im Vergleich zu Bs-CspB optimierte Verteilung der Oberflächenladungen aus. Ladungsnetzwerke auf der Proteinoberfläche sind für die Thermostabilität der Kälteschockproteine sehr wichtig. Basierend auf diesen Erkenntnissen war es möglich, ein hyperstabiles Kälteschockprotein mit lediglich vier Austauschen relativ zu Bs-CspB zu konstruieren. Der Schmelzpunkt dieser Variante liegt bei 85,6 °C, d.h. 31,6 Grad über dem des Wildtypproteins. Sie ist damit sogar stabiler als das homologe Csp aus dem hyperthermophilen Organismus Thermotoga maritima. Die Stabilitätsuntersuchungen des für die Phageninfektion essentiellen N-terminalen Fragments des Gen-3-Proteins reflektieren dessen Aufbau aus den beiden Domänen N1 und N2. Während die Stabilität der Domäne N1 unabhängig von Domäne N2 ist, wird Domäne N2 wesentlich durch die Interdomänenwechselwirkungen mit N1 stabilisiert, und ihre Entfaltung ist mit der Domänendissoziation gekoppelt. Die vier mittels Proside gefundenen Mutationen in G3P stabilisieren beide Domänen unabhängig voneinander und verdeutlichen die generellen Prinzipien, die der Stabilität von Zweidomänenproteinen zugrunde liegen. Neben der Erhöhung der intrinsischen Stabilitäten der individuellen Domänen spielt die Verbesserung der Domäneninteraktionen eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung des gesamten Proteins. Die Rückfaltung von G3P ist ein sequentieller Prozess. Domäne N1 faltet innerhalb weniger Millisekunden, gefolgt von der Faltung der N2-Domäne, die nach etwa 3 min abgeschlossen ist. Im letzten Schritt assoziieren die beiden Domänen in einer extrem langsamen Reaktion. Sie zeigt eine Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) und ist in ihrer Rate limitiert durch die trans-cis-Isomerisierung an Pro213 in der Gelenksubdomäne von N2. Durch die Assoziation von N1 und N2 werden beide Domänen in ihrer Entfaltung gekoppelt, so dass Domäne N1 bis zu 150.000-fach langsamer entfaltet als in isolierter Form. Die Prolin-limitierte sehr langsame Domänenassoziation ist möglicherweise für die Funktion des G3P bei der Infektion von E. coli von Bedeutung. Sie erlaubt es, die Domänen nach Bindung an den F-Pilus so lange dissoziiert zu halten, bis der Pilus zurückgezogen ist und Domäne N1 mit dem Corezeptor TolA an der Zelloberfläche wechselwirken kann.
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Städtetourismus in Regensburg. Images, Motive und Verhaltensweisen von Altstadttouristen
(2003)
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Bert Bödeker
- In den letzten Jahrzehnten verzeichnete der Städtetourismus einen großen Bedeutungsanstieg. Trotzdem liegen nur wenige systematische Studien vor, die zu einem besseren Verständnis städtetouristischer Aspekte beitragen. Die vorliegende Arbeit sollte ein Baustein zur Reduzierung dieser Defizite sein und der Fragestellung nachgehen, welche Angebotsfaktoren, Images und Motive im Städtetourismus existieren, welche Rolle Destinationsmarketing und Reisemedien dabei spielen und wie sich dies im Verhalten der Touristen äußert. Die Wahl des Fallbeispiels fiel auf Regensburg, da die Stadt zu den großen Gewinnern des Städtereise-Booms und den wichtigsten Reisezielen in Bayern gehört. Die empirische Basis dieser Studie beruht auf einer Verknüpfung verschiedenster qualitativer und quantitativer Methoden. Als Rahmen der Erhebungen wurden Statistiken herangezogen, Expertengespräche geführt und Prospekte auf der Internationalen Tourismus Börse ausgewertet. Der Hauptteil der Empirie bestand aus Touristenbefragungen, verfolgenden Beobachtungen (Trackings) und der Inhaltsanalyse von Reisemedien, ergänzt durch eine Kartierung, Passantenzählungen, Busfahrerbefragungen und teilnehmende Beobachtungen