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Strukturbestimmung des humanen Guanylin-Prohormons zur Analyse der Rolle einer Hormon-Prosequenz und Design eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne der Guanylatzyklase-C
(2003)
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Thomas Lauber
- Die Peptidhormone Guanylin und Uroguanylin sind als spezifische Liganden der intestinalen membrangebundenen Guanylatzyklase-C (GC-C) entscheidend an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushalts im Darm beteiligt. Obwohl die Rolle dieses Guanylin/GC-C Systems bei der durch die hitzestabilen bakteriellen Enterotoxine vermittelten Diarrhöe schon lange bekannt ist, kennt man bis heute keine strukturellen Details der Vorläuferproteine der GC-C-Liganden, der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne der GC-C (GC-CECD) und der Liganden/Rezeptor-Wechselwirkung. Um zum Verständnis der biochemischen Eigenschaften des Guanylin-Prohormons beizutragen sowie den Einfluß der Prosequenz auf die Ausbildung der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Disulfidbrücken zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur von humanem Proguanylin bestimmt. Weiterhin wurde als Grundlage für weiterführende NMR-spektroskopische Untersuchungen der Guanylin/GC-C-Wechselwirkung ein geeignetes Fragment der GC-CECD konstruiert. Um die Strukturbestimmung von Proguanylin zu ermöglichen, wurde zunächst ein effizientes Expressions- und Reinigungsprotokoll entwickelt, das es erlaubte, Proguanylin mit der nativen Disulfidverbrückung und natürlichen biologischen Aktivität in löslicher Form zu gewinnen. Durch den Vergleich mit dem natürlichen, aus menschlichem Hämofiltrat isolierten Prohormon wurden für beide Proteine übereinstimmende biophysikalische Eigenschaften und dreidimensionale Strukturen nachgewiesen. Des Weiteren wurde mittels analytischer Sedimentationsexperimente für beide Proteine eindeutig ein monomerer Assoziationsgrad in Lösung auch bei millimolaren Konzentrationen nachgewiesen und dadurch ein früher postulierter dimerer Zustand widerlegt. Die anschließende Berechnung der dreidimensionalen Struktur von Proguanylin erfolgte durch die Verwendung von 700 aus den NMR Spektren des homogen 15N und 13C/15N markierten rekombinanten sowie des natürlichen Proteins abgeleiteten experimentellen Randbedingungen. Die Struktur von Proguanylin in Lösung stellt einen neuen Proteinfaltungstyp dar und weist drei zu einem Bündel zusammengelagerte alpha-Helices, ein kurzes, dreisträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt sowie einen 23 Aminosäuren umfassenden unstrukturierten Bereich auf. Da das Faltblatt durch zwei N-terminale und einen C-terminalen Strang gebildet wird, kommt es zu einer unmittelbaren Nachbarschaft der Termini. Dabei wird die Hormonregion (Reste 80-94) von Proguanylin unter anderem durch die Wechselwirkungen mit dem N-terminalen Faltblattstrang in einer Guanylin A-Isomer ähnlichen Topologie stabilisiert. Diese Kontakte bewirken außerdem eine teilweise Abschirmung der ansonsten im freien Hormon zugänglichen Oberfläche und können daher die äußerst geringe Affinität bezüglich der GC-C und die damit verbundene vernachlässigbare Aktivität von Proguanylin erklären. Eine beobachtete Wechselwirkung zwischen der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Seitenkette von Tyr88 mit Arg72 leistet einen zusätzlichen Beitrag zur Inaktivierung der Hormonregion. Die Wechselwirkungen zwischen den terminalen Bereichen in der Proguanylin-Struktur scheinen außerdem für die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung essentiell zu sein. Eine Bestätigung dieser Annahmen wurde aus der Analyse von Proguanylin-Mutanten erhalten, die eine strukturstabilisierende Funktion der Disulfidbrücke C48-C61 nahelegt und für einen direkten Einfluß der Prosequenz auf die Struktur der Hormonregion spricht. Basierend auf einer weiteren Mutante konnte außerdem für das homologe Uroguanylin-Prohormon ein Strukturmodell erstellt werden. Für die GC-CECD wurde ein Strukturmodell erstellt, mit dessen Hilfe die Ligandenbindungsregion auf die direkte Umgebung eines exponierten und zugänglichen Faltblattstrangs kartiert werden konnte. Daher wurde für die Wechselwirkung zwischen Guanylin und der GC-CECD ein zu den intramolekularen Kontakten zwischen Guanylin und der Prosequenz ähnliches Interaktionsmotiv postuliert. Aufgrund der Größe und des Oligomerzustandes ist die GC-CECD nicht für NMR-spektroskopische Untersuchungen zur detaillierten Charakterisierung der Wechselwirkung dieses Rezeptors mit seinen Liganden geeignet. Daher wurde ein kleineres, lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung fähiges Rezeptorfragment benötigt, das in Form der als miniGC-C bezeichneten membrannahen Subdomäne der GC-CECD konstruiert wurde. Dieses Fragment erfüllt die gewünschten Anforderungen und ist zur hoch affinen Bindung des Liganden STp-(5-17) in der Lage. Zur Untersuchung des zugehörigen Komplexes stellt das entwickelte Expressions- und Reinigungssystem zur Gewinnung von rekombinantem Proguanylin gleichzeitig die Grundlage für die Herstellung von homogen 15N und 13C/15N markiertem Guanylin dar, welches für zukünftige NMR-spektroskopische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Guanylin und der GC-C benötigt wird.
