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Denying access to water? Moral values and commercialization policies in Khartoum governmental water management (2012)

Anne-Sophie Beckedorf

This contribution draws on empirical fieldwork carried out in Khartoum/Sudan in 2009/2010 in order to examine the role of value systems in recent commercialization policies of Khartoum governmental water management. The first section provides background information about the current water supply system in Khartoum, which is a necessary precondition to understand current reform processes. The second section singles out three major aspects of commercialization policies and their contestations in greater detail: increases in water prices, increases in water cuts in case of unpaid water bills, and installations of prepaid water meters. The third section summarizes these contestations and argues that value systems are one major reason why current reform processes are not implemented in the way they were perceived.

ESProNa - Eine Constraintsprache zur multimodalen Prozessmodellierung und navigationsgestützten Ausführung (2012)

Michael Igler

Deklarative Prozessmodellierungssprachen erfreuen sich aufgrund ihrer Ausdrucksstärke und der kompakten Prozessmodelle einer immer größer werdenden Beliebtheit. Ziel dieser neuen Art der Modellierung ist es, Geschäftsprozesse einfacher und effizienter aufnehmen zu können. Ein bekanntes Konzept aus den deklarativen Programmiersprachen, die strikte Trennung zwischen Problemstellung und Lösung, wird auf den Bereich der Prozessmodellierung übertragen. Somit wird eine Vereinfachung der zu modellierenden Geschäftsprozesse erreicht. Um die Prozesse in ihrer Gesamtheit zu erfassen, wird das Konzept der perspektivenorientierte Prozessmodellierung (POPM) verwendet. Weiterhin werden neben den Anforderungen an eine Prozessmodellierungssprache zusätzliche Konzepte erarbeitet, die für eine effiziente Modellierung von Geschäftsprozessen sinnvoll sind. Die im ersten Kapitel der Arbeit angesprochenen Probleme aktueller Prozessmodellierungssprachen werden in den nachfolgenden Kapiteln aufgegriffen und gelöst. Neue Forschungsergebnisse, wie etwa die entwickelte Prozessnavigation zur navigationsgestützten Ausführung der erstellten Geschäftsprozesse oder das Modellieren von subjektiven Empfehlungen, werden ebenfalls behandelt. Durch letzteres Konzept kann das empirische Verhalten der Geschäftsprozesse modelliert und zum Zeitpunkt der Ausführung präsentiert werden. Es wurden nicht nur die Konzeptionen und Lösungen der Problemstellungen erarbeitet, sondern auch gezeigt, wie diese implementiert und verwendet werden können. Alle Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind in der deklarativen Prozessmodellierungssprache ESProNa umgesetzt.

SUR LES PAS DE J. PETTERSON : A. LEMBA, ROMANCIER CONGOLAIS (2012)

Crispin Maalu-Bungi

Quoique chronologiquement antérieure à la littérature congolaise de langue française, la littérature écrite en langues congolaises, au sens anglais de creative writing ou français de littérature d’imagination, est aujourd’hui peu développée et partant peu connue. Augustin Lemba, de son vrai nom Auguste De Haes, est ce prêtre belge émule du missionnaire suédois John Petterson qui, en 1935, écrivit Nsamu a Mpanzu (La vie de Mpanzu), première œuvre narrative d’imagination et premier roman de langue congolaise, en l’occurrence le kikongo. Arrivé au Congo belge en 1956 à l’âge de 26 ans, il exerce son ministère dans diverses paroisses de Kinshasa et choisit, comme nom d’écriture, celui de «Lemba (St) Augustin», paroisse où il est curé quand, en 1967, il écrit Mokili ngonga e (A chacun son tour), son premier roman. Celui-ci est suivi de deux autres : Nabalaki basi mibale (Mes deux épouses) et Bombula (nom de l’héroine). Le but de cet article est de faire connaitre A. Lemba et son œuvre, lui dont l’histoire rappelle celle du portugais Afonso Alvarez évoquée naguère par l’auteur allemand du Manuel de littérature néo-africaine. Aujourd’hui en tête des romanciers de cette langue de la capitale congolaise, cet auteur est peu connu sous sa véritable identité et à ce sujet, mon propre exemple est instructif. En effet, alors que j’enseignais ses œuvres à mes étudiants depuis les années 70, je ne l’ai découvert qu’en 2004, grâce au mémoire que je dirigeais sur l’un de ses romans.