bei Stadtführungen. Die Zusammenführung der Einzelergebnisse ergab, dass sich die Touristen auf einen räumlich engen Bereich der Altstadt konzentrieren, der zugleich die größte Dichte an saniertem historischem Baubestand, historischen Sehenswürdigkeiten und Einrichtungen des Einzelhandels sowie der Gastronomie bietet. Diese touristische Altstadt ist über viel benutzte Korridore mit mehreren Großparkplätzen verbunden und wird durch einen kleinen, direkt anschließenden Teil des Haupteinkaufsbereichs ergänzt, der ebenfalls häufig von Touristen frequentiert ist, obwohl er einen geringen historischen Baubestand aufweist. Die Touristen in der Regensburger Altstadt haben kein tieferes Interesse an den kulturhistorischen Sehenswürdigkeiten, sondern suchen überwiegend ein kulturangeregtes Erlebnis, bei dem die Gebäude als ästhetische Kulisse für einen Stadtbummel dienen. Wichtige Elemente dieses Stadtbummels sind die Schaufenster und Geschäfte. Touristen unterscheiden sich beim Bummeln nicht grundlegend von den Einheimischen, sie geben aber kaum Geld im Einzelhandel aus. Im Gegensatz dazu wird beim Besuch gastronomischer Einrichtungen, der fast grundsätzlich zu einem touristischen Aufenthalt in Regensburg gehört, nicht so sehr auf den Geldbeutel geschaut und oft viel Zeit verwendet. Die Touristen in der Regensburger Altstadt zeigen große Verhaltensähnlichkeiten, z.B. bei der Routenwahl. Zugleich lassen sich innerhalb der relativ begrenzten Reiseart des Altstadttourismus aber verschiedene Reisestile unterscheiden. Etwa der Hälfte der Touristen geht es bei dem Besuch hauptsächlich um die Besichtigung. Die andere Hälfte der Touristen will ebenfalls die Altstadt und ihre Sehenswürdigkeiten besichtigen, zeigt aber ein großes Interesse an der Verknüpfung der Besichtigung mit der Nutzung anderer städtischer Angebotsformen wie dem Einzelhandel. Das Bild, das die Regensburg-Touristen von der Stadt haben, ist sehr eng eingebettet in das allgemeine Fremdimage. Trotz der Verwendung desselben Stereotyps sind die Assoziationen der Regensburg-Touristen aber deutlich detaillierter. Die Assoziationen wandeln sich außerdem mit der Anzahl der Aufenthalte in Regensburg weiter und werden durch neue ergänzt. Der grundsätzliche Stereotyp wird dadurch jedoch kaum beeinflusst und erst nach mehrmaligen Aufenthalten nimmt der Anteil individueller Assoziationen, die den öffentlichen Stereotyp ergänzen, merklich zu. Die Nutzung von Informationsmaterialien wie Reiseführer oder Prospekte wiederum beeinflusst die Assoziationen nicht in einem nennenswerten Umfang. Bei der Ermittlung des Images über Rating-Skalen zu vorgegebenen Aussagen über die Stadt zeigt sich noch sehr viel mehr als bei den Assoziationen eine erstaunlich hohe Stabilität der Antworten. Ein Besuch in Regensburg verändert die Einschätzungen nur dahingehend, dass sie mit größerer Sicherheit zum Ausdruck gebracht werden können. Diese Stabilität der zentralen Stereotype bewirkt, dass Touristen am Reiseziel weitgehend das Bild von Regensburg haben, das sie bereits hatten, bevor sie über eine Reise nach Regensburg nachdachten. Auf der Basis der empirischen Ergebnisse wurden verschiedene Aussagen zum Altstadttourismus in Regensburg und Empfehlung für Marketing und Planung formuliert. Die Integration der bislang in der Tourismusforschung kaum angewandten Trackingmethode in die Untersuchung ermöglichte einerseits eine Überprüfung von Befragungs- und Kartierungsergebnissen und erbrachte andererseits zahlreiche Erkenntnisse zum Verhalten von Städtetouristen. Die Trackings erwiesen sich als enorm aufwendige, aber sehr ergiebige Erhebungsmethode, von deren Ausbau wichtige Grundlagenerkenntnisse zum Verhalten von Touristen zu erwarten sind.