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Kinetik der Vesikelbildung in katanionischen Tensidsystemen
(2003)
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Stefan Schmölzer
- Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Untersuchung der Kinetik der Vesikel-bildung in katanionischen Tensidsystemen. Ein wesentlicher Aspekt dabei war der Vergleich von einfachen Mischungen von anionischen mit kationischen Tensiden, bei welchen die Tenside als Salze vorlagen, mit katanionischen Amphiphilen, bei welchen als Gegenionen Protonen und OH- Ionen vorlagen. Zur allgemeinen Beschreibung der katanionischen Tensidmischungen kann das Pseudophasenseparationsmodell verwendet werden. Bei diesem Modell wird der Wechselwirkungsparameter eingeführt, da es sich bei den katanionischen Tensidmischungen nicht um ideale Mischungen handelt. Aufgrund der entgegengesetzten Ladung der einzelnen Spezies ergibt sich zwangsläufig ein starker Synergieeffekt. Aus experimentellen Daten konnte nun der Wechselwirkungsparameter für die Systeme TTAB/SL und TTAB/SC bestimmt werden, welche in gutem Einklang mit den Literaturwerten vergleichbarer katanionischer Systeme stehen. Dieser starke Synergieeffekt spiegelt sich nun in dem reichen Phasenverhalten der katanionischen Tensidmischungen wider. In dieser Arbeit wurden eine Vielzahl von katanionischen Systemen untersucht. Bei den Mischungen der Alkyltrimethylammonium-bromide mit den Natriumsalzen der Laurin- bzw. Caprinsäure zeigte sich bei konstanter Gesamtkonzentration immer ein identischer Phasenverlauf. Ausgehend von einer mizellaren Lösung, z. B. der anionischen Komponente, gelangt man bei Erhöhung des Anteils an kationischem Tensid über ein Zweiphasengebiet in die vesikuläre Phase im Bereich der Äquimolarität. In diesen salzhaltigen Systemen kommt es fast immer bei exakt äquimolarer Zusammensetzung bei Raumtemperatur zur Präzipitatbildung. Unterschiede in der absoluten Lage der Phasengrenzen sind bei unterschiedlicher Kettenlänge der Tenside festzustellen, dabei kann auch die Präzipitatbildung bei Raumtemperatur unterdrückt werden. In den salzfreien Systemen ist die Ladung der Vesikel nicht abgeschirmt und es kommt nicht zur Kondensation der Vesikelphase. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich nun mit der Untersuchung der Kinetik der Vesikelbildung der beschriebenen katanionischen Systeme. Diese wurde mit Hilfe von Stopped Flow Messungen mit unterschiedlichen Detektionsmethoden verfolgt. Es konnte festgestellt werden, dass es sich bei der Vesikelbildung um einen mehrstufigen Prozess handelt. Bei den salzhaltigen Mischungen zeigte sich, dass die Bildungsgeschwindigkeit der Vesikel stark abhängig von der Gesamtkonzentration ist und bei hoher Konzentration (> 100 mM) mitunter schon an der Auflösungsgrenze der Stopped Flow Methode liegt. Die Bildung von Mischmizellen als Vorstufen zu den Vesikeln konnte nicht explizit nachgewiesen werden. Die Aufladung, durch unterschiedliches Mischungsverhältnis von anionischem zu kationischem Tensid, zeigt keinen Einfluß auf die eigentliche Bildungsgeschwindigkeit der Vesikel. Im Zuge von Stopped Flow Messungen mit Detektion der Transmission wurde festgestellt, dass es im weiteren zeitlichen Verlauf zu einem Größenwachstum der Vesikel und zur Abnahme der Polydispersität kommt. Darüber hinaus ist bei den äquimolaren Mischungen schon die Tendenz zur Präzipitatbildung nach mehreren Minuten zu verzeichnen. Die makroskopische Auftrennung der Phasen bis zum Erreichen des thermodynamisch stabilen Endzustandes kann hier jedoch mehrere Stunden dauern. Der Einfluß der Temperatur auf die Kinetik der Vesikelbildung konnte am System TTAB/SC nachgewiesen werden. Solange man sich bei Temperaturänderung in der gleichen Phase befindet, so ändern sich die Zeitkonstanten allgemein nach der Arrhenius´schen Gleichung. Ist jedoch mit der Temperatur ein Phasenübergang innerhalb der Vesikelphase verbunden, so zeigt auch die Kinetik dementsprechend einen Knickpunkt im Verlauf der Zeitkonstanten mit der Temperatur. Im Vergleich zu den salzhaltigen Systemen wurden auch die katanionischen Ionenpaar Amphiphile hinsichtlich der Bildungskinetik der Vesikel untersucht. Mit Hilfe von zeitaufgelösten SAXS Messungen konnte an diesen Systemen eindeutig das Vorhandensein von Mischmizellen zu Beginn der Vesikelbildung nachgewiesen werden. Diese Misch-mizellen, welche einen schalen- oder scheibchenförmigen Charakter haben, lagern sich innerhalb von 500 ms in einem weitaus langsameren Prozess zu unilamellaren Vesikeln um. Diese wachsen mit einer Zeitkonstanten von 20 – 30 s an, wobei die Größenverteilung monodisperser wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, daß die Vesikelbildung nicht nur auf das Vorhandensein von Scherkräften zurückzuführen ist, sondern es durchaus in bestimmten Systemen sich bei der Bildung von Vesikeln um einen reinen Selbstaggregations-prozess handelt. Der kinetische Ablauf der Vesikelbildung wird dabei zu einem stark durch die Elektrostatik des Systems gesteuert. Zum anderen spielt der letztlich stabile Endzustand des Systems eine wesentliche Rolle für den zeitlichen Verlauf der Phasenbildung.