Transformation einer argentinischen Sommerweizenvarietät (Triticum aestivum L.) durch Transfer eines Seneszenz-verzögernden Gens zur Verbesserung der Ertragsleistung (2012)

Eduardo Daniel Souza Canada

Um den Seneszenz-Prozess der Weizenpflanze zu verzögern und so eine höhere Ertragsleistung zu erreichen, wurde eine bisher noch nicht übertragene Nutzgenkassette in eine argentinische Weizenvarietät (Triticum aestivum L.) eingebracht. Diese Nutzgenkassette besteht aus der proteincodierenden Region des Isopentenyltransferase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens und dem Seneszenz-spezifischen HvS40-Promotor aus Hordeum vulgare. SCREENING VON WEIZEN-VARIETÄTEN Die Kombination der Embryo-Entwicklungsstadien H und W mit den zwei 2,4-D Konzentrationen ergab vier verschiedene Bedingungen, denen alle 22 argentinischen Sommerweizenvarietäten ausgesetzt wurden. Insgesamt wurden 10091 unreife Embryonen getestet. Die besten Ergebnisse bei fünf von sechs der getesteten Parameter erbrachte die Kombination des Entwicklungsstadiums H und der Auxinkonzentration 1 mg 2,4-D /l medium. Die Induktion eines Scutellarkallus sowie die Regenerationsfähigkeit der unreifen Embryonen zur Pflanze waren vom Genotyp, vom Entwicklungsstadium und von der 2,4-D Konzentration im Medium abhängig. TRANSFORMATION UND IN VITRO GEWEBEKULTUR DER EMBRYONEN DES WEIZENS Für Klein Brujo konnte ein auf Partikelbeschusstechnik basierendes Transformationssystem etabliert werden. Nach der Optimierung der Beschussbedingungen ergaben sich drei Variable, die für eine hohe Transformationseffizienz von Klein Brujo (10 % im besten Versuch) entscheidend waren: das Kallus-Induktionsmedium, die Vorkultur und das osmotische Behandlungsmedium. Die neu etablierte Gewebekulturstrategie führte zu einer Verkürzung der in vitro Kulturdauer zwischen Embryonenpräparation und ex vitro Kultur. Die Verwendung von Phosphinothricin (PPT) als Selektionsmittel während der ex vitro Kultur minimierte die Anzahl falscher Positiver unter den überlebenden Pflanzen (Cotransformanten 97,4%). Allerdings ließen sich durch unabhängige Segregation keine Reporter- bzw. Selektionsgen-freien T1-Pflanzen kultivieren. In allen T0-Regeneraten konnte über Southern blot-Analysen die proteincodierende Region des eingeführten ipt-Gens nachgewiesen werden (Genkopien zwischen 2 und 7). Das Konstrukt aus einem um 2 kb verkürzten HvS40-Promotor (welcher in dieser Arbeit neu konstruiert wurde) und dem ipt-Gen (pS40-IPT) wurde in Weizenblättern sowohl bei künstlich induzierter als auch bei natürlicher Seneszenz exprimiert. Dies wurde mittels RT-PCR der ipt-mRNA in T0- und T2-Pflanzen nachgewiesen. PHYSIOLOGISCHE EFFEKTE DER ÜBERTRAGUNG DES IPT-GENS UND DER ERTRAGSLEISTUNG Um einen Hinweis auf die Funktion des ipt-Gens zu bekommen wurde der Chlorophyll-Gehalt während der induzierten Seneszenz von voll entwickelten, abgeschnittenen Fahnenblättern von transgenen T1-Pflanzen gemessen. Bei fünf von den sechs untersuchenden Transgenen zeigte sich ein deutlich geringerer Chlorophyll-Verlust was auf die Aktivität des ipt-Gens und eine erhöhte Cytokininkonzentration hindeutet. Das Chl a/b-Verhältnis war höher als bei den Kontrollen, da das Chl a während der Seneszenz-Verzögerung langsamer als das Chl b abgebaut wird. Der Gehalt der dominierenden Cytokinine und der O-Glucoside, wurde in seneszierenden Fahnenblättern von T1- und T2-Pfanzen der drei pS40-IPT Linien analysiert. Eine beinahe Verdopplung des Cytokinin-Gesamtgehaltes gegenüber der Azygoten konnte in Extrakten der seneszierenden Fahnenblätter nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der RT-PCR Analyse der transgenen Pflanzen zeigten eine höhere Expression des ipt-Gens während der Kornfüllungsphase verglichen mit der Anthese. Allerdings war der Cytokiningehalt in intakten Pflanzen trotz des Promoters aus Gerste nicht ausreichend, um eine deutliche Seneszenz-Verzögerung hervorzurufen. Dieser Effekt von ipt-Expression kann durch den schwachen Promotor oder durch eine partielle Fremdgenstilllegung des übertragenen Gens zustande gekommen sein. Die homozygoten T2-Pflanzen der vier Klein Brujo-Linien wurden mit den entsprechenden azygoten Pflanzen verglichen. Bei der Sorte „Klein Brujo“ wurde in allen vier transgenen Linien keine deutlich sichtbare Seneszenz-Verzögerung sowohl während der sequenziellen Seneszenz der Blattorgane als auch während der monokarpischen Seneszenz der ganzen Pflanze festgestellt. Allerdings zeigten zwei Linien gegenüber den Azygoten bei den Parametern Körner pro Ähre, Korngewicht insgesamt sowie durchschnittliches Korngewicht höhere Ergebnisse. Die Steigerung der Kornanzahl wurde durch ein niedrigeres Korngewicht nicht aufgewogen. Es ist heutzutage allgemein akzeptiert, dass die Photosynthese der Ähre einen wichtigen Beitrag zum Kornertrag liefert. Die höhere Blattanzahl sowie die längere Lebenszeit der Fahnenblätter und Ähren der zwei homozygoten Linien könnte die bessere Versorgung ihrer Körner erklären. Neben einer Bestätigung der Expression des ipt-Gens könnte sowohl die Steigerung des Cytokinin-Gehalts in der Weizenähre als auch in Endosperm-Zellen des Weizenkorns eine weitere Erklärung für die bessere Ertragsleistung der zwei transgenen Linien sein. Denn es wurde gezeigt, dass Cytokinin die Kornanzahl steigert und die Kornentwicklung stimuliert, wenn es auf die Ähre oder auf die oberirdischen Teile der Weizenpflanze aufgetragen wird. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sollte versucht werden, eine Seneszenzverzögerung in den Blättern durch den Transfer des ipt-Gens unter Kontrolle des homologen Seneszenz-assoziierten Promotors zu erreichen, der aber nicht in Fahnenblatt aktiv ist. Dies könnte sich letztlich günstig auf das Ährenwachstum auswirken, so dass Ähren mit einer größeren Kornzahl und somit einem höheren Kornertrag entstehen würden.