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Die Funktion von Three rows bei der Schwesterchromatiden-Trennung in Drosophila melanogaster
(2003)
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Alf Herzig
- In der Mitose werden die Schwesterchromatiden getrennt und auf beide Tochterzellen verteilt. Die Trennung der Schwesterchromatiden erfordert die proteolytische Spaltung des Scc1-Proteins. Scc1 ist Bestandteil des Kohäsin-Komplexes, der die Schwesterchromatiden nach ihrer Entstehung in der S-Phase bis zum Beginn der Anaphase gepaart hält. Die Protease, die durch Scc1-Spaltung die Schwesterchromatiden-Trennung einleitet, heißt Separase. Die Separase wird erst dann aktiviert, wenn alle Chromosomen bipolar mit dem mitotischen Spindelapparat verbunden sind. Die Aktivierung der Separase erfordert die Ubiquitinabhängige Degradation des Securins, einer inhibitorischen Untereinheit der Separase. Weitere Mechanismen der Separase-Regulation sind noch nicht vollständig verstanden. Das Securin von Drosophila melanogaster ist das Protein Pimples (PIM). Die Separase (SSE) von D. melanogaster besitzt zwar eine Protease-Domäne, aber die N-terminale regulatorische Domäne, die in Separasen anderer Eukaryoten gefunden wird, fehlt in SSE fast vollständig. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PIM und SSE einen heterotrimeren Komplex mit dem Protein Three rows (THR) bilden. THR besitzt Bindungsstellen für PIM und SSE. In anderen Organismen besitzt die N-terminale Separase-Domäne Bindungsstellen für das Securin und die Protease-Domäne der Separase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass THR strukturell der N-terminalen Domäne anderer Separasen entspricht. Die Separase aus D. melanogaster scheint demnach aus zwei Untereinheiten aufgebaut zu sein. Während SSE die katalytische Domäne der Separase beinhaltet, wurde hier gezeigt, dass THR eine regulatorische Separase-Untereinheit ist. THR wird nach dem Metaphasen-Anaphasen-Übergang proteolytisch gespalten. Diese Spaltung erfolgt nur in funktionellen Separase-Komplexen, und die Spaltstelle in THR entspricht dem Konsensus einer Separase-Spaltstelle. Mutationen in dieser Spaltstelle unterbinden die THR-Spaltung. Diese Daten legen nahe, dass THR durch die katalytische Untereinheit der Separase gespalten wird. Die Expression von nicht spaltbaren THR-Varianten führt zu frühembryonaler Letalität bei erniedrigter Temperatur. Diese Letalität wird unterdrückt, wenn die katalytische Aktivität der Separase erniedrigt wird. Die Spaltung von THR trägt demnach zur Inaktivierung der Separase bei. Die Spaltung von THR ist vor allem während der Zellularisierung wichtig, einem insektenspezifischen Prozess in der Embryonalentwicklung von D. melanogaster. Während der Zellularisierung führt die ausbleibende Inaktivierung der Separase zu Defekten im Tubulin-Zytoskelett. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Separase in D. melanogaster weitere Substrate neben den Kohäsinen und andere Funktionen als in der Schwesterchromatiden-Trennung hat.
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Bedeutung der Verpaarungsqualität für Verhalten und Gesundheit von Spitzhörnchen (Tupaia belangeri)
(2003)
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Frank Uhl
- Ziel dieser Arbeit war es, Ursachen verschiedener Verpaarungsqualitäten bei Spitzhörnchen und deren Auswirkung auf verschiedene physiologische Parameter zu erfassen. Dazu wurden die Fragestellungen dieser Arbeit in zwei unterschiedlichen Versuchsansätzen bearbeitet. Im ersten wurden Weibchen entweder mit einem harmonischen oder unharmonischen Partner im Versuch eingesetzt, im zweiten wurden die Weibchen je einmal mit einem harmonischen und einem unharmonischen Partner verpaart. Der Versuch bestand aus einer sechswöchigen Verpaarungsphase mit abschließender Trennung der Tiere. Während des Versuchs wurde das Verhalten der Tiere aufgezeichnet und mehrfach Blutproben entnommen. Es konnte gezeigt werden, dass die unharmonische Verpaarung eine Konsequenz aus der Ablehnung des Männchens durch das Weibchen als Sexualpartner ist. Dabei ist die „Sympathie“ oder „Antipathie“ für bestimmte Männchen individuell unterschiedlich und vermutlich genetisch determiniert. Die physiologischen Konsequenzen einer harmonischen bzw. einer unharmonischen Verpaarung waren gegenläufig. So stieg bei harmonisch verpaarten Tieren, Männchen wie Weibchen, die Immunkompetenz an und die Stresshormonkonzentrationen im Serum sanken. Bei unharmonisch verpaarten Tieren verhielt es sich umgekehrt. Die verschiedenen Verpaarungsqualitäten manifestierten sich auch im Verhalten der Tiere. Die Weibchen in unharmonischen Paaren waren unruhig; es kam häufig zu Streit zwischen den Tieren. In harmonischen Paaren waren die Weibchen ruhiger und suchten die Nähe des Partners, es bestand eine enge soziale Bindung zwischen Männchen und Weibchen. Diese enge soziale Bindung führte zu den typischen Effekten von social support. Trennte man die Paare, so gingen die physiologischen Werte von Tieren aus unharmonischen Paaren auf ihre Ausgangswerte zurück. Bei den zuvor harmonisch verpaarten Weibchen jedoch sank die Immunkompetenz unter das Niveau der Ausgangswerte ab, während die Stresshormonkonzentration gegenüber den Ausgangswerten erhöht war. Nach 6 Wochen hatte der größte Teil der Tiere die Ausgangswerte wieder erreicht. Ein Teil der Weibchen begann jedoch sich nach der Trennung selbst zu verstümmeln. Bei diesen Tieren war noch sechs Wochen nach der Trennung, die Immunkompetenz verringert und die Stresshormon-konzentrationen erhöht.