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Entwicklung transgenbasierter Systeme zur Anwendung im Rahmen der Sterilen Insekten Technik, einer ökologisch verträglichen Schädlingsbekämpfungsmethode
(2003)
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Carsten Horn
- Biologische Strategien zur Bekämpfung ökonomisch relevanter Schadinsekten bieten sich als Alternative zur insektizidbasierten Kontrolle an. Die Sterile Insekten Technik (SIT) ist eine ökologisch verträgliche Methode zur flächendeckenden Populationskontrolle. Sie beruht auf dem Prinzip der Reduktion einer Schädlingspopulation durch wiederholte Massenfreisetzungen steriler Artgenossen. Für viele Schadinsekten ist SIT am wirksamsten, wenn ausschließlich sterile Männchen freigesetzt werden. Zur Sterilisierung wird konventionell ionisierende Strahlung eingesetzt, welche die Fitness behandelter Insekten und damit die Wirksamkeit der SIT vermindert. Diese Arbeit dokumentiert die Etablierung eines Sterilisierungssystems, das Transgene anstelle ionisierender Strahlung verwendet. Das neuartige Sterilitätskonzept beruht auf supprimier-barer Induktion embryospezifischer Letalität. Um dieses Konzept im Modellinsekt Drosophila melanogaster zu realisieren, wurden 5’ genregulatorische Regionen der Zellularisierungsgene serendipity alpha (sry alpha) und nullo ausgewählt, die ausschließlich in einem engen Zeitfenster während der frühen Embryonalentwicklung aktiv sind. Diese Regulatorsequenzen steuern die Genexpression des tetracyclinkontrollierten Transaktivators tTA. Zur Erzeugung von Letalität stimuliert tTA die Expression eines hyperaktiven Allels des proapoptotischen Gens head involution defective (hid). Da die DNA-Bindung des tTA-Proteins durch Tetracyclin (Tc) inhibiert wird, kann tTA als Schalter zwischen restriktiven und permissiven Bedingungen fungieren: In Drosophila-Embryonen, die eine einfache Kopie der Transgenkombination erbten, manifestierte sich unter restriktiven Bedingungen (ohne Tc) die Letalität mit einer Penetranz von 99,9%. Unter permissiven Bedingungen hingegen (mit Tc) konnte embryonale Letalität supprimiert werden, was die kontinuierliche Produktion großer Mengen steriler Insekten ermöglicht. Mit sterilen Männchen wurden SIT-Situationen im kleinen Labormaßstab simuliert. Dabei zeigte sich, daß sterile Männchen wirksam mit fertilen Männchen um Weibchen konkurrierten und die Nachkommenzahl reduzierten. Um homologieunabhängig embryo- oder geschlechtsspezifisch aktive Enhancer in Schadinsekten identifizieren zu können, wurde in dieser Arbeit außerdem ein System zum Aufspüren von Enhanceraktivitäten etabliert. Dieses System beruht auf der kontrollierten Mobilisierung von „Mutatoren“, die auf dem Transposon piggyBac basieren und deren Reporterfunktion erfolgreich zum Nachweis von Enhanceraktivitäten eingesetzt werden konnte. Diese piggyBac-Mutatoren erwiesen sich in Drosophila melanogaster als effizient mobilisierbar und erzeugten homozygot letale Mutationen mit einer Frequenz von 7,6%. Das System besitzt somit Anwendungspotential zur funktionellen Insekten-Genomanalyse. Beide Systeme sind in ein Keimbahntransformationssystem eingebettet, das auf speziesunabhängig funktionierenden Breitband-Transposons und separierbaren Transformations-markern basiert. Diese Systeme sollten daher direkt auf Schadinsekten übertragen und auf ihre Funktionalität überprüft werden können.
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Flavonoidinduzierte phänotypische Plastizität in der Flügelfärbung des Bläulings Polyommatus icarus (Lepidoptera: Lycaenidae) und ihre Bedeutung für Partnerwahl und Arterkennung
(2003)
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Helge Knüttel
- Ich berichte über den ersten bekannten Fall, bei dem sequestrierte sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe das äußere Erscheinungsbild eines Insekts im ultravioletten (UV) Spektralbereich verändern und dadurch die visuell vermittelte Partnerwahl beeinflussen. In jüngerer Zeit wurden zunehmend Daten verfügbar, die zeigen, daß die Larven des Gemeinen Bläulings Polyommatus icarus in Abhängigkeit von der Art und dem Organ der Futterpflanze spezifisch Flavonoide unterschiedlicher Typen und Mengen sequestrieren. Während der späten Puppenentwicklung wird der Großteil der Flavonoide in die Flügel eingelagert. Bisher war nicht bekannt, ob die UV-Licht absorbierenden Flavonoide auch als Flügelpigmente wirken und die visuelle Erscheinung verändern. In umfangreichen Zuchtexperimenten zog ich Raupen von P. icarus auf fünf künstlichen Diäten auf, die sich nur im Flavonoidgehalt unterschieden, sowie auf natürlichem Futter (Blüten und Blätter von Pflanzenarten aus fünf Gattungen). Mit UV-Photographie und Spektroradiometrie konnte ich zeigen, daß die Mengen und Zusammensetzungen der Flavonoide in der Larvennahrung die Flügelmuster der resultierenden Falter im UV bestimmen. Die mittlere Reflexion weißer Flügelbereiche im UV- und im Violett-Bereich korrelierte negativ mit der sequestrierten Flavonoidmenge. Die hohe gefundene Variabilität der Flügelfärbung wurde dabei vor allem durch die unterschiedlichen Flavonoidgehalte des Futters verursacht, aber auch durch individuelle, physiologische Unterschiede der Tiere. In Labor- und Freilandverhaltensversuchen bevorzugten männliche Schmetterlinge klar flavonoidreiche, UV-absorbierende Weibchenattrappen. Diese Präferenz im Nahbereich wird visuell durch das UV-Muster der Flügel vermittelt. Verschiedene Teile und Arten von Futterpflanzen unterscheiden sich im Wert als Futterquelle, so daß ultraviolette Flügelmuster möglicherweise die Qualität eines potentiellen Paarungspartners signalisieren könnten, aber sicher kein artspezifisches Merkmal sind. Ich untersuchte weiterhin die sensorischen Eigenschaften der Männchen, das heißt der primären Empfänger visueller Signale in diesem Verhaltenskontext. Unter Verwendung der leuchtenden Pseudopupille bestimmte ich das Sehfeld sowie die Ommatidiendivergenzwinkel DeltaPhi über einen Großteil des Auges. Der Überlappungsbereich der Sehfelder war verhältnismäßig klein, das Sehfeld allerdings recht groß und wurde meist durch den eigenen Körper begrenzt. P. icarus besitzt ein Muster der Ommatidiendivergenzwinkel, wie es als typische Anpassung an den Vorwärtsflug gedeutet wird (forward flight pattern). DeltaPhi in vertikaler Richtung war über einen großen Teil des fronto-ventralen Auges kleiner als 1,0° und reichte bis auf 0,7° herunter. Es kann daher erwartet werden, daß Männchen das Fleckenmuster der Flügelunterseiten aus Entfernungen von 14-41 mm optisch auflösen können. Dies ist genau der Bereich, in dem die Männchen eine Präferenz für flavonoidreiche Weibchenattrappen zeigten. Ich diskutiere die Verwendung von Hauptkomponentenanalysen zur Untersuchung von Spektraldaten im Kontext der visuellen Kommunikation. Ich schlage die alternative Verwendung von Konfidenzintervallen gemittelter Spektren als eine neue, einfach anzuwendende statistische Methode für den Vergleich von Gruppen von Spektren unabhängig von Annahmen über das visuelle System der Empfänger vor. Zusätzlich können diese benutzt werden, um abgeleiteten Maßen für Farbe Konfidenzintervalle zu verleihen, wie etwa dem Quantenfang von Photorezeptoren.
