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Regulation der Transkription: Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen der carboxyterminalen Domäne von E.coli NusA
(2005)
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Anke Eisenmann
- Die RNA-Synthese in der Zelle wird durch RNA Polymerasen (RNAPs) katalysiert und erfolgt in einem Zyklus aus Initiation, Elongation und Termination. In den letzten Jahren konnten durch die Aufklärung von Kristallstrukturen elongierender RNAPs vor allem Fortschritte im Verständnis der Elongationsphase erzielt werden, so daß die Elongation derzeit ein attraktives Forschungsgebiet darstellt. Während der Elongation bildet die RNAP einen stabilen Komplex mit DNA und RNA, der als Transkriptionselongationskomplex (TEC) bezeichnet wird, und über Tausende von Basenpaaren prozessiv ist, das heißt nicht dissoziiert. Lediglich an bestimmten DNA-Elementen, sogenannten Terminatoren, kann der TEC soweit destabilisiert werden, daß die Transkription beendet werden kann. Die Effizienz der Termination wird dabei durch Transkriptionsfaktoren reguliert. In E.coli wird die Entscheidung Elongation-versus-Termination an einem Terminator durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor NusA beeinflußt. NusA assoziiert während der Elongation mit dem TEC und fördert sowohl Pausen während der Transkription als auch die Termination. Dagegen wirkt NusA zusammen mit dem viralen Antiterminator-Protein lambda N selbst als Antiterminator und setzt die Terminationseffizienz herab. Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen bakteriellen NusA-Proteinen sowie biochemische Daten weisen darauf hin, daß NusA aus drei funktionellen Domänen besteht. Dabei wechselwirkt die aminoterminale Domäne mit den großen Untereinheiten der RNAP während die zentrale Domäne RNA-Interaktionen vermittelt. Die ungefähr 160 Aminosäuren umfassende carboxyterminale Domäne, NusACTD, ist nur in einigen NusA-Proteinen vorhanden. NusACTD ist auffallend negativ geladen und enthält eine Sequenzwiederholung. Für den konservierten aminoterminalen und zentralen Bereich von NusA wurden die Strukturen von T.maritima und M.tuberculosis mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Eine hochaufgelöste Struktur für NusACTD konnte dagegen erst in dieser Arbeit mit NMR-Spektroskopie gewonnen werden. NusACTD besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen NusA(353-416) (AR1)und NusA(431-490) (AR2), die ungefähr den zwei homologen sauren Sequenzbereichen entsprechen. Mit 15N-Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, daß die Domänen über eine flexible Linkerregion verbunden sind und keine definierte Orientierung zueinander einnehmen. Jede der Domänen weist fünf Helices auf, die eine (HhH)2-Faltung annehmen. Charakteristisch für die (HhH)2-Faltung sind jeweils zwei gegeneinander gepackte HhH-Motive, die zusammen mit der Verbindungshelix zwischen den Motiven einen kompakten hydrophoben Kern bilden. (HhH)2-Faltungen kommen häufig als selbständige Domänen vor, die DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. E.coli NusACTD wechselwirkt mit dem viralen lambda N-Protein sowie der carboxyterminalen Domäne der alpha Untereinheit der RNAP (alpha CTD). Zudem reguliert NusACTD die RNA-Bindung an die zentrale Domäne von NusA, indem es selbst mit den RNA-Bindungsstellen interagiert. Trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit erkennen AR1 und AR2 lambda N und alpha CTD auf unterschiedliche Art und Weise. In dieser Arbeit durchgeführte Titrationsexperimente weisen darauf hin, daß alpha CTD ausschließlich an AR2 bindet, während lambda N wahrscheinlich nur mit AR1 spezifische Kontakte ausbildet. Die Wechselwirkung von alpha CTD mit NusA ermöglicht in vitro eine RNA-Bindung an NusA. Es ist daher anzunehmen, daß AR2 eine autoinhibitorische Funktion besitzt. Zusätzlich scheinen die Wechselwirkungen von NusACTD und alpha CTD zur Stabilisierung der RNAP-NusA-Interaktion beizutragen. Die antiterminatorische Wirkung von lambda N beruht auf einer direkten Interaktion zwischen der RNAP und einer Region von lambda N außerhalb der NusA-Bindungsregion. Die lambda N-NusA-Wechselwirkung steigert die Antiterminationseffizienz von NusA wahrscheinlich über eine Stabilisierung der schwachen RNAP-lambda N-Interaktion. Der Vergleich der Struktur von AR1 im ungebundenen Zustand mit der kürzlich gelösten Röntgenkristallstruktur des NusA(350-424)-lambda N(34-47)-Komplexes unterstützt die Hypothese, daß die NusA-lambda N-Wechselwirkung nicht direkt am Mechanismus der Antitermination beteiligt ist, da nur geringe konformationelle Änderungen durch die Komplexbildung beobachtet werden. Insgesamt stellt NusACTD über seine beiden (HhH)2-Module eine vielseitige Interaktionsfläche bereit, die möglicherweise Bindungsstellen für weitere Proteine neben alpha CTD und lambda N bietet. Die Trennung der Domänen über eine mobile Linkerregion ermöglicht eine Anpassung an konformationelle Veränderungen in der TEC-Struktur, die zum Beispiel beim Übergang des TEC von einem Elongations- in einen Antiterminationszustand auftreten können. Die flexible Verbindung zwischen den Domänen ist zudem für den Mechanismus der Autoinhibition wichtig, da bei der Bindung von NusA an den TEC die RNA Zugang zu den Bindungsstellen erhält.