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Untersuchungen zur Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPRR
(2003)
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Jan Eickhoff
- Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Funktion der PTPRR in der zellulären Signaltransduktion mit den Schwerpunkten Substrate, Regulation und Beteiligung an biologischen Prozessen. Von besonderem Interesse war die Rolle der PTPRR bei der Tumorentstehung und Transformation von Zellen. Dabei wurden noch unveröffentlichte Daten bestätigt, daß PTPRR die MAPKn ERK1 und 2 über ein neuartiges MAPK-Bindungsmotiv, das KIM, sowohl in vitro als auch in vivo binden und dephosphorylieren kann. Somit ist PTPRR die erste tyrosinspezifische Phosphatase, der eine Dephosphorylierung von MAPKn in höheren Eukaryonten nachgewiesen wurde. Eine weitere Analyse durch transiente Überexpression der PTPRR in HEK293-Zellen ergab, daß PTPRR spezifisch die MAPKn ERK1/2, nicht jedoch p38 Kinase oder JNK/SAPK dephosphoryliert. Zudem wurde über Transkriptionsaktivierungs-experimente der Nachweis erbracht, daß PTPRR die ERK1/2-vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren negativ beeinflussen kann. Bei der näheren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK1/2 wurde eine vorher unbekannte Verknüpfung des PKA mit dem ERK-Signalweg aufgedeckt. Es wurde gezeigt, daß PKA den im KIM gelegenen Serinrest in der Position 321 der Aminosäuresequenz der PTPRR phosphorylieren und so die Bindung und Dephosphorylierung der ERK1/2 in vivo inhibieren kann. Dies weist auf einen neuartigen Mechanismus hin, über den PKA die Aktivierung des MAPK-Signalwegs reguliert. Ein weiterer Effekt, der nachgewiesen wurde, ist die Inhibition der c-Src-induzierten Phosphorylierung des KIF1C, welcher am retrograden Transport vom Golgi-Apparat zum Endoplasmatischen Retikulium beteiligt ist. Damit wurde PTPRR als erste PTPase mit einer Dephosphorylierung des KIF1C in Verbindung gebracht. Über in vitro-Assoziation mit GST-PTPRR im präparativen Maßstab mit anschließender Sequenzierung der gebundenen Proteine wurden die Hitzeschockproteine HSP70 und GRP78 als in vitro Bindungspartner der PTPRR identifiziert. Die nähere Untersuchung der Bindung ergab, daß diese innerhalb der Juxtamenbrandomäne der PTPRR erfolgt und von ATP abhängig ist. Diese Art der Bindung ist ein Anzeichen dafür, daß die Wechselwirkung spezifisch und PTPRR ein Substrat der Chaperone HSP70 und GRP78 ist, welche für die korrekte Faltung von Proteinen sorgen. Da HSP70 ebenfalls mit anderen Mitgliedern des ERK-Signalwegs wechselwirken kann und zudem aus Komplexen mit den MAPK-Kaskade-Gerüstproteinen KSR und HSP90 isoliert wurde, ergibt sich aus der Assoziation von PTPRR und HSP70 die Möglichkeit einer Beteiligung an einem Multiprotein-ERK-Signalkomplex. Bei der Analyse der endogenen Proteinexpression der PTPRR wurde erstmals das Auftreten verschiedener Isoformen in humanen Zellen nachgewiesen. Über Immunfluoreszenz wurde gezeigt, daß die zytoplasmatische Isoform PTPRRcyto im gesamten Zytoplasma vorkommt, während die Isoform PTPRR TM in perinukleären Vesikeln lokalisiert ist. Ein Vergleich der Effekte verschiedener überexprimierter Isoformen zeigte Unterschiede sowohl bei der PDGF-induzierten Phosphorylierung der ERK1/2 als auch bei der c-Src-vermittelten Phosphorylierung des KIF1C. Zudem wurden in Transkriptionsaktivierungsexperimenten Unterschiede in der ERK1/2-vermittelten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren detektiert. In allen Fällen hatte die zytoplasmatische Isoform die stärkste inhibitorische Wirkung. Ferner wurde in stabil mit PTPRR transfizierten NIH3T3-Zellen der Effekt dieser PTPase auf biologische Prozesse untersucht. Dabei wurde ein negativer Einfluß der Überexpression der PTPRR auf die basale und PDGF-induzierte Proliferation sowie auf die Migration der Zellen beobachtet, welche beide an der Tumorentstehung beteiligt sein können. Die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK für diese Effekte wurde dadurch belegt, daß eine Mutante der PTPRR, die ERK1/2 nicht mehr bindet, in beiden Experimenten keine Wirkung zeigte. Außerdem konnte die Überexpression der PTPRR sowie der verwandten PTPase STEP die