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Synthese und Charakterisierung von ternären Halogeniden und Oxidhalogeniden der Übergangsmetalle
(2003)
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Sabina Hartwig
- Hauptziel dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung neuer Enneahalogenodimetallate der Übergangsmetalle Titan, Vanadium und Chrom. Mit Hilfe der so erhaltenen Daten war es möglich, Untersuchungen an Systemen mit repulsiven Metall-Metall-Wechselwirkungen durchzuführen und diese mit Systemen mit attraktiven Wechselwirkungen zu vergleichen. Dabei konnten mit Cs3Ti2I9, Cs3V2I9 und Rb3Cr2I9 drei neue A3M2X9-Verbindungen in einkristalliner Form dargestellt und mittels Röntgen-strukturanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, von acht weiteren A3M2X9-Verbindungen mit A = K, Rb, Cs, M = Ti, V, Cr und X = Cl, Br, I für die Röntgenstrukturanalyse geeignete Einkristalle zu züchten. Damit konnte der zur Verfügung stehende Datensatz exakter struktureller Parameter im Bereich der Systeme mit repulsiven Metall-Metall-Wechselwirkungen an wichtigen Stellen ergänzt werden. Mit Hilfe dieser Daten wurden, Tendenzen und Gesetzmäßigkeiten bezüglich der Geometrie der Doppeloktaedereinheit innerhalb der Gruppen mit bindenden bzw. nichtbindenden Metall-Metall-Wechselwirkungen herausgearbeitet. Im zweiten Schritt wurden diese miteinander verglichen und prinzipielle bzw. graduelle Unterschiede aufgezeigt. Zunächst konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der geometrischen Parameter des M2X9-Doppeloktaeders Systeme mit bindenden und nichtbindenden Metall-Metall-Wechselwirkungen qualitativ unterschieden werden können. Dazu eignen sich in erster Linie der Winkel beta (M-Xb-M) und der Wert für d´/d´´, während die Aussagekraft des Winkels alpha aufgrund der nur sehr geringen Unterschiede zwischen bindenden und nichtbindenden Verbindungen gering bleibt. Der Nachteil bei Verwendung dieser Parameter besteht allerdings darin, dass sie eine Abhängigkeit von der die Übergangsmetallatome umgebenden Matrix zeigen. Mit der Einführung der Parameter k1 (Verhältnis des mittleren M-X-Abstandes zum M-M-Abstand), k2 (Verhältnis M-Xt / M-Xb), k3 (Verhältnis Xb-Xb / Xt-Xt) und k4 (Verhältnis Höhe des Doppeloktaeders zum mittleren X-X-Abstand) wurden, die Metall-Metall-Wechselwirkungen halogen- bzw. alkalimetallunabhängig betrachtet. Quantitative Aussagen lässt allerdings nur k3 zu, mit dem zumindest in bindenden Systemen, die Stärke der Metall-Metall-Wechselwirkung abgeschätzt werden kann, während die k3-Werte bei den nichtbindenden Enneahalogenodimetallaten sehr eng zusammen liegen und eine Quantifizierung nicht sinnvoll ist. Die Parameter k1, k2 und k4 liefern „halbquantitative“ Trends, die eine Unterscheidung bindend / nichtbindend ermöglichen. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass quantitative Aussagen über die Stärke von Metall-Metall-Bindungen allein anhand dieser geometrischen Betrachtungsweise nur sehr bedingt möglich sind, während eine qualitative Unterscheidung sehr zuverlässig ist. Zur weiteren Charakterisierung der synthetisierten Enneahalogenodimetallate wurden zunächst phasenreine Proben dargestellt und IR-, Raman- sowie UV-Vis-spektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Spektren wurden durch Vergleich mit der Literatur bzw. anhand von theoretischen Berechnungen ausgewertet und den IR- bzw. Raman-Banden die entsprechenden Schwingungen sowie den UV-Vis-Banden die zugehörigen elektronischen Absorptionen zugeordnet werden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von Übergangsmetalloxidhalogeniden. Dabei wurden mit NbO2I und NbOI3 zwei neue ternäre und mit KWOI4 bzw. RbWOI4 zwei neue quarternäre Verbindungen in einkristalliner Form dargestellt und röntgenographisch charakterisiert. NbO2I kristallisiert in einem völlig neuen Strukturtyp. Dieser lässt sich nahtlos in die Struktursystematik der Oxidhalogenide einreihen. Dabei liegen Schichten vor, in denen Oktaeder über Spitzen zu Ketten und diese über Kanten zu Schichten verknüpft sind. Jeweils zwei dieser Schichten sind wiederum um eine halbe Kantenlänge gegeneinander verschoben und bilden so isolierte Doppelschichten, in denen eine Kante jedes Oktaeders durch ein Sauerstoffatom der Nachbarschicht überkappt ist Das Niob besitzt dabei die ungewöhnliche Koordinationszahl sieben. Im neuen Strukturtyp des NbOI3 stellen, wie auch im NbOCl3-Typ, Doppelstränge aus über Sauerstoffatomen verknüpften Nb2O4I6-Doppeloktaedern das strukturbestimmende Motiv dar. Die Doppelstränge liegen im NbOI3 jedoch parallel nebeneinander, während sie im NbOCl3 abwechselnd um 90° gegeneinander verdreht sind. Die Struktur der beiden isotypen quarternären Oxidiodide KWOI4 und RbWOI4 kann als eine Verzerrungs- und Auffüllungsvariante des WOCl4-Typs angesehen werden, bei der in den Ketten aus spitzenverknüpften WO2I4-Oktaedern jeweils aufeinanderfolgende Oktaeder um 45° gegeneinander verdreht sind. Die Alkalimetalle sitzen in Lücken zwischen den Ketten.