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Granulare Dynamik unter dem Einfluss einer horizontalen Oszillation -- Vergleich zwischen Experiment und Simulation
(2005)
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Tobias Schnautz
- Um ein grundlegendes Verständnis granularer Verhaltensweisen zu erlangen, wird das dynamische Verhalten eines Granulats unter dem Einfluss einer horizontal zirkularen Oszillation untersucht. Dazu wird jeweils eine Monolage von Kugeln in einer kreisförmigen Schale betrachtet. Um die Dynamik der Kugeln untersuchen zu können, werden ihre Positionen bei den Messungen computerunterstutzt erfasst. In Abhängigkeit der Fülldichte und der Amplitude können drei Phasen verifiziert werden, die aufgrund des jeweiligen Kugelverhaltens als plastische, fluidartige oder festkörperartige Phase bezeichnet werden. Sowohl der Übergang von der plastischen in die fluidartige Phase als auch der Übergang von der fluidartigen in die festkörperartige Phase kann entweder durch Erhöhung der Fülldichte oder der Amplitude erreicht werden. Die Fluidisierung, d.h. der Übergang von der plastischen in die fluidartige Phase ist sprunghaft und hysteretisch. Die Kristallisation, d.h. der Übergang von der fluidartigen in die festkörperartige Phase ist kontinuierlich. In beiden Fällen verschiebt sich der für den Übergang kritische Wert der Fülldichte mit wachsender Amplitude zu kleineren Werten. Weiterhin werden zwei Segregations- bzw. Transporteffekte vorgestellt, die auffällige Ähnlichkeit zu dem Paranusseffekt und dem umgekehrten Paranusseffekt zeigen: In das Granulat eingebrachte Fremdkörper geringer Dichte und kleinen Durchmessers tendieren dazu, zum Rand der Schale zu wandern. Dieser Effekt wird als horizontaler Paranusseffekt bezeichnet. Fremdkörper hoher Dichte und großen Durchmessers bevorzugen die Migration in Richtung des Schalenzentrums. Diesen Effekt bezeichnen wir als umgekehrt horizontalen Paranusseffekt. Sowohl beim Paranusseffekt als auch beim horizontalen Paranusseffekt wandern die Fremdkörper in Bereiche geringer lokaler Packungsdichte, während sie bei dem jeweils umgekehrten Effekt in Gebiete hoher lokaler Packungsdichte gedrängt werden. Die horizontalen Transporteffekte werden in Abhängigkeit der Teilcheneigenschaften Durchmesser und Dichte, der Anregungsparameter Amplitude und Frequenz sowie der Fülldichte untersucht. Bei Variation der Fülldichte und der Amplitude stellt sich heraus, dass für das Auftreten beider Effekte die Fülldichte der den Fremdkörper umgebenenden Kugeln einen kritischen Wert überschreiten muss. Dieser sinkt mit wachsender Amplitude und ist unabhängig von der eingestellten Frequenz. Unterhalb der jeweils kritischen Fülldichten zeigen die Fremdkörper keine gerichtete Migration in der Schale. Die kritische Fülldichte für einen zum Schalenrand migrierenden Fremdkörper fällt mit der kritischen Fülldichte für die Fluidisierung der Kugeln zusammen. Demnach kann der horizontale Paranusseffekt sowohl in der fluidartigen als auch in der festkörperartigen Phase beobachtet werden. Die kritische Fülldichte für die Migration großer Kugeln hoher Dichte in Richtung des Schalenzentrums ist mit der kritischen Fülldichte für den Phasenübergang von der fluidartigen in die festkörperartige Phase verknüpft. Der Transport eines zum Schalenzentrum wandernden Fremdkörpers ist nur dann zu beobachten, wenn sich die den Fremdkörper umgebenden Kugeln im festkörperartigen Zustand befinden. Zur Erkundung der für die genannten Phänomene relevanten Parameter werden numerische Simulationen durchgeführt. Darin wird die Dynamik rollender Kugeln auf ein „modifiziertes“ System harter, rotationsfrei rutschender Scheiben übertragen. Die Modifikation des Scheibensystems besteht darin, die durch die Bewegung der Schale hervorgerufene Beschleunigung einer Kugel auf die Scheiben zu übertragen. Anhand des Vergleichs von numerischen und experimentellen Ergebnissen wird überprüft, ob mit einer solchen Vereinfachung das Verhalten rollender Kugeln zufriedenstellend beschrieben werden kann. Bei quantitativer Übereinstimmung der Ergebnisse von Experiment und Simulation werden die für den beobachteten Effekt relevanten Parameter extrahiert.