Novel Group 4 Metal Amido Complexes - syntheses, reactivity and olefin polymerization catalysis (2012)

Muhammad Hafeez

A series of amine functionalized electron rich aminopyridinato ligands was synthesized by the methodology developed by Fort and coworkers and subsequent Ulmann thermal amination. In addition to this some tripodal ligands containing nitrogen donor functionalities were also synthesized. The corresponding titanium and hafnium complexes of these ligands were synthesized using the amine / diethyl-ammonium chloride / toluene elimination and salt metathesis routes. These compl-exes were characterized by NMR and elemental analysis. Many of these complexes have been studied on the basis of structure and their catalytic potential was investigated. The overall evaluation of this work tells about the electrophilicity of the metal centre and the steric and electronic effects of the ligand. Mono Ap di / trichloride complexes of titanium were synthesized by amine / diethyl-ammonium chloride elimination and salt metathesis routes by reacting the corresponding ligand with diethylamido titanium trichloride or titanium tetrachloride respectively. The structural investigation of these complexes gives insight into the more electron donating capability of the aminopyridinato ligands. These complexes were found moderatly active for ethylene and styrene polymerization when activated with d-MAO giving syndiotactic polystyrene of high molecular weight and aluminum terminated polyethylene. The low activity of these complexes was attributed to the ligand transfer to aluminum during catalysis. Mono Ap trialkyl hafnium complexes were synthesized by reacting the respective aminopyridinato ligand with tetrabenzyl hafnium at room temperature. Some of these complexes were studied by single crystal X- ray analysis. These complexes have shown very low activity towards ethylene polymerization when activated with d-MAO probably due to very fast ligand transfer to aluminum. The low temperature NMR investigations of these complexes indicate the η3-coordination of one benzyl with hafnium metal centre. To overcome the problem of ligand transfer during catalysis, we synthesized the tri-podal ligands containing nitrogen donors either by Pd2(DBA)3 / DPPP catalysed cross coupling reactions or by Ni(o) / 2, 2 -bipyridine catalyst system followed by thermal amination. The titanium trichloride complexes of these ligands were synthesized by reacting the respective tripodal ligand with [Et2NTiCl3] at room temperature. The titanium complexes containing tripodal ligands were found less active towards ethyl-ene polymerization.

Kombination von Substratanreicherung und Katalyse als generelles Prinzip von Faltungshelferenzymen (2012)