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Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA
(2002)
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Sabine Schwarz
- In dieser Arbeit wurden drei virale Regulator-Proteine (CAEV-Tat, HK022 Nun und l N (1-53)) und mehrere ihrer nicht-viralen Bindungspartner kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. CAEV-Tat (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus) ist ein Transaktivatorprotein aus einem HIV-verwandten Lentivirus der Ziege. Zur effizienten Expression von CAEV-Tat war es notwendig, einige seltene Codons des tat-Gens gegen die jeweils synonymen, aber in E. coli häufiger verwendeten Codons auszutauschen. Ferner mußte eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (argU) koexprimiert werden, um die für NMR-Spektroskopie nötigen Proteinmengen herstellen zu können. Expression und Reinigung von CAEV-Tat mittels Standardverfahren wie Metallionenaffinitätschromatographie über einen Histidinanhang oder die Expression und Reinigung als GST-Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Daher mußte ein individuell auf CAEV-Tat zugeschnittenes Reinigungsprotokoll etabliert werden. Aufgrund seines hohen pIs von 11 konnte CAEV-Tat über Kationenaustauscher-Chromatographie an CM-Sepharose und anschließende Hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Ausbeuten an Protein ließ sich durch Verwenden von Heparin-Sepharose als Kationenaustauscher-Material noch weiter steigern. CAEV-Tat zeigte in CD- und NMR-Spektren typische Charakteristika eines a-helikalen Proteins. Da CAEV-Tat in Konzentrationen über 400 µM aggregierte und daher nicht für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen, die höher Konzentrationen voraussetzen, geeignet war, wurde eine cysteinfreie Mutante von CAEV-Tat kloniert und nach dem für das Wildtyp-Protein etablierten Protokoll gereinigt. Die Mutante erwies sich als weitaus NMR-tauglicher und zeigte keinerlei Aggregationstendenzen bei Konzentrationen von 1 mM. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß Wildtyp-Protein und cysteinfreie Mutante strukturell identisch sind. Somit steht mit der cysteinfreien Mutante ein für weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignetes Konstrukt zur Verfügung. Für das CAEV-Tat homologe Maedi-Visna-Virus-Tat-Protein war eine Interaktion mit der basischen und der Leucin-Zipper-Domäne der beiden zellulären Transkriptionsfaktoren Jun und Fos postuliert worden (Morse et al., 1999). Für spätere Vergleichsstudien mit CAEV-Tat und Jun / Fos zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit der Beschaffung der entsprechenden Nukleotidsequenzen und der Generierung expressionsfähiger Klone von c-jun, c-fos sowie und fosbZIP bereits wichtige Voraussetzungen für spätere Bindungsstudien mit NMR-Spektroskopie geschaffen. JunbZIP (222-331) konnte bereits erfolgreich als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose gereinigt werden. Nun aus dem lambdoiden Phagen HK022 fungiert bei einer Superinfektion des Wirts mit dem l-Phagen als Terminator der viralen Genexpression. Um spätere Strukturuntersuchungen an diesem System durchführen zu können, mußte zunächst ein auf die E. coli codon usage optimiertes synthetisches Gen für Nun generiert werden. Hierbei erwies sich die Methode nach Kim (1989) als erfolgreich. HK022 konnte mit Ausbeuten von 70 mg/l Kulturmedium über Kationenaustauscher-Chromatographie mit Heparin-Sepharose gereinigt werden. Erste strukturelle Befunde (CD, HSQC-Spektren, Messung des hydrodynamischen Radius) deuten darauf hin, daß es sich bei Nun um ein Protein mit nur gering ausgeprägter Tertiärstruktur handelt. Ein Fragment (1-53) des Antiterminator-Protein N aus dem Phagen l konnte kloniert und als Fusionsprotein mit Ubiquitin exprimiert werden. Die Reinigung erfolgte über Affinitätschromatographie und einen abschließenden RP-HPLC-Schritt nach der Abspaltung des Ubiquitinanteils. l N-Protein liegt in Lösung unstrukturiert vor. Dieser Befund wurde auch für das N(1-53)-Peptid durch CD-Spektroskopie und die Bestimmung des hydrodynamischen Radius erhalten. Bei der Bindung von 15N-N(1-53) an nutboxB-RNA bildet sich ein Komplex, der höchstwahrscheinlich weitgehend die gleiche Struktur wie der Komplex aus N(1-36) und nutboxB-RNA besitzt. Bei Zugabe des Wirtsfaktors NusA aus E. coli zu diesem binären Komplex kommt es auf Seiten von l N (1-53) zu Veränderungen im HSQC-Spektrum, was auf eine spezifische Interaktion zwischen dem längeren l-Peptid und NusA hindeutet. Hiervon sind vor allem die nicht im Komplex mit nutboxB vorliegenden Reste von l N betroffen. Weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen werden klären, inwieweit die nutboxB-RNA an der Interaktion mit NusA beteiligt ist. Mit der Etablierung eines Reinigungsprotokolls für N(1-53) und für E. coli NusA konnten wichtige Voraussetzungen hierfür bereits erfüllt werden.