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Zur Moritheorie auf Kählerdreifaltigkeiten mit höchstens terminalen Singularitäten
(2005)
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Wolfgang Kronenthaler
- In den späten Neunzigern beginnen F. Campana und Th. Peternell mit der Entwicklung eines Analogons zur Moritheorie projektiver Varietäten für glatte kompakte Kählerdreifaltigkeiten. Dabei zeigen sie unter anderem die Existenz spezieller Kontraktionsabbildungen mit Hilfe von nicht-spaltenden Familien rationaler Kurven, die als Pendant zu den extremalen Kontraktionen der Moritheorie gedacht sind. Beabsichtigt man mit Hilfe dieser Kontraktionsabbildungen ein "minimales Modell-Programm" für kompakte Kählerdreifaltigkeiten zu implementieren, so benötigt man die Existenz solcher Abbildungen auch für Kählerdreifaltigkeiten mit höchstens terminalen Singularitäten. Die Realisierung dieser Verallgemeinerung, aufbauend auf den Techniken aus den Arbeiten der genannten Autoren (wobei die Kontraktion auf eine Kurve nur für Gorenstein-Kählerdreifaltigkeiten nachgewiesen wird), ist genau der Inhalt dieser Arbeit. Den Gegenstand der Untersuchungen dieser Arbeit bilden also Q-faktorielle (nicht-projektive) kompakte Kählerdreifaltigkeiten X mit höchstens terminalen Singularitäten. Unterstellt wird jeweils die Existenz einer nicht-spaltenden Familie (C_t) rationaler Kurven mit dim T >= 1 und (-K_X.C_t ) > 0. Ist die Familie (C_t) überdeckend, hat man F. Campanas geometrischen Quotienten zur Verfügung. Mit dessen Hilfe weist man nach: Satz 1: Sei X eine Q-faktorielle kompakte Kählerdreifaltigkeit mit höchstens terminalen Singularitäten und (C_t) eine überdeckende nicht-spaltende Familie rationaler Kurven. Dann ist X projektiv, es sei denn, es handelt sich um ein P_1-Bündel über einer nicht-projektiven glatten kompakten Kählerfläche mit den Kurven C_t als Fasern. Ist die Familie (C_t) nicht überdeckend und füllt stattdessen nur einen irreduziblen reduzierten Divisor S aus, unterscheidet man danach, ob ein Punkt x_0 in S existiert, durch den alle Kurven einer 1-dimensionalen (Teil-)Familie verlaufen oder nicht. Existiert solch ein Punkt x_0, gilt es, die Fläche S durch Anwendung des Grauertschen Kontraktionssatzes auf einen Punkt in einer Q-faktoriellen Cohen-Macaulayvarietät Y mit höchstens terminalen Singularitäten zu kontrahieren. Man erhält als Ergebnis: Satz 2: Sei X eine Q-faktorielle nicht-projektive kompakte Kählerdreifaltigkeit mit höchstens terminalen Singularitäten und (C_t) eine nicht-spaltende Familie rationaler Kurven mit der Eigenschaft (-K_X.C_t) > 0. Die Familie (C_t) sei entweder 1-dimensional und es gebe einen Punkt x_0 in X, durch den alle Kurven der Familie (C_t) verlaufen, oder 2-dimensional, aber überdecke die Dreifaltigkeit X nicht. Bezeichnet S diejenige (irreduzible reduzierte) Fläche in X, die von den Kurven der Familie (C_t) ausgefüllt wird, so existieren eine kompakte Q-faktorielle Cohen-Macaulayvarietät Y mit höchstens terminalen Singularitäten und eine holomorphe Abbildung f: X -> Y, sodass gilt: 1.) f(S) = pt; 2.) Die eingeschränkte Abbildung f: X-S -> Y-{pt} ist biholomorph. Existiert kein Punkt x_0 wie oben beschrieben, unterscheidet man weiter, ob "(S.C_t) < 0" oder "(S.C_t) >= 0" gilt. Im erstgenannten Fall setzt man sich die Kontraktion auf eine Kurve (wieder in einer Q-faktoriellen Cohen-Macaulayvarietät Y mit höchstens terminalen