durch die Onkogene v-Ki-Ras- und Her2-, nicht jedoch die durch v-ErbB- oder v-Fms-induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen in Focusbildungs-experimenten verhindern. Zudem reduzierte die Überexpression der PTPRR die Her2-vermittelte Proliferation von Zellen unter Entzug von Wachstumsfaktoren. Diese Daten liefern nicht nur Hinweise auf eine potentiell tumorsupprimierende Wirkung der PTPRR und STEP, sondern gewähren auch Einblicke in die von den Onkogenen ausgehenden Signalwege, die zur Transformation von Zellen führen. Auch wurde nachgewiesen, daß der Expressionslevel der PTPRR in Tumorzellinien und –geweben im Vergleich zu nichttransformierten Zellinien und Geweben erhöht ist. Es ergeben sich erste Hinweise auf einen Rückkopplungsmechanismus, mit dem Zellen versuchen könnten, die durch Onkogene häufig hyperaktivierten ERKn negativ zu regulieren.
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Novel Precursors for Polymer-Protein-Conjugate Synthesis via Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization
(2003)
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Christine Maria Schilli
- The RAFT polymerization of N-isopropylacrylamide with two different chain transfer agents, namely benzyl 1-pyrrolecarbodithioate and cumyl 1-pyrrolecarbodithioate, yielded polymers with narrow molecular weight distributions as well as Mn values that were in good agreement with the calculated ones. A comparison between the Mn values determined from gel permeation chromatography, GPC, and the values from MALDI-TOF mass spectrometry showed that the molecular weights obtained from GPC using polystyrene standards were considerably higher. A relation between log Mn,MALDI and log Mn,GPC was established, which permitted construction of a calibration curve for PNIPAAm polymers. In-situ Fourier-transform near-infrared spectroscopy was applied for the reliable determination of monomer conversions and it indicated living characteristics. Both polymerization processes showed an induction period that seems to be correlated with a retardation in rate, where the induction time is higher for the cumyl chain transfer agent as compared to the benzyl chain transfer agent of the same concentration. The induction periods decrease with decreasing transfer agent concentration and were explained in terms of the different stabilities of the respective radicals that add to monomer in the reinitiation step. The more stable cumyl radical adds slower than the benzyl radical. Both UV spectroscopy and MALDI-TOF mass spectrometry confirm the presence of the expected dithiocarbamate endgroups. MALDI-TOF characterization of the polymer samples showed the transfer agent endgroups together with some initiator-derived polymers. Endgroups that seemed to originate from disproportionation or transfer were the result of fragmentation under MALDI conditions as was shown by a post source decay analysis and MALDI-TOF characterization of the hydrolyzed polymer. With amine-reactive diacetone acrylamide, 2-vinyl-4,4-dimethyl-5-oxazolone and N-hydroxysuccinimide methacrylate, new monomers were polymerized via RAFT in a controlled manner. Poly(diacetone acrylamide) and poly(2-vinyl-4,4-dimethyl-5-oxazolone) showed low polydispersities and good control over molecular weight, where poly(N-hydroxysuccinimide methacrylate) displayed relatively high polydispersities despite the controlled polymerization evident from the monomodal GPC traces. These amine-reactive polymers were subsequently used for successful conjugation to the primary amino group of the model peptide glycine-leucine. For poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(acrylic acid), PNIPAAm-b-PAA, it was demonstrated that hydrogen bonding between N-isopropylacrylamide and acrylic acid units influences strongly its behavior in both the solid state and in solution. The block copolymers form micelles in aqueous solutions in dependence of pH and temperature. Cloud point measurements indicated the formation of larger aggregates at pH 4.5 and temperatures above LCST, whereas micelles formed at pH 5-7 and temperatures above LCST. At pH 5.6 and 50 °C, only micelles were found, whereas, at lower temperatures, larger aggregates and micelles