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In vitro-Evolution und Analyse der biophysikalischen Grundlagen der Proteinstabilität
(2003)
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Andreas Martin
- In der vorliegenden Arbeit wurde Proside, ein Selektionssystem für stabilisierte Proteine, weiterentwickelt und dafür genutzt, die molekularen Ursachen erhöhter Proteinstabilität zu analysieren. Für diese in vitro-Evolutionsexperimente diente das Kälteschockprotein Bs-CspB aus Bacillus subtilis als Modellprotein. Zusätzlich wurde das Gen-3-Protein (G3P) des Phagen fd, eine essentielle Komponente von Proside, thermodynamisch charakterisiert und sein Faltungsmechanismus aufgeklärt. Proside basiert auf phage display und verknüpft die thermodynamische Stabilität eines Proteins mit einem sehr gut selektierbaren Parameter, der Infektiosität filamentöser Phagen. Die Größe der selektierbaren Mutantenbibliotheken konnte durch Veränderungen des Phagenkonstrukts und der zu ihrer Erstellung verwendeten molekularbiologischen Methoden auf mehr als 108 Varianten gesteigert werden. Gleichzeitig wurde mit diesen Modifikationen der rekombinationsbedingte Verlust von Gastproteinsequenzen aus dem Phagengenom deutlich reduziert. Das Gen-3-Protein, in welches diese Gastproteine inseriert werden, wurde mittels Proside um mehr als 10 kJ/mol stabilisiert. Somit sind jetzt in vitro-Selektionen bei Temperaturen von bis zu 60 °C möglich, ohne dass die Stabilität der Phagenproteine selbst limitierend für die Optimierung der Gastproteine wirkt. Das Potential der so optimierten Proside-Methode konnte anhand der Selektionen stark stabilisierter Varianten von Bs-Csp gezeigt werden. Dieses Protein unterscheidet sich von seinem um 15,8 kJ/mol stabileren Homologen Bc-Csp aus dem thermophilen Bacillus caldolyticus in 12 von 67 Resten, die alle an der Oberfläche des Proteins liegen. Die in vitro-Selektionen nach Sättigungsmutagenese an sechs dieser zwölf Positionen in Bs-CspB lieferten eine Vielzahl von stabilisierten Mutanten, die, abhängig von den Selektionsbedingungen, unterschiedliche Stabilisierungsprinzipien aufzeigten. Während bei der Selektion in Gegenwart des ionischen Denaturierungsmittels GdmCl vor allem die hydrophoben Wechselwirkungen verbessert wurden, führte die Selektion bei erhöhter Temperatur zusätzlich zur Optimierung der Coulomb´schen Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche. Für die stabilste der selektierten Varianten von Bs-CspB ist der Mittelpunkt des thermischen Entfaltungsübergangs um mehr als 28 Grad relativ zum Wildtypprotein angehoben und liegt damit auch deutlich höher als der Wert des thermostabilen Referenzproteins Bc-Csp. Die Variante unterscheidet sich von Bc-Csp an allen sechs randomisierten Positionen. Dennoch nutzen die beiden Proteine ähnliche Strategien für eine hohe Thermostabilität, insbesondere zeichnen sie sich durch eine im Vergleich zu Bs-CspB optimierte Verteilung der Oberflächenladungen aus. Ladungsnetzwerke auf der Proteinoberfläche sind für die Thermostabilität der Kälteschockproteine sehr wichtig. Basierend auf diesen Erkenntnissen war es möglich, ein hyperstabiles Kälteschockprotein mit lediglich vier Austauschen relativ zu Bs-CspB zu konstruieren. Der Schmelzpunkt dieser Variante liegt bei 85,6 °C, d.h. 31,6 Grad über dem des Wildtypproteins. Sie ist damit sogar stabiler als das homologe Csp aus dem hyperthermophilen Organismus Thermotoga maritima. Die Stabilitätsuntersuchungen des für die Phageninfektion essentiellen N-terminalen Fragments des Gen-3-Proteins reflektieren dessen Aufbau aus den beiden Domänen N1 und N2. Während die Stabilität der Domäne N1 unabhängig von Domäne N2 ist, wird Domäne N2 wesentlich durch die Interdomänenwechselwirkungen mit N1 stabilisiert, und ihre Entfaltung ist mit der Domänendissoziation gekoppelt. Die vier mittels Proside gefundenen Mutationen in G3P stabilisieren beide Domänen unabhängig voneinander und verdeutlichen die generellen Prinzipien, die der Stabilität von Zweidomänenproteinen zugrunde liegen. Neben der Erhöhung der intrinsischen Stabilitäten der individuellen Domänen spielt die Verbesserung der Domäneninteraktionen eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung des gesamten Proteins. Die Rückfaltung von G3P ist ein sequentieller Prozess. Domäne N1 faltet innerhalb weniger Millisekunden, gefolgt von der Faltung der N2-Domäne, die nach etwa 3 min abgeschlossen ist. Im letzten Schritt assoziieren die beiden Domänen in einer extrem langsamen Reaktion. Sie zeigt eine Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) und ist in ihrer Rate limitiert durch die trans-cis-Isomerisierung an Pro213 in der Gelenksubdomäne von N2. Durch die Assoziation von N1 und N2 werden beide Domänen in ihrer Entfaltung gekoppelt, so dass Domäne N1 bis zu 150.000-fach langsamer entfaltet als in isolierter Form. Die Prolin-limitierte sehr langsame Domänenassoziation ist möglicherweise für die Funktion des G3P bei der Infektion von E. coli von Bedeutung. Sie erlaubt es, die Domänen nach Bindung an den F-Pilus so lange dissoziiert zu halten, bis der Pilus zurückgezogen ist und Domäne N1 mit dem Corezeptor TolA an der Zelloberfläche wechselwirken kann.