Singularitäten) zur Aufgabe. Im zweitgenannten Fall findet man entweder eine divisorielle Kontraktion auf einen Punkt oder eine Kurve mit Hilfe einer alternativen nicht-spaltenden Familie rationaler Kurven (C'_t) oder X besitzt die Struktur eines Konikbündels über einer normalen Fläche W. Aus technischen Gründen beschränke ich mich auf den Gorensteinfall: Satz 3: Sei X eine Q-faktorielle nicht-projektive kompakte Gorenstein-Kählerdreifaltigkeit mit höchstens terminalen Singularitäten und (C_t) eine 1-dimensionale nicht-spaltende Familie rationaler Kurven mit der Eigenschaft (-K_X.C_t) > 0. Die Familie (C_t) sei maximal, d.h. T sei eine (irreduzible) Komponente im Douadyraum von X, und es gebe keinen Punkt x in X, durch den alle Kurven der Familie (C_t) verlaufen. Es bezeichne S diejenige (irreduzible reduzierte) Fläche in X, die von den Kurven der Familie (C_t) ausgefüllt wird. I) Ist (S.C_t) < 0, so gilt: 1. S ist isomorph zu einer P_1-Faserung über einer eventuell singulären Kurve B mit den Kurven C_t als Fasern (mengentheoretisch) und (S.C_t) = -1; 2. Es existieren eine kompakte Q-faktorielle Gorensteinvarietät Y mit höchstens terminalen Singularitäten und eine holomorphe Abbildung f: X -> Y, sodass gilt: a) f(S) = B; b) Die eingeschränkte Abbildung f: X-S -> Y-B ist biholomorph. II) Ist (S.C_t) >= 0, so existiert entweder eine divisorielle Kontraktion auf eine kompakte Q-faktorielle Cohen-Macaulayvarietät \tilde{X} mit höchstens terminalen Singularitäten oder X besitzt die Struktur eines Konikbündels über einer normalen Fläche W.
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Experimenteller Biologieunterricht zu Aspekten der Gentechnik im Lernort Labor: empirische Untersuchung zu Akzeptanz, Wissenserwerb und Interesse
(2005)
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Franz-Josef Scharfenberg
- Basierend auf Überlegungen im Rahmen der entwicklungsorientierten Evaluationsforschung wurde für den außerschulischen Lernort Labor ein Experimentalunterricht zu zentralen Aspekten der Gentechnik mit vier Schülerexperimenten entwickelt und im Rahmen von Projekttagen eingesetzt: - Bakterien-Transformation mit einem rekombinierten, GFP-codierenden Plasmid, - Isolierung der Plasmid-DNA aus den transformierten Bakterien, - Charakterisierung der Plasmid-DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen, - Visualisierung der DNA-Proben über eine Agarose-Gelelektrophorese. Die Experimente zeigten ein hohes Maß an Authentizität und waren mit einer Reflektionsphase zu ethischen Aspekten der Gentherapie verknüpft. In einem Kontrollgruppen-Design wurden die Wirkungen der unabhängigen Variablen Lernort und selbsttätiges Experimentieren auf die Konstrukte Akzeptanz, Wissenserwerb und Interesse an gentechnischen Fragestellungen überprüft. Mögliche Testeffekte wurden über eine externe Kontroll-Gruppe ohne Intervention kontrolliert. An der Studie waren insgesamt 363 Gymnasiasten (12. Jgst.) aus 29 Biologie-Leistungskursen beteiligt. Als Erhebungsinstrument wurde ein informeller Test entwickelt und über eine Voruntersuchung an 172 Schülern (12 Kurse) optimiert. Das Erhebungsinstrument wurde in einem Prä-Posttest-Design mit Follow-up-Test eingesetzt. Aus den Testdaten wurden Kennwerte zur Akzeptanz, dem Wissenserwerb und dem Interesse berechnet und nach der quantitativen Testtheorie bzw. in Bezug auf den Wissenserwerb zusätzlich über die latente Klassenanalyse