Anne-Juliane Geitner

In der Zelle existieren eine Vielzahl von Faltungshelferenzymen: molekulare Chaperone, die durch Bindung an aggregationssensitive Oberflächen die Konzentration aggregationssensitiver Intermediate herabsetzen und Peptidylprolylisomerasen und Thioldisulfidoxidoreduktasen, die geschwindigkeitsbestimmende Schritte während der Proteinfaltung katalysieren. Viele Faltungshelferenzyme kombinieren katalytische Funktion und Chaperonfunktion, die häufig innerhalb verschiedener Domänen lokalisiert sind. Ein solches Beispiel ist die Peptidylprolylisomerase SlpA, die aus einer FKBP-Domäne und einer Chaperondomäne aufgebaut ist. Die FKBP-Domäne besitzt Prolylisomeraseaktivität, die IF-Domäne ist für die Chaperoneigenschaften von SlpA verantwortlich. SlpA besitzt eine sehr geringe Prolylisomerase- und Faltungshelferaktivität, ist jedoch ein äußerst effizientes Chaperon. Die NMR-Struktur von SlpA und ein Vergleich mit der Struktur der homologen Prolylisomerase SlyD liefert keine Erklärung für die sehr geringe Prolylisomeraseaktivität. Die Untersuchung von homologen SlpA-Proteinen aus verschiedenen anderen Organismen zeigt, dass die niedrige Prolylisomeraseaktivität und die hohe Chaperonaktivität in der Familie der SlpA Proteine konserviert sind. SlpA bindet mit hoher Affinität und sehr hoher Dynamik an permanent entfaltete RNaseT1. Die geringe Faltungshelferaktivität von SlpA ist also auf die geringe Prolylisomeraseaktivität der FKBP-Domäne zurückzuführen, und nicht auf eine gestörte Substratbindung oder Dynamik der IF-Domäne. Die Konstruktion einer Chimäre aus der FKBP-Domäne von SlyD und der IF-Domäne von SlpA bestätigt dies. Da in diesem chimären Protein die effiziente Prolylisomerasedomäne von SlyD vorhanden ist, ist es ein hochaktiver Faltungshelfer. SlpA gehört zu den Zwei-Domänen-Proteinen, bei denen eine Domäne (IF) in die Schleife einer anderen Domäne (FKBP) insertiert ist. Stabilitätsuntersuchungen zeigen, dass die IF Domäne in isolierter Form gefaltet vorliegt. Innerhalb des Gesamtproteins stabilisiert die Insertion der IF-Domäne die FKBP-Domäne. Die Faltung der IF-Domäne ist sehr schnell und läuft zum größten Teil autonom von der FKBP-Domäne ab. Bei höheren Konzentrationen an Denaturierungsmittel ist die Stabilität der IF-Domäne nicht mehr ausreichend um selbstständig zu falten. Daher wird sie von der FKBP-Domäne abhängig und beide Domänen bilden eine Faltungseinheit. Die FKBP-Domäne wird nicht nur durch die IF Domäne stabilisiert, sondern stabilisiert auch ihrerseits die IF-Domäne. Die Analyse der Stabilität und der Faltung der SlyD-SlpA-Chimäre zeigt ebenfalls, dass die SlpA-IF-Domäne einen enormen stabilisierenden Einfluss auf die Wirtsdomäne, in dem Fall die SlyD FKBP Domäne, besitzt. Damit unterscheiden sich SlpA und SlyD aufgrund der unterschiedlichen Stabilitäten ihrer IF-Domänen grundlegend in ihren Faltungsmechanismen. Um solche modular aufgebauten Faltungsenzyme genauer zu untersuchen, wurden artifizielle Proteine konstruiert, bei denen nicht-homologe Chaperondomänen, die apikale Domäne aus GroEL aus E. coli, die b'-Domäne der PDI aus S. cerevisiae und die Chaperondomäne des periplamatischen Faltungshelfers SurA aus E. coli in die Prolylisomerase hFKBP12 insertiert wurden. Die Insertion dieser Domänen in eine Schleife von hFKBP12 wirkt stark destabilisierend, da durch den Einbau die lokalen Kontakte der Schleife zerstört werden. Durch das Einführen natürlich vorkommender Linkerbereiche und ihre schrittweise Verlängerung konnte die Wirtsdomäne hFKBP12 stabilisiert werden und ihre Prolylisomeraseaktivität, die durch die Destabilisierung stark beeinträchtigt war, wiederhergestellt werden. Auch durch das Einführen einer Disulfidbrücke im Linkerbereich konnten sowohl hFKBP12 als auch die Gastdomänen enorm stabilisiert werden konnten. Die Anwesenheit der Chaperondomänen steigert in allen Fällen die Faltungshelferaktivität von hFKBP12 und verringert die hohe Substratspezifität der Prolylisomerase gegenüber Proteinsubstraten. Demzufolge ist dies ein generischer Effekt, der unabhängig ist von der Herkunft der Chaperondomäne. Die chimären Faltungshelferenzyme binden mit hoher Affinität und hoher Dynamik an entfaltete Proteinsubstrate. Neben seiner Chaperondomäne besitzt SurA zwei Parvulindomänen, von denen nur eine als Prolylisomerase aktiv ist. Durch den Einbau der IF-Domäne von SlyD als Chaperondomäne in die beiden Parvulindomänen sind die chimären Parvulinkonstrukte in der Lage, entfaltete Protein zu binden und als Chaperon zu wirken. Die Faltungshelferaktivität der katalytisch aktiven Parvulindomäne konnte durch den Einbau der IF-Domäne enorm gesteigert werden. Diesre Arbeit zeigt, dass separate Bindungsstellen für generische Substratbindung und spezifische Katalyse Voraussetzung sind für die Konstruktion von aktiven, artifiziellen Faltungsenzymen aus nicht-verwandten Domänen.

Untersuchung des Beitrags von Nicotianaminsynthase zur Zinkhyperakkumulation in Arabidopsis halleri (2012)