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Städtetourismus in Regensburg. Images, Motive und Verhaltensweisen von Altstadttouristen
(2003)
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Bert Bödeker
- In den letzten Jahrzehnten verzeichnete der Städtetourismus einen großen Bedeutungsanstieg. Trotzdem liegen nur wenige systematische Studien vor, die zu einem besseren Verständnis städtetouristischer Aspekte beitragen. Die vorliegende Arbeit sollte ein Baustein zur Reduzierung dieser Defizite sein und der Fragestellung nachgehen, welche Angebotsfaktoren, Images und Motive im Städtetourismus existieren, welche Rolle Destinationsmarketing und Reisemedien dabei spielen und wie sich dies im Verhalten der Touristen äußert. Die Wahl des Fallbeispiels fiel auf Regensburg, da die Stadt zu den großen Gewinnern des Städtereise-Booms und den wichtigsten Reisezielen in Bayern gehört. Die empirische Basis dieser Studie beruht auf einer Verknüpfung verschiedenster qualitativer und quantitativer Methoden. Als Rahmen der Erhebungen wurden Statistiken herangezogen, Expertengespräche geführt und Prospekte auf der Internationalen Tourismus Börse ausgewertet. Der Hauptteil der Empirie bestand aus Touristenbefragungen, verfolgenden Beobachtungen (Trackings) und der Inhaltsanalyse von Reisemedien, ergänzt durch eine Kartierung, Passantenzählungen, Busfahrerbefragungen und teilnehmende Beobachtungen bei Stadtführungen. Die Zusammenführung der Einzelergebnisse ergab, dass sich die Touristen auf einen räumlich engen Bereich der Altstadt konzentrieren, der zugleich die größte Dichte an saniertem historischem Baubestand, historischen Sehenswürdigkeiten und Einrichtungen des Einzelhandels sowie der Gastronomie bietet. Diese touristische Altstadt ist über viel benutzte Korridore mit mehreren Großparkplätzen verbunden und wird durch einen kleinen, direkt anschließenden Teil des Haupteinkaufsbereichs ergänzt, der ebenfalls häufig von Touristen frequentiert ist, obwohl er einen geringen historischen Baubestand aufweist. Die Touristen in der Regensburger Altstadt haben kein tieferes Interesse an den kulturhistorischen Sehenswürdigkeiten, sondern suchen überwiegend ein kulturangeregtes Erlebnis, bei dem die Gebäude als ästhetische Kulisse für einen Stadtbummel dienen. Wichtige Elemente dieses Stadtbummels sind die Schaufenster und Geschäfte. Touristen unterscheiden sich beim Bummeln nicht grundlegend von den Einheimischen, sie geben aber kaum Geld im Einzelhandel aus. Im Gegensatz dazu wird beim Besuch gastronomischer Einrichtungen, der fast grundsätzlich zu einem touristischen Aufenthalt in Regensburg gehört, nicht so sehr auf den Geldbeutel geschaut und oft viel Zeit verwendet. Die Touristen in der Regensburger Altstadt zeigen große Verhaltensähnlichkeiten, z.B. bei der Routenwahl. Zugleich lassen sich innerhalb der relativ begrenzten Reiseart des Altstadttourismus aber verschiedene Reisestile unterscheiden. Etwa der Hälfte der Touristen geht es bei dem Besuch hauptsächlich um die Besichtigung. Die andere Hälfte der Touristen will ebenfalls die Altstadt und ihre Sehenswürdigkeiten besichtigen, zeigt aber ein großes Interesse an der Verknüpfung der Besichtigung mit der Nutzung anderer städtischer Angebotsformen wie dem Einzelhandel. Das Bild, das die Regensburg-Touristen von der Stadt haben, ist sehr eng eingebettet in das allgemeine Fremdimage. Trotz der Verwendung desselben Stereotyps sind die Assoziationen der Regensburg-Touristen aber deutlich detaillierter. Die Assoziationen wandeln sich außerdem mit der Anzahl der Aufenthalte in Regensburg weiter und werden durch neue ergänzt. Der grundsätzliche Stereotyp wird dadurch jedoch kaum beeinflusst und erst nach mehrmaligen Aufenthalten nimmt der Anteil individueller Assoziationen, die den öffentlichen Stereotyp ergänzen, merklich zu. Die Nutzung von Informationsmaterialien wie Reiseführer oder Prospekte wiederum beeinflusst die Assoziationen nicht in einem nennenswerten Umfang. Bei der Ermittlung des Images über Rating-Skalen zu vorgegebenen Aussagen über die Stadt zeigt sich noch sehr viel mehr als bei den Assoziationen eine erstaunlich hohe Stabilität der Antworten. Ein Besuch in Regensburg verändert die Einschätzungen nur dahingehend, dass sie mit größerer Sicherheit zum Ausdruck gebracht werden können. Diese Stabilität der zentralen Stereotype bewirkt, dass Touristen am Reiseziel weitgehend das Bild von Regensburg haben, das sie bereits hatten, bevor sie über eine Reise nach Regensburg nachdachten. Auf der Basis der empirischen Ergebnisse wurden verschiedene Aussagen zum Altstadttourismus in Regensburg und Empfehlung für Marketing und Planung formuliert. Die Integration der bislang in der Tourismusforschung kaum angewandten Trackingmethode in die Untersuchung ermöglichte einerseits eine Überprüfung von Befragungs- und Kartierungsergebnissen und erbrachte andererseits zahlreiche Erkenntnisse zum Verhalten von Städtetouristen. Die Trackings erwiesen sich als enorm aufwendige, aber sehr ergiebige Erhebungsmethode, von deren Ausbau wichtige Grundlagenerkenntnisse zum Verhalten von Touristen zu erwarten sind.