im Hinblick auf Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen ausgewertet. Die beiden unabhängigen Variablen zeigten folgende Einflüsse auf die drei erfassten Konstrukte: Die aktuelle und die rückblickende Akzeptanz des Experimentalunterrichts im Lernort Labor waren insgesamt sowie auf der Ebene der beiden identifizierten Faktoren „Affektive Bewertung“ und „Bewertung des instrumentellen Handelns“ signifikant höher als die eines vergleichbaren nicht experimentellen Unterrichts, unabhängig von dessen Lernort. Inhaltlich gründete sich diese Akzeptanz primär auf die durchgeführten Experimente, während in den nicht experimentellen Gruppen fachliche, methodische und lehrerbezogene Aspekte entscheidend waren. In der Laborsituation, unabhängig vom Experimentieren, zeigten insbesondere schlechtere Schüler eine höhere Akzeptanz. Die latente Klassenanalyse differenzierte den Subtest Wissenserwerb inhaltlich in „Vorwissen-Items“ und „projektbezogene“, d.h. auf neue Lerninhalte bezogene Items und die Probanden in entsprechend unterschiedliche Lerner-Typen. Die Schüler aller Unterrichtsgruppen erwarben insgesamt und projektbezogen Wissen, vorwissenbezogen jedoch nur im Lernort Labor. Ein Teil des Wissens blieb persistent erhalten, ein anderer Teil wurde wieder vergessen. Die Förderung des Wissenserwerbs im Lernort Labor verdeutlichten zusätzlich ein signifikant höherer Lerner-Anteil gegenüber dem Lernort Schule und das Fehlen bzw. nur teilweise Vorhandensein von positiven Korrelationen von Lernleistungen im Test mit vorherigen schulischen Leistungen. Der aktuelle Lernerfolg war in der Experimentalsituation insgesamt sowie in der nicht experimentellen Laborsituation vorwissenbezogen signifikant höher als in der Schulsituation. Die besondere Bedeutung des vorhandenen Vorwissens für die Experimental-Gruppe wurde durch deren signifikant höheren Anteil an Projektwissen-Lernern und die nur für diese Gruppe feststellbaren positiven Korrelationen von Lernleistungen und der unterrichtlichen Experimentiererfahrung über Lehrerdemonstrationsexperimente sichtbar. Andererseits war das nachträgliche Vergessen insgesamt und projektbezogen in der Experimentalsituation signifikant stärker als in der Schulsituation. Die Ergebnisse deuten zum einen eine mögliche Erhöhung der Lernmotivation im Lernort Labor an, weiter gesteigert durch das Experimentieren, zum anderen stehen sie im Einklang mit der Cognitive-Load-Theorie, in dem sie auf u.U. höhere unterrichtsbezogene Belastungen der Schüler in der Experimentalsituation hinweisen. Das insgesamt schon hohe Interesse differenzierte sich inhaltlich in Interesse an „Anwendungen der Gentechnik beim Menschen“ und in der „Grünen Gentechnik“ sowie an deren „ethischen Aspekten“. Nur bei den Mädchen war in der Experimental-Gruppe die Abnahme des Gesamtinteresses signifikant gegenüber dessen Stabilität in den nicht experimentellen Gruppen (unabhängig vom Lernort). Entsprechend war in der Experimentalsituation das stabile Interesse an ethischen Aspekten signifikant gegenüber dessen Zunahme in den nicht experimentellen Gruppen. Die vermutete Interesseförderung durch das Experimentieren lässt sich nicht bestätigen. Konsequenzen im Hinblick auf den unterrichtlichen Einsatz von Lehrerdemonstrationsexperimenten, die schulische Vorbereitung von Schülerlabor-Besuchen und die Bedeutung eines unterrichtlichen Rahmens im Lernort Labor werden abgeleitet.