Ulrich Deinlein

Zinkdefizienz gehört zu den am meisten verbreiteten Nährstoffmangelerkrankungen weltweit (White and Broadley, 2009). Die Züchtung von zinkreicheren Anbaupflanzen könnte durch ein besseres Verständnis der Mechanismen pflanzlicher Zinkhyperakkumulation erleichtert werden. Hyperakkumulierer sind dazu in der Lage, mehr als hundertmal mehr Zink in den Blättern anzureichern als normale Pflanzen. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Nicotianaminsynthase 2 (NAS2) in den Wurzeln der zinkhyperakkumulierenden und -hypertoleranten Pflanze Arabidopsis halleri um ein Vielfaches stärker exprimiert ist, als im Nicht-Hyperakkumulierer Arabidopsis thaliana (Weber et al., 2004; Weber et al., 2006). Diese Tatsache machte NAS2 zu einem wichtigen Kandidatengen für die Zn-Hyperakkumulation, wobei es aufgrund von Ergebnissen aus Hefevorexperimenten auch zu einem Kandidatengen für die Zn-Hypertoleranz wurde (Weber et al., 2004). NAS2 katalysiert die Bildung des Metallchelators Nicotianamin (NA) aus drei Molekülen S-Adenosyl-Methionin (SAM) (von Wiren et al., 1999). Die Kernaufgabe dieser Dissertation war, einen potentiellen Zusammenhang zwischen der in A. halleri erhöhten NAS2-Expression und der Hyperakkumulation von Zink zu untersuchen. Dafür wurden A. halleri Populationen von metallkontaminierten und von unbelasteten Standorten sowie AhNAS2 RNAi-Linien untersucht und charakterisiert. Sowohl die AhNAS2-Transkritniveaus als auch die Nicotianamingehalte waren in den Wurzeln aller getesteten Individuen der verschiedenen Arabidopsis halleri Populationen signifikant höher als in Arabidopsis thaliana. Des Weiteren konnte in den Experimenten mit AhNAS2 RNAi-Pflanzen gezeigt werden, dass diese erhöhte AhNAS2-Expression und daraus resultierende höhere NA-Gehalte in den Wurzeln zur Hyperakkumulation von Zink beitragen. In Linien mit starkem AhNAS2 RNAi-Effekt wurden im Vergleich zum Wildtyp signifikant höhere Zinkkonzentrationen in den Wurzeln gemessen, wobei im Spross das Gegenteil der Fall war. Das Verhältnis von Sprosszinkgehalt zu Wurzelzinkgehalt ist in einer hyperakkumulierenden Pflanze größer als 1 und lag in der vorliegenden Arbeit in Wildtyppflanzen und Kontroll-RNAi-Linien jeweils über dem Wert 15. In den starken RNAi-Linien konnte dieser Wert einzig durch die Herunterregulierung der AhNAS2-Transkriptmengen unter 4 gesenkt werden. Dieses Ergebnis untermauert die Hypothese, dass Nicotianamin eine wichtige Rolle in der Zinkhyperakkumulation in A. halleri spielt. In Zinklokalisierungsexperimenten mit dem fluoreszenten Farbstoff Zinpyr-1 konnten die in den ICP-OES-Analysen erhaltenen Unterschiede zwischen Wurzelzinkgehalt im Wildtyp und der starken Linie 1-2 mit einem konfokalen Lasermikroskop bestätigt werden. Die höheren Zinkgehalte im Sprossgewebe des Wildtyps waren sowohl im hydroponischen Wachstumsmedium als auch in Experimenten mit artifiziell kontaminierter Erde und unter fast natürlichen Bedingungen mit kontaminierter Erde von nativen A. halleri Standorten im Harz konsistent. Analysen zur Speziierung und Zinkverteilung zeigten, dass in den Wurzeln von A. halleri Zink-Nicotianamin-Komplexe gebildet werden, welche die Xylembeladung erleichtern. Diese Entdeckung besitzt hohe Relevanz für die Entwicklung von Biofortifikationsanwendungen. In Toleranzexperimenten konnte gezeigt werden, dass Cadmiumkonzentrationen bis 2 µM im hydroponischen Wachstumsmedium keine toxischen Effekte, weder auf A. halleri Wildtyp- noch auf AhNAS2 RNAi-Pflanzen hatten. Im Gegensatz dazu bildeten alle getesteten Linien nach Zugabe von 10 µM Cd2+ bzw. 5 µM Ni2+ zum Medium starke Chlorosen aus. Die Wurzellängen der getesteten Linien unterschieden sich nach Cadmiumzugabe nicht, während das Wurzellängenwachstum in Gegenwart von zusätzlichem Ni2+ in den starken RNAi-Linien verglichen mit dem Wildtyp signifikant reduziert war. Unter den getesteten Konzentrationen zeigte sich somit die Verbindung von NA zur Nickeltoleranz, nicht jedoch zur Cadmiumtoleranz. Des Weiteren wurden hydroponische Toxizitätsexperimente mit einer externen Zinkkonzentration von 300 µM durchgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollbedingungen führte dieser erhebliche Zinküberschuss zu einem deutlich verbesserten Sprosswachstum aller Pflanzen, wobei keine der getesteten Linien Toxizitätssymptome aufwies. In Microarrayanalysen konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der NA-Gehalte in A. halleri Wurzeln keine Sekundäreffekte auf andere Metallhomöostasegene zur Folge hat. Nur wenige Gene waren verglichen mit dem Wildtyp in der starken RNAi-Linie induziert, wobei ein für ein “defensin-like protein“ codierendes und eines, welches für die Bildung eines “dual specificity protein“ verantwortlich ist, sowohl unter Kontrollbedingungen als auch nach Zinkbehandlung mindestens vierfach hochreguliert waren. Zusammenfassend kann angemerkt werden, dass mit NAS2 der zweite wichtige Zinkhyperakkumulationsfaktor neben HMA4 (Hanikenne et al., 2008) identifiziert werden konnte.

Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen (2012)

Stephanie Hoffmann-Thoms

Für die Infektion von E. coli Zellen benötigt der filamentöse Phage fd sein aus drei Domänen bestehendes Gen-3-Protein (G3P). Die C-terminale Domäne verankert das G3P in der Phagenhülle, die N-terminalen Domänen N1 und N2 vermitteln die initialen Schritte der Infektion. Im Ruhezustand des Phagen liegen N1 und N2 in assoziierter Form vor, wodurch die Bindungsfläche auf der N1-Domäne für den sekundären Rezeptor, die C-terminale Domäne von TolA, blockiert wird. Zur Aktivierung des G3P interagiert der Phage über seine N2-Domäne mit dem F-Pilus der Wirtszelle wodurch die für die Assoziation der Domänen wichtige Gelenkregion entfaltet und das dort befindliche Pro213 in die trans-Konformation übergeht. Die Lebenszeit des aktiven Zustandes wird limitiert durch die Reisomerisierung von Pro213, die jedoch sehr langsam abläuft. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Bereiche für die Population des offenen bzw. geschlossenen Zustandes und damit die Funktionalität des G3P wichtig sind. Über die Analyse des Faltungsmechanismus des Wildtyp G3P, sowie der Stabilität und Struktur seines Intermediates mittels NMR-Spektroskopie, konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in der aktiven Form komplett entfaltet vorliegt. In der Variante G3P IIHY, die unter anderem in der Gelenkregion zwei stabilisierende Substitutionen enthält, sind dagegen die Domänen im Intermediatszustand noch lose miteinander assoziiert. Die Unterschiede in der Stärke der Domänenassoziation beeinflussen die Wechselwirkung der entsprechenden G3P-Varianten mit TolAC, was in vitro anhand von Bindungsexperimenten nachgewiesen werden konnte. Sowohl im aktiven Intermediat, als auch in der nativen Form führen stabilisierende Austausche zu einer deutlichen Verschlechterung der Interaktionsfähigkeit des G3P mit TolAC. Dies wurde zusätzlich durch Infektionsexperimente sowohl mit pilusfreien, als auch mit pilushaltigen Zellen bestätigt. Die Analyse der Stabilität und des Faltungsmechanismus der P213G-Variante des fd G3P zeigt, dass auch Pro213 die Stabilität des inaktiven Ruhezustandes und damit die Lebensdauer der aktiven Form beeinflusst. Aufgrund des Verlustes des Prolinschalters liegt das entsprechende G3P P213G zum großen Teil in nicht assoziierter und damit instabiler Form vor. Durch den Austausch der beiden zu Pro213 benachbarten Reste sind die N-terminalen Domänen ebenfalls fast vollständig unabhängig voneinander, was unter anderem auf die beschleunigte Isomerisierung an Pro213 zurückgeführt werden kann. Um zu analysieren, welche Bereiche des G3P an der Weiterleitung des Signals der Bindung von N2 an den Pilus beteiligt sind, wurden verschiedene Substitutionsvarianten hergestellt, thermodynamisch charakterisiert und die Infektiositäten der entsprechenden Phagenvarianten untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erste Schleife der N1-Domäne, die sich in der Interaktionsfläche zur N2-Domäne befindet, eine wichtige Rolle spielt. Nach Ersatz durch eine kürzere Schleife liegen N1 und N2 fast vollständig dissoziiert vor, wie unter anderem aus der Analyse der Affinität gegenüber TolAC sowohl in vitro als auch in vivo hervorgeht. Während der Aktivierung müssen im Umkehrschluss auch die Wechselwirkungen zwischen der Schleifenregion von N1 und N2 gelöst werden. Aufgrund der hohen Stabilität seines G3P im Ruhezustand wird der fd Phage als Grundlage des PROSIDE-Selektionsverfahrens verwendet, um stabilisierte Proteinvarianten zu erhalten. Für das Gb1-Protein aus Streptococcus sp. wurden darüber unter anderem vier stark stabilisierende hydrophobe Austausche identifiziert, die in der Variante Gb1-M2 kombiniert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität dieser hyperstabilen Variante näher analysiert. Die relativ zum WT-Gb1 deutlich erhöhte Stabilität von Gb1-M2 ist dabei zum Teil durch deren Dimerisierung bedingt. Die Kristallstruktur des Proteins zeigt, dass die Assoziation der Monomere über die Ausbildung eines intermolekularen b-Faltblattes und eine hydrophobe Interaktionsfläche vermittelt wird. Der Kern dieser Assoziationsfläche wird durch Leucinreste an den Positionen 16 und 37 gebildet. Die Untersuchung weiterer Varianten hat gezeigt, dass die Kombination von hydrophoben Resten an diesen Positionen zur Dimersierung führt. Um den Beitrag der Austausche zur konformationellen Stabilität des Monomers von Gb1-M2 zu bestimmen, wurde dessen Faltungsmechanismus mittels Einzel- und Doppelmischexperimenten analysiert. Die Faltung des Monomers konnte dabei von der Einstellung des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes getrennt und seine Stabilität bestimmt werden. Diese ist gegenüber dem WT-Gb1 deutlich erhöht. Eine solche kinetische Analyse kann allgemein für oligomere Proteine verwendet werden, um die Stabilität ihrer monomeren Form zu ermitteln. Voraussetzung ist, dass, wie in Gb1-M2, die Faltung des Monomers schneller abläuft als die Einstellung des Monomer-Oligomer-Gleichgewichtes.