coexist. Formation of larger aggregates by hydrogen bonding interactions was revealed by IR and Raman spectroscopy as well as by cryogenic transmission electron microscopy and dynamic light scattering. Differential scanning calorimetry yielded glass transition temperatures of PNIPAAm-b-PAA that were well above the transition temperatures of the homopolymers, demonstrating molecular interactions between the acrylic acid and the N-isopropylacrylamide blocks. Conjugation of sulfhydryl-terminated PNIPAAm to thiol disulfide exchange reagents and maleimides was probed for later conjugation to proteins. Evaluation of the different cross-linking systems resulted in the choice of maleimides as cross-linkers for subsequent conjugation to the protein streptavidin. Sulfhydryl-terminated PNIPAAm-b-PAA was conjugated to the streptavidin mutant S139C using a bismaleimide cross-linker and also direct conjugation via disulfide linkage. Both conjugations were successful and proceeded with more than 50 % conversion. Conjugation of PNIPAAm and PNIPAAm-b-PAA was also achieved by non-covalent attachment of the biotinylated polymers to wild-type streptavidin. Conjugates of wild-type streptavidin with biotinylated PNIPAAm-b-PAA were found to remain dissolved at temperatures above LCST even at very low pH values, which was in contrast to the observed precipitation of the unconjugated block copolymer at pH <= 4.5. Conjugates of wild-type streptavidin with biotinylated PNIPAAm of different molecular weights formed aggregates in aqueous solutions above LCST and a dependence of aggregate size on the size of the polymer was found
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Strukturbestimmung des Birkenpollenallergens Bet v 4
(2002)
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Jörg Nerkamp
- Bet v 4 ist ein minores Allergen aus Birkenpollen (Betula verrucosa). Es gehört zur Familie der Polcalcine, kleinen Calcium bindenden Allergenen mit je 2 EF-Hand Strukturmotiven, die in einer Vielzahl höherer Pflanzen gefunden werden. Es wurden effektive Strategien zur Präparation von rekombinantem Bet v 4 entwickelt, die auch eine Markierung mit dem Isotop 15N erlaubten. Zwei hervorstechende Eigenschaft von Bet v 4 wurden bei der Reinigung ausgenutzt: Bet v 4 ist ein saures Protein, was eine Reinigung mittels Chromatofokussierung erlaubte. Aufgrund seiner Thermostabilität konnte Bet v 4 durch Kochen eines Proteinrohextraktes von hitzelabilen bakteriellen Proteinen abgetrennt werden. Somit stand genügend Bet v 4 zur Verfügung, um eine strukturelle Charakterisierung durchzuführen und letztendlich seine Struktur mittels NMR-Spektroskopie zu bestimmen. Anhand von ESI-MS, nativer PAGE und NMR-Diffusionsmessungen konnte gezeigt werden, dass Bet v 4 monomer vorliegt. Die strukturelle Charakterisierung mittels CD-Spektroskopie wies auf einen hohen Anteil alpha-helicaler Strukturelemente in der Calcium-Form hin, der anhand der chemischen Verschiebungen von alpha-Protonen, helixtypischer NOEs und vicinaler Kopplungskonstanten bestätigt wurde. Der Entzug von Calcium hat eine Verringerung des CD-Signals, jedoch keinen kompletten Verlust der Sekundärstruktur zur Folge. NMR-Spektren ließen vermuten, dass Apo-Bet v 4 keine geordnete dreidimensionale Struktur mehr besitzt. Der strukturelle Einfluss von Calcium weist mehr auf eine regulatorische Funktion von Bet v 4 als Calcium-Sensorprotein denn auf auf eine Funktion als Calcium-Speicherprotein. Durch die Auswertung von homonuklearer 2D- und heteronuklearen 3D-Spektren konnte die Struktur von Calcium gebundenem Bet v 4 gelöst werden. Die beiden EF-Hand-Motive sind durch einen flexiblen Linker miteinander verbunden und werden durch ein kurzes Faltblatt zusammengehalten. Während die beiden Calciumbindungsschleifen und die sie unmittelbar flankierenden Regionen eine starre Struktur eine aufweisen, sind die terminalen Bereiche experimentell unterbestimmt, was jedoch mit den Daten aus NMR-Relaxationsmessungen übereinstimmt, die in diesen Bereichen eine erhöhte Flexibilität nachwiesen. Der Aminoterminus ist relativ unstrukturiert. Die Kenntnis der Struktur einer Vielzahl von Allergenen wird womöglich eine Antwort auf die Frage liefern, was ein Protein zum Allergen macht.