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Development of broadly applicable transgenic tools for the transposon mutagenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum
(2005)
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Ivana Viktorinová
- The discovery of non-species-specific, broad-range transposable elements and the establishment of a universal 3xP3 promoter revolutionized insect transgenesis. It overcame the limitations of the germ-line transformation to be restricted to the model organism Drosophila melanogaster. In combination with discernable fluorescent markers, multi-component systems, such as transposon-based insertional mutagenesis, can now be introduced to various insect species. To drive the transposase gene for transposable element remobilisation, suitable promoters are needed. The broadly conserved thermotolerance factor, Hsp70, is well-characterised in D. melanogaster and its promoter, which is inducible by high temperatures, provides a genetic tool for transient gene activation. In this thesis, I could prove that the D. melanogaster hsp70 promoter is functional in Tribolium castaneum as well. Its observed basal level activity, however, must be considered and limits its use for experiments, where no strict transient gene expression is required. Nevertheless, the D. melanogaster hsp70 promoter will suffice to provide an efficient transposase source in transposon-based mutagenesis screens in T. castaneum. The remobilization of non-autonomous transposable elements in such screens results in novel mutations and tagging of potentially interesting cis-regulatory elements. To further investigate gene functions, misexpression studies are necessary. In D. melanogaster, this can be done by directed binary expression systems. Here I could show, that the combination of Gal4delta/UAST works best in D. melanogaster somatic tissue, whereas the LexA/(LL)4 and the tetracycline-controlled systems seem to function only poorly. All constructs are based on broad range transposons as well as universal markers and promoters, so that they can be used in other insect species to determine the best system. Preliminary tests in T. castaneum, however, showed that there are a number of additional problems that need to be addressed, before a suitable binary expression system can be established for this species. The full genome sequence of T. castaneum is now available. Therefore, interesting mutations, cis-regulatory elements and their biological functions can be directly linked to the sequence level. When target sites of site-specific recombination systems are included in insertional mutagenesis screens, their insertion sites can be precisely identified and designed chromosomal rearrangements (inversions, duplications and deletions) created. Here I could present a universal system, which can be introduced into non-drosophilid species and enables such chromosomal rearrangements, which I could successfully demonstrate in D. melanogaster. Defined inversions suppressed meiotic recombination between inverted and non-inverted regions on homologous chromosomes and can thus serve as defined balancer chromosomes. Also defined deletions/duplications were generated in D. melanogaster. Such aberrations will be crucial in other insect species, like T. castaneum, to safely keep mutation stocks and identify gene functions. Moreover, the separation of terminal inverted repeats by inverting the chromosomal region between two transposable elements resulted in immobilization. This is of a particular interest for applied transgenesis approaches in insect pest management, when transgenic insects will be released into the nature and transposable elements must be efficiently protected from potential cross mobilization in host species.
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Visualization, Kinetics, and Thermodynamics of DNA-Protein Interactions
(2005)
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Frank Schubert
- In this work the two spectroscopic techniques surface plasmon resonance (SPR) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) as well as the imaging technique cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM) were used to gain kinetic, thermodynamic and structural information about DNA–protein interactions. Furthermore, the micrographs obtained by cryo-TEM were compared to AFM images taken in a previous work. The main goal of this work was to investigate the influence of surfaces on DNA–protein interactions, therefore the methods mentioned above were chosen. Both SPR and AFM deal with molecules attached to a surface, whereas FCS and cryo-TEM monitor the molecules in free solution. As a suitable model system the well characterized interaction between the human replication protein A (RPA) and DNA was chosen. The application of SPR and FCS to analysing the binding of RPA to ssDNA yields information about the kinetics and thermodynamics. No modification of the protein is required and biotinylated and fluorescently labelled DNA strands are available from commercial sources. Salt concentration, pH and temperature can be varied over a wide range. To best of our knowledge, FCS has not been used previously to obtain equilibrium constants at different temperatures. In this work it was demonstrated how temperature dependent SPR and FCS measurements can be performed and evaluated to determine thermodynamic data of DNA–protein interactions. Astonishingly, the equilibrium constant KD for the binding of RPA to ssDNA obtained by FCS is larger than the value obtained by SPR by a factor of 20–25, depending on the temperature. Therefore the values found for the Gibbs free energy were different, whereas the values for the reaction enthalpy were nearly the same for the two methods used. There are clear evidences that the difference in KD and therefore in Gibbs free energy measured by the two methods is due to different reaction entropies. In SPR the reaction is restricted to two dimensions due to immobilization of the DNA molecules to the sensor surface, thus the rate constants obtained might not be the true association and dissociation rates. As a main result, the data obtained by SPR differ from the data gained from the free solution experiments. The reason for this is a loss of one degree of freedom, which in turn results in different entropic terms for the surface and the free solution techniques. In contrast, FCS is able to follow complex formation without spatial restrictions. In consequence, the reaction in three dimensions is entropically less favourable than the reaction at the solid-liquid interface. This might be due to differences in the cratic entropy between the two geometries, however, the role of hydration can not be assessed by our experiments. The picture of the DNA–RPA interaction was completed by further FCS measurements using various dsDNA fragments containing damage sites. The binding of RPA to undamaged dsDNA fragments showed a low affinity to dsDNA (approx. 15%), as expected from previous AFM experiments. Since RPA is known to have a high affinity to singlestranded DNA, this finding may be explained by the binding of RPA to unpaired nucleotides at the end of the dsDNA. Comparing the two imaging techniques AFM and cryo-TEM one does not find a strong influence of the surface on the DNA–RPA interaction. The kinks formed by UV-damaged DNA observed in AFM experiments could not be verified by the cryo-TEM experiments. There might be two reasons for this: First, the kinks in the AFM experiments are induced by the mica surface and therefore do not occur in cryo-TEM experiments. Second, the resolution of the TEM is not as good as in AFM, therefore, the kinks can not be seen in the TEM. The question if the DNA is wrapping around the RPA as stated in earlier works can not be answered using cryo-TEM. The resolution of this method is not as good as in AFM. In order to get micrographs with a better resolution one has to perform simple TEM experiments including staining of the molecules. The drawback of this procedure is that the molecules are influenced by the staining chemicals and therefore not in their natural state. In a very last part of this work the mini-chromosome maintenance com-plex was investigated using FCS and cryo-TEM. It was shown that the protein exhibits a medium affinity to ssDNA and dsDNA. The structure of the DNA substrate does not play an important role, the interaction was the same for simple and bubble dsDNA and dsDNA containing a ssDNA tail.