Mapping-basierte Modellierung von Softwareproduktlinien (2012)

Felix Schwägerl

Die modellgetriebene Softwareentwicklung erlaubt die Beschreibung von Softwaresystemen auf höherem Abstraktionsgrad. Neben der Dokumentation dienen Modelle der automatisierten Generierung von Quelltext in einer höheren Programmiersprache. Auf Programmiersprachen-Ebene erlauben Konstrukte wie Vererbung oder Typparametrisierung die Wiederverwendung im Kleinen. Adäquate Konstrukte stehen auf Modell-Ebene zur Verfügung. Softwareproduktlinien beschreiben Gemeinsamkeiten und Unterschiede verwandter Software. Durch sie kann Wiederverwendung im Großen betrieben werden, um aus einer gemeinsamen Basis ähnliche Produkte zu erzeugen. Einzelne Produkte unterscheiden sich in der Implementierung spezifischer Softwaremerkmale, die in einem Featuremodell festgehalten werden. Featurekonfigurationen beschreiben hingegen deren Ausprägung je Produkt. Die Kombination des Softwareproduktlinien-Ansatzes mit der modellgetriebenen Entwicklung ist keine neue Idee. Produkte werden hierbei durch Modelle repräsentiert. In dieser Arbeit wird der Sonderfall der negativen Variabilität betrachtet: Ein Multivarianten-Domänenmodell beinhaltet sämtliche Artefakte, die in Mitgliedern der Produktfamilie obligatorisch oder optional enthalten sein können. Ein Produkt entsteht durch das Löschen derjenigen Modell-Elemente, die nicht in seiner Konfiguration enthaltenen Features zugeordnet sind. In der vorliegenden Master-Thesis wird ein Ansatz zur Abbildung von Elementen eines Multivarianten-Domänenmodells auf ein Featuremodell vorgestellt. Die Abbildung selbst wird vom Modellierer in einem sog. Mapping-Modell erzeugt. Es erlaubt die Annotation von Domänenmodell-Artefakten mit sog. Feature-Ausdrücken, welche sich wiederum auf das Featuremodell beziehen. Die Auswertung von Feature-Ausdrücken weist einem Mapping einen Selektionszustand zu. Die Arbeit liefert Beiträge in den folgenden vier Bereichen: Konsistenz: Selektionszustände voneinander abhängiger Mappings widersprechen sich unter bestimmten Voraussetzungen. Die hierbei entstehenden Inkonsistenzen werden nicht nur erkannt; in dieser Thesis ausgearbeitete Strategien wie die Propagation oder Surrogate erlauben die automatische Reparatur derselben. Für die Formulierung domänenspezifischer Abhängigkeitsbedingungen ist eine eigene Sprache vorgesehen. Synchronität: Feature- und Domänenmodell unterliegen einer kontinuierlichen Evolution. Durch sie können existierende Mappings ungültig werden. Gegenstand eines ausgearbeiteten Konzepts ist die weitestgehend automatische Synchronisation der Modelle, wobei ein möglicher Informationsverlust minimiert wird. Agilität: Die modellgetriebene Entwicklung von Softwareproduktlinien erfolgt nicht ausschließlich plangetrieben. Man will etwa produktspezifische Änderungen an einem existierenden Mapping-Modell vornehmen. Die eingeführten Alternativen-Mappings ermöglichen darüber hinaus eine konzeptionelle Erweiterung durch positive Variabilität. Manifestation der Variabilität: In dieser Thesis wird untersucht, inwieweit sich in Featuremodellen festgehaltene Variabilität auf Produkte niederschlagen kann. Hierbei wird die starre m:n-Beziehung zwischen Features und Domänenmodell-Artefakten aufgelöst, um neue Expressionsmittel wie Attribut-Constraints zur Verfügung zu stellen. In einem vorbereitenden Abschnitt werden die erwähnten Aspekte zunächst theoretisch untersucht. Anschließend wird mit F2DMM eine Modellierungsumgebung für Softwareproduktlinien vorgestellt. Schließlich erfolgt eine Evaluierung anhand eines konstruierten Beispiels sowie eine Abgrenzung zu verwandten Ansätzen.

Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen (2012)

Kristina Spieß

Spinnenseide stellt aufgrund ihrer mechanischen und chemischen Eigenschaften ein faszinierendes Protein-basiertes Material mit Potential für vielfältige Anwendung in technischen und biomedizinischen Bereichen dar. Rekombinant hergestellte Spinnenseidenproteine können neben der natürlichen Assemblierungsform des Fadens zu diversen Morphologien, wie Vliesen, Mikropartikeln, Kapseln oder Filmen verarbeitet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Filme aus dem rekombinant produzierten Protein eADF4(C16) umfassend charakterisiert. eADF4(C16)leitet sich von der repetitiven Kerndomäne des Proteins ADF4 ab, welches ein Hauptbestandteil der sog. dragline Seide der Europäischen Gartenkreuzspinne Araneus diadematus ist. Der Einfluss verschiedener Prozessparameter auf bestimmte Eigenschaften des resultierenden Films wurde systematisch untersucht. Die Variablen umfassten dabei die Wahl des Lösungsmittels zum Gießen des Films (Hexafluoroisopropanol, Ameinsensäure sowie ein wässriger Puffer), die Art der Nachbehandlung (Methanol bzw. Ethanol sowie Kaliumphosphatlösung), sowie die relative Luftfeuchtigkeit. Alle Parameter zeigten dabei einen Einfluss auf die Sekundärstruktur der Proteine im Film. Zusätzlich wurden die thermische, chemische und mechanische Stabilität der Filme sowie ihre Oberflächeneigenschaften analysiert. Während sich alle untersuchten Filme kaum in ihrer thermischen Stabilität unterschieden, zeigte sich ein deutlicher Einfluss des verwendeten Lösungsmittels und der Nachbehandlung auf das mechanische Verhalten der Filme unter linearer Zugbelastung. Chemische und mechanische Eigenschaften konnten mit der Sekundärstruktur-Zusammensetzung korreliert werden. Aus Zugversuchen, DMA sowie einer Kombination aus linearer Zugbelastung und gleichzeitiger FTIR-Analyse konnte geschlossen werden, dass das verwendete Lösungsmittel nicht nur die Zusammensetzung der Sekundärstruktur beeinflusst, sondern auch die Vernetzung/Anordnung der einzelnen Strukturelemente. Dieser Einfluss überdauerte auch die Nachbehandlung der Filme. Alle untersuchten Nachbehandlungsarten führten zu einer Erhöhung des beta-Faltblattanteils. Allerdings konnte ein Effekt der gewählten Methode auf die Oberflächenbeschaffenheit der nachbehandelten Filme festgestellt werden: Die jeweiligen Filme unterschieden sich sowohl in ihrer Topographie als auch in ihrer Hydrophobizität. Für viele Anwendungen sind zusätzliche Funktionalisierungen vorteilhaft. Hierfür wurde die Methode der post-translationalen chemischen Kopplung gewählt.Um eine chemisch spezifische Reaktionsstelle bereitzustellen, wurden Cystein-Mutanten des Proteins eADF4(C16) hergestellt. Drei verschiedene Proteinvarianten wurden gereinigt und charakterisiert. Die Untersuchung ihrer Sekundärstruktur in Lösung und in assemblierten Filmen ergab keine signifikanten Änderungen im Vergleich zu dem Cystein-freien eADF4(C16). Zusätzlich konnten die Proteine sowohl in Lösung als auch nach Filmbildung in einer spezifischen Reaktion mit hoher Effizienz modifiziert werden. Um die Variabilität der Funktionalisierung zu zeigen, wurde die kovalente Kopplung von Fluorescein, Biotin und Nanogold durchgeführt. Des Weiteren konnte das Enzym Galaktosidase unter Beibehaltung seiner Aktivität immobilisiert werden. Für spätere Zellkulturanalysen wurde zudem eine RGD-Sequenz in Form eines zyklischen Peptids gekoppelt, die eine Integrin-vermittelte Zelladhäsion ermöglicht. Im Hinblick auf potentielle Anwendungen der rekombinanten Spinnenseidenfilme als Beschichtung wurden die Oberflächeneigenschaften der jeweiligen Filme analysiert. Dabei zeigte sich, dass besonders die Benetzbarkeit bzw. Hydrophobizität der Filmoberfläche in Abhängigkeit des verwendeten Substrats variierte. Auf hydrophoben Materialien (Polystyrol und Teflon) wiesen dünne Filme eine hydrophile Oberfläche auf, während Filme auf Glas hydrophobe Eigenschaften zeigten. Gleichzeitig konnten Unterschiede in der Sekundärstruktur der Filme nachgewiesen werden. In Anlehnung an Theorien für Block-Copolymere wurde ein Modell über eine mögliche Anordnung der Strukturelemente in diesen Filmen aufgestellt, um die beobachteten Oberflächeneffekte zu erklären. Natürliche Seidenmaterialien stellen aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und ihrer biologischen Abbaubarkeit auch interessante Kandidaten für biomedizinische Applikationen dar. Daher wurde die biologische Verträglichkeit der rekombinanten Spinnenseidenfilme in vitro untersucht. Erste Ergebnisse ergaben eine gute Verträglichkeit des Materials; so adhärierten Prä-Osteoblasten (MC3T3-E1) auf den Filmen und konnten über mehrere Tage kultiviert werden. Das verwendete Lösungsmittel und die Nachbehandlungsart beeinflussten signifikant das Resultat, was möglicherweise auf die unterschiedliche Oberflächenchemie und -topographie zurückzuführen ist. Während die Adhäsion der Zellen auf nicht-modifizierten Filmen schwach war, konnte diese durch Kopplung der spezifischen Zelladhäsions-Sequenz c(RGDfK)verbessert werden.

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