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Synthese und Charakterisierung neuer Pentamethylcyclopentadienyl-Halbsandwichkomplexe des Tantals mit N-haltigen Liganden
(2003)
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Achim Goller
- Halbsandwichkomplexe mit Metallen der 5. Gruppe des Periodensystems (M = V, Nb, Ta) sind in großer Anzahl bekannt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Verbindungen sind Vanadiumkomplexe, es gibt wesentlich weniger Niobkomplexe und am kleinsten ist die Anzahl der Tantalverbindungen. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, ausgehend von Cp*TaCl4 (1) neue Pentamethylcyclopentadienyl-Halbsandwichkomplexe des Tantals zu synthetisieren und zu charakterisieren. Halbsandwich-Azidokomplexe Zur Darstellung neuer Halbsandwich-Azidokomplexe des Tantals wurde Cp*TaCl4 (1) mit Trimethylsilylazid, Me3SiN3, zur Reaktion gebracht. Dazu wurde 1 mit einem zunehmenden Überschuss an Trimethylsilylazid umgesetzt, um einen sukzessiven Austausch der Chloroliganden gegen Azidoliganden zu erreichen. Unter milden Bedingungen, d. h. bei der Reaktion von 1 mit einer stöchiometrischen Menge an Trimethylsilylazid entstand zunächst der zweikernige Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Monoazido-Trichloro-Tantal-Dimer (18). Durch Erhöhung der Reaktionstemperatur und Verlängerung der Reaktionszeiten konnten die restlichen Chloroliganden schrittweise weiter durch terminale Azidoliganden substituiert werden. So führte die Umsetzung von Cp*TaCl4 (1) mit einem zehnfachen Überschuss an Trimethylsilylazid bei Raumtemperatur nach 2-3 h zum disubustituierten Produkt Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Dichloro-Tantal-Dimer (19), der trisubstituierte Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Triazido-Monochloro-Tantal-Dimer (20) entstand bei gleichem Überschuss an Me3SiN3 nach 18 h in siedendem CH2Cl2. Der Tetra(azido)-Halbsandwichkomplex (21) wurde schließlich erhalten, als die Ausgangsverbindung Cp*TaCl4 (1) mit einem zwanzigfachen Überschuss an Trimethylsilylazid drei Tage lang in Toluol am Rückfluß (110°C) erhitzt wurde. Triazolato-Halbsandwichkomplexe Triazolato-Halbsandwichkomplexe des Tantals wurden erhalten, wenn Cp*TaCl4 (1) mit den beiden silylierten Vorstufen 4,5-Di(methoxycarbonyl)-1-trimethylsilyl-1,2,3-triazol (40) und 4,5-Di(ethoxycarbonyl)-trimethylsilyl-1,2,3-triazol (41) zur Reaktion gebracht wurde. Unter Freisetzung von Trimethylchlorsilan wurde ein Chloroligand von 1 durch einen Triazolato-Liganden substituiert. Interessant war die in diesem Fall auftretende Koordinierung der Alkoxysauerstoffatome der Estergruppen von 42 und 43 in Position 5 an das Metallzentrum, gefolgt von einer intramolekularen Wanderung der Alkylreste an die Lewis-basischen Stickstoffatome in Position 3, wodurch fünfgliedrige Aza-oxo-metallacyclen entstanden. Phosphoraniminato-Komplexe An den Azidoliganden des Halbsandwichkomplexes Pentametylcyclopentadienyl-Triazido-Monochloro-Tantal-Dimer (20) wurde die Staudinger-Reaktion mit Triphenylphosphan durchgeführt. Im Laufe von 3 Tagen entstand in siedendem Toluol bei Anwesenheit eines Überschusses an Triphenylphosphan der azidoverbrückte Di(azido)-phosphoraniminato-Halbsandwichkomplex Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Chloro-Triphenylphosphoraniminato-Tantal-Dimer (52) Nach zweistündiger Bestrahlung einer THF-Lösung von 20 in Anwesenheit des gleichen Überschusses an Triphenylphosphan wurde ebenfalls 52 isoliert. Eine Umsetzung an sämtlichen Azidoliganden von 20, die zum einkernigen Komplex Cp*TaCl(N=PPh3)3 (53) führte, konnte nach einer Reaktionszeit von 6 Tagen in siedendem Toluol erreicht werden. Schließlich wurde die thermische Staudinger-Reaktion an 20 noch mit Tris(1-cyclohepta-2,4,6-trienyl)phosphan durchgeführt; nach