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Die Ahnen essen keinen Reis: Vom lokalen Umgang mit einem Bewässerungsprojekt am Fuße des Kilimanjaro in Tansania
(2005)
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Jigal Beez
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Counterion Distribution around a Macroion in Polyelectrolytes Probed by Anomalous Small-Angle X-ray Scattering
(2005)
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Mushtaq Patel
- A systematic and comprehensive study of polyelectrolytes in solution has been carried out using Anomalous Small Angle X-ray Scattering (ASAXS) in order to probe the counterion correlation around the macroion. In the course of this study, different polyelectrolyte systems such as, rod-like polyelectrolytes, spherical polyelectrolyte brushes and star shaped polyelectrolytes have been studied using ASAXS. ASAXS is the method of choice for the study of aqueous polyelectrolytes because it obviates the need of using labelled compounds or counterion exchange, as in the case of SANS or conventional SAXS. Scattering experiments performed near the absorption edge of the element under investigation, allow us to obtain the three partial scattering terms predicted by theory. All the three partial scattering terms are obtained for the first time experimentally and compared with the theoretical predictions of rod-like polyelectrolytes and spherical polyelectrolyte brushes. Rod-like polyelectrolytes bearing a rigid poly(p-phenylene) and comprising of two counterions per monomer unit with a persistence length of 21 nm were studied using ASAXS and osmometry. The results of the ASAXS experiments carried out on rod-like polyelectrolytes are compared with the predictions of the Poisson-Boltzmann Cell Model. The results suggest that the counterions are strongly correlated with the macroion. Osmotic coefficient measurements on rod-like polyelectrolytes show that approximately 20 percent of the counterions are osmotically active. The comparison of the experimentally obtained osmotic coefficient with the theory proceeds without adjusting the charge parameter. The results are in semi-quantitative agreement with the predictions of the Poisson-Boltzmann Cell Model. Spherical polyelectrolyte brushes consisting of a poly(styrene) core of 68 nm with densely grafted linear poly(acrylic acid) chains with Rubidium counterions were studied using ASAXS. In this thesis the first complete analysis of a colloidal polyelectrolyte brush by ASAXS has been presented. It has been demonstrated that there is a strong correlation of the counterions to the grafted polyelectrolyte chains of the spherical polyelectrolyte brushes. The correlation between ions and polymer chains in spherical polyelectrolyte brushes is much stronger than linear polyelectrolytes. The experiments therefore validate the theoretical predictions that most of the counterions are fully trapped within the brush and this leads to a strong stretching of the polyelectrolyte chains. Star-shaped polyelectrolytes bearing 21 arms of poly(acrylic acid) with Rubidium counterions were studied using SAXS and ASAXS. In SAXS experiments, the dependence of the maxima in the scattering experiments was observed to be concentration dependent. The ordering in star-shaped polyelectrolytes was maximum in the vicinity of the critical concentration. The maxima observed in the scattering experiments obey the scaling theory for polyelectrolytes. This is an indication of some order between the star-shaped polyelectrolytes. Evidence for the presence of any crystalline structure was not found. Scattering experiments with varying number of arms may be helpful to determine their role in the formation of crystalline structure. The three scattering terms predicted by ASAXS theory were also obtained for the star-shaped polyelectrolytes. It has been demonstrated that ASAXS is indeed a very robust method to study the polyelectrolytes in solution and to obtain the information regarding the distribution of counterions in solution. ASAXS studies of polyelectrolytes have demonstrated that the counterions are strongly correlated to the macroion.