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Die Funktion von Three rows bei der Schwesterchromatiden-Trennung in Drosophila melanogaster
(2003)
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Alf Herzig
- In der Mitose werden die Schwesterchromatiden getrennt und auf beide Tochterzellen verteilt. Die Trennung der Schwesterchromatiden erfordert die proteolytische Spaltung des Scc1-Proteins. Scc1 ist Bestandteil des Kohäsin-Komplexes, der die Schwesterchromatiden nach ihrer Entstehung in der S-Phase bis zum Beginn der Anaphase gepaart hält. Die Protease, die durch Scc1-Spaltung die Schwesterchromatiden-Trennung einleitet, heißt Separase. Die Separase wird erst dann aktiviert, wenn alle Chromosomen bipolar mit dem mitotischen Spindelapparat verbunden sind. Die Aktivierung der Separase erfordert die Ubiquitinabhängige Degradation des Securins, einer inhibitorischen Untereinheit der Separase. Weitere Mechanismen der Separase-Regulation sind noch nicht vollständig verstanden. Das Securin von Drosophila melanogaster ist das Protein Pimples (PIM). Die Separase (SSE) von D. melanogaster besitzt zwar eine Protease-Domäne, aber die N-terminale regulatorische Domäne, die in Separasen anderer Eukaryoten gefunden wird, fehlt in SSE fast vollständig. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PIM und SSE einen heterotrimeren Komplex mit dem Protein Three rows (THR) bilden. THR besitzt Bindungsstellen für PIM und SSE. In anderen Organismen besitzt die N-terminale Separase-Domäne Bindungsstellen für das Securin und die Protease-Domäne der Separase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass THR strukturell der N-terminalen Domäne anderer Separasen entspricht. Die Separase aus D. melanogaster scheint demnach aus zwei Untereinheiten aufgebaut zu sein. Während SSE die katalytische Domäne der Separase beinhaltet, wurde hier gezeigt, dass THR eine regulatorische Separase-Untereinheit ist. THR wird nach dem Metaphasen-Anaphasen-Übergang proteolytisch gespalten. Diese Spaltung erfolgt nur in funktionellen Separase-Komplexen, und die Spaltstelle in THR entspricht dem Konsensus einer Separase-Spaltstelle. Mutationen in dieser Spaltstelle unterbinden die THR-Spaltung. Diese Daten legen nahe, dass THR durch die katalytische Untereinheit der Separase gespalten wird. Die Expression von nicht spaltbaren THR-Varianten führt zu frühembryonaler Letalität bei erniedrigter Temperatur. Diese Letalität wird unterdrückt, wenn die katalytische Aktivität der Separase erniedrigt wird. Die Spaltung von THR trägt demnach zur Inaktivierung der Separase bei. Die Spaltung von THR ist vor allem während der Zellularisierung wichtig, einem insektenspezifischen Prozess in der Embryonalentwicklung von D. melanogaster. Während der Zellularisierung führt die ausbleibende Inaktivierung der Separase zu Defekten im Tubulin-Zytoskelett. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Separase in D. melanogaster weitere Substrate neben den Kohäsinen und andere Funktionen als in der Schwesterchromatiden-Trennung hat.
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Bedeutung der Verpaarungsqualität für Verhalten und Gesundheit von Spitzhörnchen (Tupaia belangeri)
(2003)
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Frank Uhl
- Ziel dieser Arbeit war es, Ursachen verschiedener Verpaarungsqualitäten bei Spitzhörnchen und deren Auswirkung auf verschiedene physiologische Parameter zu erfassen. Dazu wurden die Fragestellungen dieser Arbeit in zwei unterschiedlichen Versuchsansätzen bearbeitet. Im ersten wurden Weibchen entweder mit einem harmonischen oder unharmonischen Partner im Versuch eingesetzt, im zweiten wurden die Weibchen je einmal mit einem harmonischen und einem unharmonischen Partner verpaart. Der Versuch bestand aus einer sechswöchigen Verpaarungsphase mit abschließender Trennung der Tiere. Während des Versuchs wurde das Verhalten der Tiere aufgezeichnet und mehrfach Blutproben entnommen. Es konnte gezeigt werden, dass die unharmonische Verpaarung eine Konsequenz aus der Ablehnung des Männchens durch das Weibchen als Sexualpartner ist. Dabei ist die „Sympathie“ oder „Antipathie“ für bestimmte Männchen individuell unterschiedlich und vermutlich genetisch determiniert. Die physiologischen Konsequenzen einer harmonischen bzw. einer unharmonischen Verpaarung waren gegenläufig. So stieg bei harmonisch verpaarten Tieren, Männchen wie Weibchen, die Immunkompetenz an und die Stresshormonkonzentrationen im Serum sanken. Bei unharmonisch verpaarten Tieren verhielt es sich umgekehrt. Die verschiedenen Verpaarungsqualitäten manifestierten sich auch im Verhalten der Tiere. Die Weibchen in unharmonischen Paaren waren unruhig; es kam häufig zu Streit zwischen den Tieren. In harmonischen Paaren waren die Weibchen ruhiger und suchten die Nähe des Partners, es bestand eine enge soziale Bindung zwischen Männchen und Weibchen. Diese enge soziale Bindung führte zu den typischen Effekten von social support. Trennte man die Paare, so gingen die physiologischen Werte von Tieren aus unharmonischen Paaren auf ihre Ausgangswerte zurück. Bei den zuvor harmonisch verpaarten Weibchen jedoch sank die Immunkompetenz unter das Niveau der Ausgangswerte ab, während die Stresshormonkonzentration gegenüber den Ausgangswerten erhöht war. Nach 6 Wochen hatte der größte Teil der Tiere die Ausgangswerte wieder erreicht. Ein Teil der Weibchen begann jedoch sich nach der Trennung selbst zu verstümmeln. Bei diesen Tieren war noch sechs Wochen nach der Trennung, die Immunkompetenz verringert und die Stresshormon-konzentrationen erhöht.