einer Reaktionszeit von 5 Tagen in siedendem Toluol wurde der zweikernige Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Chloro-Tricycloheptatrienylphosphoraniminato-Tantal-Dimer (54) erhalten. Bis(trimethylsilyl)amido-Trimethylsilylimido-Komplexe Die Umsetzung von Cp*TaCl4 (1) mit zwei Äquivalenten Lithium-bis(trimethylsilyl)-amid führte unter Abspaltung von zwei Äquivalenten LiCl und einem Äquivalent Trimethylchlorsilan zum Halbsandwichkomplex Pentamethylcyclopentadienyl-chloro-bis(trimethylsilylamido)-trimethylsilylimido-tantal(V) (88). Das entsprechende einkernige Azidoderivat 94 wurde durch Umsetzung von 88 mit einem Überschuss an Trimethylsilylazid erhalten Am Azidoderivat von 88, dem Halbsandwichkomplex Pentamethylcyclopentadienyl-bis-(trimethylsilyl)amido-azido-trimethylsilylimido-tantal(V) (94) wurde eine photoinduzierte Staudinger-Reaktion unter Verwendung eines Überschusses an Triphenylphosphan durchgeführt. Das Produkt war 95, ein einkerniger Komplex, der sowohl Nitridobrücken zum Phosphor als auch zum Silicium enthält. Der entsprechende triethyl-substituierte Komplex 96 wurde durch Umsetzung von 88 mit Triethyl-phosphanimin (66) unter Verwendung von Triethylamin als Hilfsbase erhalten. Die einkernigen Komplexe 94-96 sind auch deshalb von besonderem Interesse, weil sie nebeneinander 3 unterschiedliche N-haltige Liganden in der Koordinationssphäre enthalten.
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Analysis of alkali-inducible genes of Bacillus subtilis
(2003)
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Akram Atalla
- Using the DNA macroarray technique, it could be shown that more than 80 genes induced after alkali shock (Wiegert et al., 2001). While most of them are under the control of the alternative sigma factor (sigmaW), the remaining genes are under the control of one or more unknown regulator(s). By their signature, two of them kipR and yvdT code for regulatory proteins, while pspA, member of the sigmaW regulon, encodes another potential regulator. In this doctoral work, the genes kipR, yvd and pspA were analyzed. The kipR and yvdT genes code for a transcriptional regulator of the IcIR and TetR/AcrR family while the pspA encode a transcriptional anti-activator in E. coli . In Northern blot analyses, it could be shown that all three genes are induced after alkali shock. The transcription start points of the kipR and yvdT genes were identified by primer extension experiments, and it appeared that the transcription is dependent on a vegetative sigma A-like promoter. To identify genes which are under the negative control of the transcriptional anti-activator PspA, a DNA macroarray experiment was carried out. It turned out that several genes are repressed by a factor of at least three under conditions of PspA overproduction. By using the Far-western blot technique, a protein which might interact with the PspA protein was identified. This protein has a molecular weight approximately 50 kDa. In addition, expression of the pst operon ( pst stay for phosphate-specific transport) was analyzed which is induced after phosphate starvation and after alkaline shock. The genes of this operon are involved in the phosphate transport into the cytoplasma. By Northern-blot experiments, it could be shown that all genes of this operon are alkali-inducible. When the transcriptional start point was determined by primer extension, it turned out to be identical to the one determined under phosphate limitation. This transcription start point is preceded by a typical sigmaA-type promoter. Furthermore, alkali-induction is dependent on the PhoP-PhoR two-component signal transduction system. Phosphate-uptake experiments revealed that the uptake of inorganic phosphate was completely abolished after increasing the external pH value.