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Generation of metal nanoparticles in spherical polyelectrolyte brushes and their application in heterogeneous catalysis
(2005)
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Geeta Sharma
- This thesis describes synthesis of spherical cationic polyelectrolyte brushes by “grafting from” technique. The spherical polyelectrolyte brushes have been used as “nanoreactors” for the synthesis of metal nanoparticles (Gold, Platinum and Silver). The catalytic activity of the resulting metal/polymer nanocomposites has been tested by heterogeneous hydrogenation of carbonyl groups. The synthesis of the cationic spherical polyelectrolyte brushes is achieved by a three-step procedure. Firstly, cationic polystyrene core particles are synthesized by emulsion polymerization by using a cationic surfactant and a cationic thermal initiator. In the second step, a thin layer of photoinitiator is generated around the particles by addition of the photoinitiator under “starved conditions” . The photoinitiator is a monomer, which is added when the formation of core particles is in the last stage. The photoinitiator polymerizes with the styrene to give a covalently bound photoinitiator. In the third and last Step, the brushes are grafted on the core particles by photoemulsion polymerization, where the initiation is triggered by UV/VIS radiation. The important parameters of the brushes- contour length and grafting density are determined by the cleavage of the chains from the surface by alkaline hydrolysis. The ester functionality within the photoinitiator is hydrolyzed under the harsh conditions of hydrolysis. The cleaved chains are analyzed to determine the molecular weight. The grafting of the charged polymeric chains stabilizes the colloids even under unfavorable conditions like high ionic strength and high pH. The behavior of brushes is investigated at different ionic strength and pH. At different ionic strengths brushes show three regimes- osmotic, salted and neutral regime. At increasing ionic strength, a shrinking in brush thickness is observed due to the screening of ionic charges. The cationic brushes (polyamino ethylmethacrylate hydrochloride and poly vinylbenzylamine hydrochloride) bear protonated amine functionality. The brushes are classified as annealed brushes as they are sensitive towards pH. The brushes lose the protons at high pH, to result in the uncharged brushes, causing them to shrink, which is followed by dynamic light scattering. Polyaminoethylmethyacrylate brushes are used as nanoreactors to synthesize the metal nanoparticles of gold and platinum. The water-soluble metal salts are to introduce metal ions in the brushes. The negatively charged metal ions (AuCl4- and PtCl6-2) interact with the cationic chains of the brushes. Dynamic Light Scattering is used to study the influence of the metal ions on the brushes. It is observed that metal ions induce much more pronounced shrinking as compared to the monovalent ions. The shrinking can be compared with the shrinking caused multivalent ions such as MgSO4. The metal ions once introduced are localized within the brushes due to strong correlation of counterions with the polyelectrolyte chains. The excess ions are cleaned by ultrafiltration. The trapped counterions render high contrast to the brushes and hence visualize brushes in Cryo-TEM. The metal ions can be reduced chemically by NaBH4 to generate nanoparticles. The particles are studied by high-resolution Transmission microscopy and cryogenic TEM. The metal nanoparticles formed are well spaced and crystalline in nature. The particles formed are found to be stable against aggregation. The silver nanoparticles are formed by using the anionic brushes (polyacrylic acid) and AgNO3 as the precursor salt. The catalytic activity of Platinum is tested by the heterogeneous hydrogenation of the carbonyl functionalities with dihydrogen under optimum conditions. The platinum nanoparticles give a 90% conversion of butyraldehyde to 1-butanol. The catalyst is found to be recyclable for a number of runs without losing the efficiency. The time dependent studies are carried out to gain insight in the mechanism and the kinetics of the reaction. The particles are found to be stable after the catalytic cycles. The gold nanoparticles supported on the polystyrene are found to be catalytically active for the same reaction. The gold particles are found to be recyclable for a number of runs without losing the efficiency. The bulk gold is completely inactive, hence the origin of catalytic activity is attributed to the quantum size effects. As the polystyrene particles are inert, the role of support particles in the origin of catalytic activity can be ruled out. The nanoparticles are found to become inactive for catalysis after 6 months of standing with a manifold increase in the particle size as revealed by microscopy.
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Globalization in a Local Context - Perspectives and Concepts of Action in Africa : An Introduction
(2005)
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Roman Loimeier
Dieter Neubert
Cordula Weißköppel
- Typical shortages of the public debate on globalization are reflected in the academic discussion such as the distorting simplicity of catchwords like the "global village", "jihad vs. McWorld", the "new global age" or the assumption that globalization is a completely new phenomenon. However, the academic debate itself is still restricted. There are only few attempts to cover and analyze processes of globalization on a broader basis in all parts of the world: not only the "North", but also the "South". Despite the multi-centric character of the world, the analysis of processes of globalization has remained largely confined to the North, while events in Africa, for instance, are taken notice of only when they are of specific relevance to the North. This paper, which originally is the introduction to an edited book (published in German), tries to analyze these shortages and to present approaches which look at the processes of globalization from different and perhaps more "African" perspectives. However, this overview shows that it is still debated, whether established concepts of the globalization paradigm can be confirmed from an African perspective or whether they have to be revised or even rejected.
